люминесцентный биокатализатор для определения токсикантов

Формула изобретения

Люминесцентный биокатализатор для определения токсикантов, характеризующийся тем, что он содержит иммобилизованные клетки светящихся бактерий, включенные в криогель на основе поливинилового спирта при следующем соотношении компонентов в мас.%:

клетки бактерий	0,15-1,5
поливиниловый спирт	5,0-10,0
водная фаза	до 100

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, конкретно к иммобилизованным биокатализаторам на основе клеток светящихся бактерий, включенных в матрицу гелевого носителя, предназначенным для определения токсикантов в исследуемых образцах. Это определение основано на том, что светящиеся бактерии, обладающие люциферазной активностью, способны генерировать интенсивное свечение в видимой области спектра, высокочувствительное к присутствию в окружении клеток химических соединений с цитотоксичным и/или генотоксичным действием, а именно тяжелых металлов, алифатических и ароматических углеводородов, фенолов и других ксенобиотиков. Эмиссионный ответ клеток светящихся бактерий - биокатализаторов люминесцентной реакции - служит количественным индикатором общей и специфичной токсичности анализируемого образца, при этом эмиссионный ответ клеток на присутствие токсикантов отличается высокой экспрессностью.

Применение клеток светящихся бактерий в иммобилизованном виде для биодетекции различных токсикантов имеет целый ряд существенных преимуществ перед использованием тех же клеток в виде суспензий, чаще всего получаемых в результате регидратации лиофилизованной биомассы. Иммобилизация позволяет придать биокатализатору существенную стабильность при хранении и повысить длительность его применения, объединить биокатализатор с устройством, регистрирующим люминесцентный сигнал в стационарных и проточных системах.

Основной характеристикой любого биокатализатора на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий, используемых для определения токсикантов, является стабильность его люминесценции во времени, выражаемая через максимальную продолжительность его возможного использования для достоверного определения токсикантов. Возможность длительного использования биокатализатора существенно увеличивает его экономическую привлекательность. Эта характеристика используется для сравнительного анализа различных иммобилизованных биокатализаторов.

На сегодняшний день известны биокатализаторы, разработанные на основе клеток светящихся бактерий, иммобилизованных разными физическими методами (методом адсорбции и методом включения в гелевые матрицы) с использованием различных носителей.

Иммобилизованный биокатализатор на основе светящихся бактерий родов Photobacterium и Vibrio получают в результате их культивирования в течение 12-18 ч в среде роста в присутствии гранул таких неорганических сорбентов, как СаСО₃, Al₂O₃, Са₃ (PO₄)₂ и Al(ОН)₃, введенных в среду в концентрации 50 г/л [Кацев A.M., Абдурманова Э.Р., Черный П.В. (2007) Использование иммобилизованных люминесцентных бактерий при биотестировании. // Экспериментально-теоретические вопросы, Т.10 (3), с.153-156]. После окончания культивирования неорганические носители с адсорбированными на них клетками светящихся бактерий осаждают центрифугированием в течение 15 мин при 3000 об/мин. Полученный осадок представляет собой иммобилизованный биокатализатор, содержащий 10⁶-10⁷ клеток/мг влажного носителя.

Максимальная продолжительность возможного использования такого биокатализатора для определения токсикантов авторами не указана. Очевидно, это обусловлено тем, что биокатализатор характеризуется интенсивной десорбцией клеток из неорганического носителя и быстрой потерей своих первоначальных характеристик.

Известен иммобилизованный биокатализатор на основе клеток светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum, в котором агар применяется в качестве гелевого носителя [Yin J., Xiao-zhou L.I., Zhou С, Zhang Y. (2005) Luminascent bacterial sensors made from immobilized films of Photobacterium phosphoreum. // Chem. Res. Chinese U., V.21 (1), р.44-47]. Для иммобилизации клетки отделяют от среды роста центрифугированием и суспендируют их в 3% растворе NaCl, далее полученную суспензию пропускают через целлюлозный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм. Целлюлозный фильтр с задержанными на нем клетками бактерий кладут между двумя слоями марли с импрегнированным агаровым гелем, который образуется в результате пропитки марли 1,5%-ным раствором агара и последующего ее охлаждения. Полученную трехслойную композицию механически сжимают и удерживают в таком состоянии 30-40 мин при комнатной температуре. Максимальная продолжительность возможного использования полученного в результате такой процедуры иммобилизованного биокатализатора для определения токсикантов составляет 28 суток.

