реагент для определения аденозин-5'-трифосфата

Формула изобретения

1. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,0002-0,02% полибрена и воду.

2. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,5-1,00 мас.% поливинилпирролидона и воду.

3. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 0,02-0,1 мас.% N-фталилхитозана и воду.

4. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий 0,001-0,01 мас.% люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис (оксиметиламинометана), 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминотетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, 10-20 мас.% сахарозы и воду.

5. Реагент по пп.1-4, отличающийся тем, что в качестве люциферазы используют люциферазу, выделенную из клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии, а именно к составу реагента для количественного определения аденозин-5'-трифосфата (АТФ) на основе фермента - люциферазы светляков.

Интенсивность биолюминесценции, которая возникает в реакции люциферина, кислорода и АТФ, катализируемой люциферазой светляков, прямо пропорциональна концентрации АТФ. Данная реакция широко используется в аналитических целях для определения АТФ, а именно в медицине, промышленности и экологии. С использованием реагента для определения аденозин-5'-трифосфата разработаны методики быстрого контроля микробиологической чистоты продуктов питания, пищевого сырья, лекарств, косметических товаров, технологических материалов, воды и напитков. Расчеты показывают, что потребности в определении АТФ для этих целей могут достигать миллионов определений в год, если стоимость реагента будет достаточно низкой, а активность и стабильность реагента будут достаточно высокими.

Наиболее близким к заявляемому является Патент РФ №2164241, 1999, (Дементьева Е.И., Кутузова Г.Д., Лундовских И.А., Угарова Н.Н. Реагент для определения аденозин-5'-трифосфата"), принятый за прототип, в котором предложен реагент для определения аденозин-5'-трифосфата, включающий люциферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, выделенную из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, очищенную осаждением 35-75%-ным сульфатом аммония, люциферин, сульфат магния, смесь трис-(оксиметил)-аминометана и уксусной кислоты в качестве буферной смеси, смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом в качестве стабилизатора, дополнительный стабилизатор - смесь бычьего сывороточного альбумина и трегалозы и воду при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза иммобилизованная	0,05-0,20
Люциферин	0,014-0,056
Сульфат магния	0,2-0,3
Трис-(оксиметил)-аминометан	0,12-0,60
Уксусная кислота	0,01-0,60
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,04-0,08
Дитиотреитол	0,05-0,10
Бычий сывороточный альбумин	0,05-0,20
D-(+)-трегалоза	5,0-20,0
Вода	Остальное

Недостатком прототипа является невысокая каталитическая активность иммобилизованной люциферазы, поскольку при иммобилизации теряется около 80% активности фермента, что делает необходимым использовать для анализа АТФ относительно высокие количества реагента и тем самым увеличивает расход реагента для определения АТФ. Недостатком прототипа также является неоднородность суспензии иммобилизованной люциферазы, что приводит к довольно высокой погрешности результатов при определении ультрамалых концентраций АТФ. Недостатком прототипа является, кроме того, и то, что иммобилизация усложняет процедуру получения реагента, при этом используют дорогостоящий импортный носитель, а в качестве одного из дополнительных стабилизаторов используют высокие концентрации трегалозы.

Задачей настоящего изобретения является повышение активности реагента для определения АТФ, повышение правильности и воспроизводимости определения АТФ, снижение расхода фермента для получения реагента, упрощение процедуры приготовления реагента, а также использование более доступных и эффективных дополнительных стабилизаторов.

Для решения поставленной задачи предлагаются реагенты для определения АТФ, включающие 0,001-0,01 мас.% растворимой люциферазы, выделенной из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы светляков, 0,014-0,028 мас.% люциферина, 0,5-0,75 мас.% сульфата магния, 2,4-4,8 мас.% трис-(оксиметил)-аминометана, 0,1-0,2 мас.% уксусной кислоты, 0,15-0,22 мас.% этилендиаминтетраацетата натрия, 0,04-0,08 мас.% дитиотреитола, 1,0-5,0 мас.% бычьего сывороточного альбумина, воду, а также дополнительный стабилизатор в количестве, эффективном для стабилизации композиции, в качестве которого используют или полибрен (1,5-диметил-1,5-диазоундекаметилен-полиметобромид) в количестве 0,0002-0,02 мас.%, или поливинилпирролидон в количестве 0,5-1,0 мас.%, или N-фталил-хитозан в количестве 0,02-0,1 мас.%, или сахарозу в количестве 10-20 мас.%.

Преимуществом предлагаемых реагентов является снижение расхода фермента при приготовлении, повышение активности, упрощение процедуры получения реагентов, повышение правильности и воспроизводимости определения АТФ и использование в качестве дополнительных стабилизаторов более доступных по сравнению с трегалозой веществ.