Недостатками данного иммобилизованного биокатализатора являются частичное расслаивание трехслойной композиции с иммобилизованными клетками при ее использовании для определения токсикантов и вымывание клеток из биокатализатора. Точный состав такого биокатализатора неизвестен и трудновоспроизводим, так как количество наносимого на слой марли агарового геля, равно как и количество клеток, адсорбированных на целлюлозном фильтре и вводимых в состав люминесцентного биокатализатора, неизвестны.

Известен другой люминесцентный биокатализатор на основе клеток светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum, иммобилизованных в гель альгината кальция [Makiguchi N., Arita М., Asai Y. (1980) Immobilization of a luminous bacterium and light intensity of luminous materials. // J. Ferment. Technol., V.58 (1), p.17-21; Makiguchi N., Akita M., Asai Y. (1980) Optimal conditions for frozen storage of immobilized luminous bacteria. // J. Ferment. Technol., V.58 (4), р.333-337]. Для получения такого биокатализатора клетки светящихся бактерий культивируют в среде, содержащей глицерин (1,0 г/л), полипептон (10,0 г/л), мясной экстракт (3,0 г/л), хлорид натрия (30,0 г/л) (рН 7,3), при 20°С до уровня максимальной люминесценции. Далее в культуральную среду всыпают альгинат натрия до конечной его концентрации 3% и ведут перемешивание до полного растворения полимера. Полученную массу переносят в хроматографическую колонку, в которую закачивают 0,4 М раствор хлорида кальция и выдерживают в нем полученную массу в течение 15-30 мин для формирования геля альгината кальция. Получают люминесцентный биокатализатор, имеющий цилиндрическую форму, соответствующую форме и внутренним размерам колонки, режут и используют для определения токсикантов. Максимальная продолжительность возможного использования такого иммобилизованного биокатализатора составляет 12 суток, при этом биокатализатор теряет 30% своего исходного уровня свечения в течение первых 24 ч.

Стабильность такого люминесцентного биокатализатора низкая. Другими недостатками такого биокатализатора являются негомогенная пористостость гелевой матрицы и неоднородность люминесцентных свойств биокатализатора по его объему, возникающие из-за того, что формирование геля альгината кальция происходит в относительно большом монолитном объеме в результате диффузии раствора хлорида кальция от внешней границы суспензии клеток в растворе полимера, находящихся в хроматографической колонке, к внутренним слоям системы. Состав такого биокатализатора, в частности концентрация клеток, неизвестна.

Уменьшение размеров люминесцентного биокатализатора, получаемого путем включения клеток светящихся бактерий в Са-альгинатный гель [Sakaguchi Т., Morioka Y., Yamasaki М., Iwanaga J., Beppu К., Maeda H., Morita Y., Tamiya E. (2007) Rapid and onsite sensing system using luminous bacterial cells-immobilized chip. // Biosens. Bioelectron., V.22, p.1345-1350] до размера капель (10 мкл) и снижение концентрации раствора хлорида кальция в 4 раза по сравнению с вышеописанным биокатализатором позволяет получить люминесцентный биокатализатор с гомогенной структурой и воспроизводимыми свойствами. Максимальная продолжительность возможного использования такого биокатализатора для определения токсикантов составляет 4 суток.

Основными недостатками такого биокатализатора являются:

- крайне низкая стабильность люминесценции;

- механическая нестабильность гелевой матрицы, являющаяся следствием применения 1% раствора хлорида кальция при формировании альгинатного геля.

Применение 0,1 М раствор хлорида стронция вместо 1% раствора хлорида кальция для формирования альгинатного геля, предложенное другими разработчиками люминесцентного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий, обеспечивает получение Sr-альгинатного геля, обладающего более высокой механической прочностью, чем Са-альгинатный гелевый носитель [Chun U.-H., Simonov N., Chen Y., Britz M.L. (1996) Continuous pollution monitoring using Photobacterium phosphoreum. // Resources, Conserv. Recyclyng, V.18, р.25-40]. Для того чтобы получить такой биокатализатор, клетки Photobacterium phosphoreum выращивают на среде, содержащей 0,3% глицерина, 2,7% NaCl, 1,25% питательного бульона № 2 фирмы Oxoid и 0,5% дрожжевого экстракта, при 22°С в течение 24 ч. Далее клетки отделяют от среды культивирования центрифугированием, полученный осадок клеток ресуспендируют в 3% растворе NaCl до получении суспензии с оптической плотностью 2,0-2,5, определяемой при длине волны 600 нм. К 12,5 мл такой суспензии добавляют 25 мл раствора альгината натрия в 3% растворе NaCl и 7,5 мл глицерина. При постоянном перемешивании полученную смесь по каплям вносят в раствор 0,1 М SrCl₂, при этом соотношение объемов закапываемой смеси и раствора хлорида стронция составляет 1:5. Для формирования гранул биокатализатора капли смеси альгината натрия и клеток выдерживают 1-1,5 ч в 0,1 М SrCl₂ при комнатной температуре, далее вынимают и промывают 3% раствором NaCl. Максимальная продолжительность возможного использования такого люминесцентного биокатализатора для определения токсикантов составляет 42 суток.

Несмотря на улучшение механической прочности носителя в таком биокатализаторе в сравнении с Са-альгинатным гелем устранить недостатки негомогенной пористости гелевой матрицы и неоднородности люминесцентных свойств биокатализатора по его объему не удается, так как эти недостатки предопределяются химической структурой самого природного полимера.

Переход в использовании для формирования носителей иммобилизованных клеток от природных полимеров к синтетическим, характеризующимся химической структурой с четко известным строением мономерных групп, имеет несомненные преимущества и обеспечивает получение механически прочных носителей с регулярной пористостью, то есть с одинаковым размером и распределением пор по всему объему матрицы.

Известен биокатализатор на основе клеток светящихся бактерий, иммобилизованных в криогель поливинилового спирта (ПВС), для определения токсикантов [Patent WO/2001/032911 А2 (PCT/GB00/04182), 2001, Toxicity assay using PVA-immobilized luminescent bacteria. C12Q 1/02; C12Q 1/66]. Для получения такого биокатализатора клетки Photobacterium (Vibrio) ficheri выращивают в течение 20 ч при 25°С на среде, содержащей 5,6 мМ NH₄Cl, 1,2 мМ MgSO₄, 6 мкМ FeCl ₃, 10 мМ CaCO₃, 22 мМ KH₂PO₄ , 510 мМ NaCl, 110 мМ глицерофосфат натрия, 0,5% триптона, 0,25% дрожжевого экстракта [Philp J.C., Balmand S., Hajto E., Bailey M.J., Wiles S., Whiteley A.S., Lilley A.K., Hajto J., Dunbar S.A. (2003) Whole cell immobilized biosensors for toxicity assessment of a wastewater treatment plant treating phenolics-containing waste. // Anal. Chim. Acta, V.487, р.61-74]. Далее клетки центрифугируют и полученный осадок смешивают в соотношении 1:1 (или 1:1-1:0,25) с 14% (или 8-20%) раствором ПВС, приготовленным на основе фосфатного буфера, содержащего 3% NaCl и 10% глицерина. Конечная концентрация клеток в такой смеси составляет 2×10⁹ клеток/мл. Полученную смесь наносят капельно на поверхность микробиологического предметного стекла, которое помещают на вращающуюся поверхность и раскручивают в течение 15-20 секунд со скоростью 800-1000 об/мин так, чтобы капля под действием центробежных сил растеклась по поверхности стекла слоем толщиной 100 мкм (или 20 мкм - 5 мм). Далее стекло с каплей на поверхности помещают в морозильную камеру с температурой -30-10°С на 16-48 ч, затем переносят для более глубокого замораживания при температуре -40-100°С, далее размораживают образец в течение 30 мин при комнатной температуре, чтобы в результате процесса «замораживания-оттаивания» сформировать криогель ПВС с включенными в него клетками бактерий по известной методике [В.И.Лозинский (2002) Криогели на основе природных и синтетических полимеров: получение, свойства и области применения. // Успехи химии, Т.71(6) 559-585]. Получаемый люминесцентный биокатализатор представляет собой тонкую пленку гидрогеля с иммобилизованными в нем клетками светящихся бактерий. Чтобы достичь уровня люминесценции, обеспечивающего последующее длительное применение полученного биокатализатора, проводят инкубировании сформированных пленок с иммобилизованными клетками после их размораживания в среде, содержащей -глицерофосфат, или мальтозу, или глицерин, в течение 12-27 суток. Максимальная продолжительность возможного использования такого активированного биокатализатора для определения токсикантов составляет 6 месяцев (180 суток).