Получение плазмид, штаммов E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы, наращивание биомассы клеток, выделение и очистку люциферазы проводят по методу, описанному в прототипе. Реагенты получают добавлением к концентрированному раствору люциферазы, содержащему 20-100 Е/мл активного фермента, определенного объема трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего люциферин, сульфат магния, этилендиаминтетраацетат натрия, дитиотреитол, бычий сывороточный альбумин и воду, и в качестве дополнительного стабилизатора - или полибрен (1,5-диметил-1,5-диазоундекаметилен-полиметобромид) в количестве 0,0002-0,02 мас.%, или поливинилпирролидон в количестве 0,5-1,0 мас.%, или N-фталил-хитозан в количестве 0,02-0,1 мас.%, или сахарозу в количестве 10-20 мас.%. После тщательного перемешивания раствор в стерильных условиях фильтруют через бактериальный фильтр, разливают во флаконы, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон добавляют определенный объем деионизованной стерильной воды, получая реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5-5 Е/мл.

Изобретение поясняется следующими примерами, которые имеют иллюстративный, но не ограничительный характер.

Пример 1. Приготовление реагента для определения АТФ на основе растворимой люциферазы, выделенной из рекомбинантных клеток E.coli, содержащих плазмиду с геном люциферазы святляков

а. К 1 мл раствора люциферазы, полученной, как описано в прототипе, с активностью 20 Е/мл в 0,05 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 10 мМ сульфат магния, 2 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 1 мМ дитиотреитол, добавляют 39 мл 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 0,002 мг/мл полибрен, тщательно перемешивают, фильтруют через стерильный фильтр в стерильную колбу, разливают в стерильные флаконы по 1,0 мл, замораживают, лиофилизуют, герметически закрывают под вакуумом и хранят до использования в холодильнике. Перед использованием в каждый флакон с лиофилизованным реагентом добавляют 1,0 мл деионизованной стерильной воды. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая	0,001
Люциферин	0,014
Сульфат магния	0,5
Трис(оксиметил аминометан)	4,8
Уксусная кислота	0,2
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,15
Дитиотреитол	0,04
Бычий сывороточный альбумин	1,0
Полибрен	0,0002
Вода	Остальное

б. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 1 мМ люциферин, 30 мМ сульфат магния, 6 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 0,2 мг/мл полибрен. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая	0,001
Люциферин	0,028
Сульфат магния	0,75
Трис(оксиметил аминометан)	4,8
Уксусная кислота	0,2
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,22
Дитиотреитол	0,04
Бычий сывороточный альбумин	5,0
Полибрен	0,02
Вода	Остальное

в. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 1 мл раствора люциферазы с активностью 100 Е/мл и 19 мл 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 0,2 мг/мл N-фталил-хитозан. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 5 Е/мл, при следующем соотношении ингредиентов, мас.%:

Люцифераза растворимая	0,01
Люциферин	0,014
Сульфат магния	0,5
Трис-(оксиметил аминометан)	2,4
Уксусная кислота	0,1
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,15
Дитиотреитол	0,08
Бычий сывороточный альбумин	1,0
N-Фталил-хитозан	0,02
Вода	Остальное

г. Все операции проводят, как описано в примере 1в, но для приготовления реагента используют 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 1 мМ люциферин, 30 мМ сульфат магния, 6 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 1 мг/мл N-фталил-хитозан. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая	0,01
Люциферин	0,028
Сульфат магния	0,75
Трис(оксиметиламинометан)	4,8
Уксусная кислота	0,2
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,22
Дитиотреитол	0,08
Бычий сывороточный альбумин	5,0
N-Фталил-хитозан	0,1
Вода	Остальное

д. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 5 мг/мл поливинилпирролидон. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая	0,001
Люциферин	0,014
Сульфат магния	0,5
Трис(оксиметиламинометан)	2,4
Уксусная кислота	0,1
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,15
Дитиотреитол	0,04
Бычий сывороточный альбумин	1,0
Поливинилпирролидон	0,5
Вода	Остальное

е. Все операции проводят, как описано в примере 1д, но используют 0,1 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатный буферный раствор, рН 7,8, содержащий 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 10 мг/мл поливинилпирролидон. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью люциферазы 0,5 Е/мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Люцифераза растворимая	0,001
Люциферин	0,014
Сульфат магния	0,5
Трис(оксиметиламинометан)	2,4
Уксусная кислота	0,1
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,15
Дитиотреитол	0,04
Бычий сывороточный альбумин	5,0
Поливинилпирролидон	1,0
Вода	Остальное