Данное техническое решение, как наиболее близкое к заявляемому по способу иммобилизации (включение в гелевую матрицу полимерного носителя) и типу носителя (криогель на основе поливинилового спирта), используемых для получения люминесцентного биокатализатора для определения токсикантов на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий, принято за прототип.

Это известное техническое решение имеет следующие недостатки:

- предлагаемые условия замораживания-оттаивания смеси клеток с полимером приводят к высокой гибели клеток светящихся бактерий при их иммобилизации, что компенсируется разработчиками биокатализатора введением высоких концентраций клеток (20-50% по массе) в его состав для обеспечения удовлетворительных уровней люминесценции, а также применением в составе биокатализатора 10% глицерина, проявляющего свойства криопротектора. Введение высоких концентраций клеток приводит к тому, что часть их остается слабо удерживаемыми матрицей криогеля ПВС и легко вымывается из биокатализатора при его применении для определения токсикантов. В анализируемый с помощью биокатализатора образец также вымывается глицерин из пор размороженного биокатализатора, искажая результаты определения токсикантов;

- выход клеток из матрицы носителя, а также гибель клеток в процессе их иммобилизации предопределяет низкий уровень люминесценции получаемого биокатализатора, который увеличивают до 2500-5500 усл. единиц за счет длительной (12-27 суток) инкубацией иммобилизованных клеток в специальных средах. Такой способ активации биокатализатора для увеличения его люминесценции требует существенных временных затрат перед использованием биокатализатора для определения токсикантов;

- высокие концентрации раствора полимера (выше 10%), применяемые для формирования биокатализатора обеспечивают в процессе замораживания суспензии клеток в растворе ПВС образование очень мелких пор, формируемых кристаллами замороженной воды, входящей в состав биокатализатора. Образованию мелких пор способствует также присутствие глицерина в составе замораживаемой смеси. Мелкопористая структура полимерной матрицы, в свою очередь, создает диффузионные проблемы и существенно ухудшает массообменные процессы для клеток, что приводит к снижению их люминесценции;

- для улучшения массообменных условий существования иммобилизованных клеток светящихся бактерий биокатализатору придают форму тонких пленок, которая технически существенно усложняет процесс работы с биокатализатором, так как пленки чувствительны к механическим воздействиям. Для упрочнения полученных пленок применяется двухэтапное замораживание суспензии клеток в растворе полимера с понижением температуры на втором этапе по сравнению с первым в 2 раза (от -30-10°С до -40-100°С). При этом вдвое увеличивается продолжительность выдерживания биокатализатора в замороженном состоянии, необходимая для образования прочных пленок криогеля ПВС, формирующегося за счет возникновения множественных межмолекулярных водородных связей. Способ получения биокатализатора в таких условиях способствует упрочнению структуры матрицы криогеля ПВС, но приводит к дополнительным экономическим затратам на получение такого биокатализатора;

- форма получаемого люминесцентного биокатализатора - тонкая пленка - предопределяется способом его получения и не может быть варьируемой, что, в свою очередь, ограничивает возможности проведения определения токсикантов с использованием такого биокатализатора на различных устройствах, регистрирующих биолюминесценцию иммобилизованных клеток.

Задачей предлагаемого изобретения является получение люминесцентного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий для определения токсикантов с упрощенной технологией производства и увеличенным сроком использования.

Поставленная задача решается тем, что люминесцентный биокатализатор для определения токсикантов содержит иммобилизованные клетки светящихся бактерий, включенные в криогель поливинилового спирта, и имеет следующее соотношение компонентов (мас.%): биомасса клеток - 0,15÷1,5; поливиниловый спирт - 5÷10; водная фаза - до 100. Максимальная продолжительность возможного использования заявляемого биокатализатора для определения токсикантов составляет 730 суток.

Применение криогеля поливинилового спирта в качестве носителя для иммобилизованных клеток обусловлено высокой пористостью образующейся гелевой матрицы, обеспечивающей незатрудненную диффузию субстратов и продуктов, соответственно, к и от иммобилизованных клеток, а также хорошими эксплуатационными характеристиками материала такого криогеля. Размер пор носителя предопределяется концентрацией полимера в замораживаемой смеси с клетками, а также температурой замораживания этой смеси [Лозинский В.И., Дамшкалн Л.Г., Шаскольский Б.Л., Бабушкина Т.А., Курочкин И.Н., Курочкин И.И. Изучение криоструктурирования полимерных систем. 27. Физико-химические свойства криогелей поливинилового спирта и особенности их макропористой морфологии. // Колоидн. журн. 69 (6) 798-816 (2007)]. Нижний заявляемый предел концентрации поливинилового спирта определяется тем, что при меньшей чем 5 мас.% концентрации этого гелеобразующего полимера в составе биокатализатора заметно снижается устойчивость гранул к деформационным нагрузкам из-за увеличения размера пор в формирующейся матрице. Увеличение размера пор также способствует выходу части иммобилизованных клеток из матрицы. При концентрации поливинилового спирта выше 10 мас.%, указанной как верхний заявляемый предел в составе биокатализатора, образуются прочные упругие гранулы, но с мелкопористой структурой, которая заметно ухудшает массообменные процессы внутри гранул и приводит к снижению максимального уровня люминесценции биокатализатора. Нижний заявляемый предел концентрации биомассы клеток в составе люминесцентного биокатализатора определяется необходимым уровнем люминесценции, обеспечивающим продолжительное использование биокатализатора для определения токсикантов. При использовании меньшей чем 0,15 мас.% концентрации клеток получаемый иммобилизованный биокатализатор обладает заметно меньшим уровнем люминесценции, а верхний предел концентрации клеток в биокатализаторе определяется тем, что при использовании концентрации, превышающей 1,5 мас.%, происходит неполное включение всех клеток, вводимых в смесь с раствором полимера, в формирующийся криогель поливинилового спирта и затем наблюдается их вымывание при использовании полученных гранул в среде для определения токсикантов. Таким образом, превышение указанного верхнего предела концентрации клеток нецелесообразно.

Получение клеток светящихся бактерий каждой культуры перед их иммобилизацией для приготовления биокатализатора проводится с применением известных биотехнологических приемов в соответствии с частными характеристиками культур.

В ходе криогенной обработки получаемому биокатализатору известными способами могут быть приданы любой размер и любая необходимая форма, в частности форма полусферических гранул, частиц неправильной формы, гелевых блоков, дисков, листов, пленок, трубок и др. Для этого суспензия клеток в растворе гелеобразователя замораживается в соответствующей форме.

Заявляемый состав иммобилизованного люминесцентного биокатализатора, состоящего из клеток светящихся бактерий, полимерной матрицы криогеля поливинилового спирта и водной фазы, взятых в определенных концентрациях, ранее известен не был и является новым.

Определение токсикантов с помощью заявляемого люминесцентного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий проводят стандартным путем с применением фотоприемников, функционирующих в токовом режиме, основываясь на определении изменения уровня люминесценции иммобилизованных клеток после их экспонирования в среде, содержащей различные токсиканты.

Ниже приводятся конкретные примеры реализации заявляемого изобретения.