ж. Все операции проводят, как описано в примере 1а, но используют люциферазу с активностью 50 Е/мл и 39 мл 0,2 М трис-(оксиметил)-аминометанацетатного буферного раствора, рН 7,8, содержащего 0,5 мМ люциферин, 20 мМ сульфат магния, 4 мМ этилендиаминтетраацетат натрия, 10 мг/мл бычий сывороточный альбумин, 100 мг/мл сахарозу и получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 1,25 Е/мл, при следующем соотношении компонентов:

Люцифераза растворимая	0,005
Люциферин	0,014
Сульфат магния	0,5
Трис(оксиметиламинометан)	4,8
Уксусная кислота	0,2
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,15
Дитиотреитол	0,04
Бычий сывороточный альбумин	1,0
Сахароза	10,0
Вода	Остальное

з. Все операции проводят, как описано в примере 1ж, но используют буферный раствор, содержащий 50 мг/мл бычий сывороточный альбумин и 200 мг/мл сахарозы. Получают реагент для измерения концентрации АТФ с активностью 1,25 Е/мл, при следующем соотношении компонентов:

Люцифераза растворимая	0,005
Люциферин	0,014
Сульфат магния	0,5
Трис(оксиметиламинометан)	4,8
Уксусная кислота	0,2
Этилендиаминтетраацетат натрия	0,15
Дитиотреитол	0,04
Бычий сывороточный альбумин	5,0
Сахароза	20,0
Вода	Остальное

Пример 2. Методика измерения концентрации АТФ

0,05 мл реагента, полученного, как описано в примере 1, вводят в цилиндрическую микрокювету объемом 0,2 мл и диаметром 7 мм. Кювету помещают в кюветное отделение люминометра и регистрируют фоновый сигнал, который, как правило, равен 0. Добавляют 0,05 мл раствора АТФ с известной концентрацией. Раствор быстро перемешивают и регистрируют интенсивность биолюминесценции. Операцию повторяют не менее двух раз. Измерения повторяют для растворов АТФ различной концентрации. Результаты измерений с использованием реагентов, полученных по примеру 1, показаны в таблице 1. Прямая пропорциональная зависимость биолюминесценции от концентрации АТФ наблюдается в диапазоне концентраций АТФ от 10^-13 до 10^-8 М. По полученным данным строят градуировочный график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по интенсивности биолюминесценции, регистрируемой для неизвестного образца, как описано выше, используя градуировочный график. При работе с концентрациями АТФ от 10^-11 Ми выше предпочтительнее использовать реагент, описанный в примерах 1д-1з, с концентрациями АТФ от 10^-12 М и выше - реагент, описанный в примерах 1в и 1 г, а с концентрациями АТФ от 10 ^-13 М и выше - реагент, описанный в примерах 1а и 1б.

Пример 3. Испытание стабильности реагента

Раствор реагента, приготовленного, как описано в примере 1, инкубируют при 20°С и через определенные интервалы времени отбирают пробу и определяют интенсивность биолюминесценции, как описано в примере 2, для раствора АТФ с фиксированной концентрацией. Из данных зависимости интенсивности биолюминесценции от длительности инкубации определяют полупериод инактивации реагента в растворе. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 1
Результаты измерения концентрации АТФ с использованием реагента, полученного по примерам 1а-1з
Концент- рация АТФ в кювете, М	Интенсивность биолюминесценции, усл.ед.
	Реагент по примеру 1а	Реагент по примеру 1б	Реагент по примеру 1в	Реагент по примеру 1 г	Реагент по примеру 1д	Реагент по примеру 1e	Реагент по примеру 1ж	Реагент по примеру 1з
Активность люциферазы, Е/мл	0,5	0,5	5,0	5,0	0,5	0,5	1,25	1,25
1×10-8	5800	6615	10986	11662	2405	2544	4890	5060
5×10-9	3560	3570	4956	6156	1265	1538	2350	2421
1×10-9	1373	1374	1290	1190	269	401	468	455
5×10-10	894	1100	559	659	116	132	256	260
1×10-10	370	412	140	127	29	30	41	42
5×10-11	280	240	48	49	15	16	22	25
1×10-11	125	137	19	18	4	5	5	6
5×10-12	85	90	6	6	1	1	2	2,1
1×10-12	40	51	2	2
1×10-12	9	10

Таблица 2
Испытание стабильности реагента
Реагент по способу	Полупериод инактивации, дни
Прототип	2,0
Реагент, предлагаемый по примерам:
1а-1б	3,2
1в-1г	2,5
1д-1е	2,2
1ж-1з	3,0