Пример 1. Люминесцентный биокатализатор на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum КМ МГУ № 331 для определения токсикантов

2,7 г биомассы клеток светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum КМ МГУ № 331, полученной после центрифугирования (10 мин, 5000 об/мин), смешивают при комнатной температуре с 83,8 г 7%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе питательной среды Фаргали, содержащей 30 г/л NaCl, 5,3 г/л Na₂ HPO₄, 2,1 г/л KH₂PO₄×2H ₂O, 0,5 г/л (NH₄)HPO₄, 0,1 г/л MgSO ₄×7H₂O, 1 г/л дрожжевого экстракта, 5 г/л пептона и 3 мл глицерина, до получения однородной массы. Эту суспензию далее используют для получения гранул иммобилизованного биокатализатора. Гранулирование проводят следующим образом: полученную суспензию распределяют с помощью дозирующего устройства (шприц, дозатор и др.) в лунки с плоским дном иммунологических 96-луночных планшетов по 0,2 мл. Замораживают суспензию при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 17 ч, проводят оттаивание при +4°С в течение 8 ч. Получают 86,5 г люминесцентного биокатализатора, имеющего цилиндрическую форму гранул и следующий состав (мас.%): клетки бактерий - 0,62; поливиниловый спирт - 6,8; водная фаза - до 100.

Максимальная продолжительность возможного использования получаемого биокатализатора для определения токсикантов составляет 730 суток.

Пример 2. Люминесцентный биокатализатор на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий Vibrio fischeri КМ МГУ № 6 для определения токсикантов

2,4 г биомассы клеток светящихся бактерий Vibrio fischeri КМ МГУ № 6, полученной после центрифугирования (15 мин, 6000 об/мин), смешивают при комнатной температуре с 24,0 г 10%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе 0,1 М Na-фосфатного буфера, содержащего 30 г/л NaCl, до получения однородной массы. Эту суспензию далее используют для получения гранул иммобилизованного биокатализатора. Гранулирование проводят путем заливки полученной однородной массы в лунки со сферическим дном 96-луночных иммунологических плашек по 0,1 мл. Замораживают суспензию при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 12 ч, проводят оттаивание при +8°С в течение 5 ч. Получают 26,4 г люминесцентного биокатализатора, имеющего следующий состав (мас.%): клетки бактерий - 1,5; поливиниловый спирт - 9,1; водная фаза - до 100. Максимальная продолжительность возможного использования получаемого биокатализатора для определения токсикантов составляет 670 суток.

Пример 3. Люминесцентный биокатализатор на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий Vibrio harveyi 392 АТСС для определения токсикантов

1,8 г биомассы клеток светящихся бактерий Vibrio harveyi 392 АТСС, полученной после центрифугирования (10 мин, 6000 об/мин), смешивают при комнатной температуре с 180,0 г 10%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе 0,1 М Na-фосфатного буфера, содержащего 30 г/л NaCl, до получения однородной массы. Полученную смесь наносят капельно на поверхность стекла, которое помещают в морозильную камеру при -18°С, выдерживают в замороженном состоянии 12 ч, проводят оттаивание при +8°С в течение 5 ч. Получают 181,8 г люминесцентного биокатализатора, имеющего форму полусфер с диаметром 2-3 мм и следующий состав (мас.%): клетки бактерий - 0,15; поливиниловый спирт - 10; водная фаза - до 100. Максимальная продолжительность возможного использования получаемого биокатализатора для определения токсикантов составляет 630 суток.

Пример 4. Люминесцентный биокатализатор на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum КМ МГУ № 331 для определения токсикантов

1,8 г биомассы клеток светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum КМ МГУ № 331, полученной после центрифугирования, как в Примере 1, смешивают при комнатной температуре с 180,0 г 10%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе 3% раствора NaCl, до получения однородной массы. Эту суспензию далее используют для получения гранул иммобилизованного биокатализатора. Гранулирование проводят путем заливки полученной однородной массы в лунки со сферическим дном 96-луночных иммунологических плашек по 0,1 мл. Замораживают суспензию при -20°С, выдерживают в замороженном состоянии 12 ч, проводят оттаивание при +8°С в течение 5 ч. Получают 181,8 г люминесцентного биокатализатора, имеющего следующий состав (мас.%): клетки бактерий - 0,15; поливиниловый спирт - 10; водная фаза - до 100.

Максимальная продолжительность возможного использования получаемого биокатализатора для определения токсикантов составляет 710 суток.

Пример 5. Люминесцентный биокатализатор на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum 11040 АТСС для определения токсикантов

1 г биомассы клеток светящихся бактерий Photobacterium phosphoreum 11040 АТСС, полученной после центрифугирования, как в Примере 1, смешивают при комнатной температуре с 34 г 5%-ного раствора поливинилового спирта, приготовленного на основе питательной среды, состав которой указан в Примере 1, но без пептона, до получения однородной массы. Полученную массу выливают ровным слоем толщиной 0,1 см на платформу из нержавеющей стали, которую помещают в морозильную камеру. Замораживают суспензию при -15°С, выдерживают в замороженном состоянии 24 ч, проводят оттаивание при +8°С в течение 4 ч. Получают 35 г люминесцентного биокатализатора, имеющего форму тонкой пластины и следующий состав (мас.%): клетки бактерий - 0,5; поливиниловый спирт - 5,0; водная фаза - до 100. Максимальная продолжительность возможного использования получаемого биокатализатора для определения токсикантов составляет 695 суток.

Пример 6. Определение различных токсикантов с использованием заявляемого люминесцентного биокатализатора на основе иммобилизованных клеток светящихся бактерий

Определение токсикантов в различных образцах с применением заявляемого иммобилизованного люминесцентного биокатализатора проводят согласно общепринятым стандартным методам. Для этого биокатализатор помещают в раствор 2% NaCl и определяют исходный уровень люминесценции биокатализатора. Затем в этот же раствор вносят образцы различных токсикантов в варьируемых концентрациях, экспонируют биокатализатор в течение 5-15 мин в полученном растворе и определяют остаточный уровень люминесцентного свечения иммобилизованных клеток. Далее строят график зависимости уровня остаточной люминесценции от концентрации токсиканта. Пример такой зависимости приведен на чертеже для иммобилизованного биокатализатора, получаемого, как описано в Примере 1, и таких токсикантов, как ионы Hg²⁺ (1), пентахлорфенол (2) и паратион (3).

Из полученных данных устанавливается диапазон линейной зависимости остаточной люминесценции иммобилизованного биокатализатора от концентрации токсиканта. В Таблицах 1 и 2 указаны токсиканты и диапазоны их концентраций, которые могут быть определены с использованием заявляемого иммобилизованного биокатализатора, полученного согласно тому, как это описано в Примерах 1-4.

Таким образом, заявляемое изобретение приводит к получению иммобилизованного биокатализатора, имеющего следующие преимущества по сравнению с аналогами и прототипом:

1. В заявляемом изобретении значительно, в сравнении с прототипом, снижена концентрация клеток, вводимая в состав биокатализатора (в прототипе концентрация клеток составляет 25-50%) при обеспечении широкого спектра токсикантов, которые могут быть эффективно определены с применением заявляемого биокатализатора, что значительно улучшает экономическую и экологическую стороны процесса получения биокатализатора и упрощает технологию производства иммобилизованного биокатализатора.

2. Согласно заявляемому изобретению в составе биокатализатора отсутствует глицерин, который входит в состав биокатализатора-прототипа в концентрации 10%. Подобранные соотношения компонентов в заявляемом решении позволяют получить биокатализатор с высоким уровнем выживаемости клеток светящихся бактерий и, соответственно, высоким уровнем биолюминесценции и длительным сроком возможного использования в отсутствие глицерина, выполняющего функцию криопротектора. Упрощение состава биокатализатора имеет технологические преимущества и улучшает экономическую сторону процесса его получения.

3. Заявляемый биокатализатор получают по способу, предусматривающему одностадийное замораживание при температуре -15-20°С, и не требует, в отличие от прототипа, двухстадийного замораживания с понижением температуры замораживания биокатализатора, что существенно упрощает технологию получения биокатализатора и снижает энергетические затраты на процесс.

4. Максимальная продолжительность возможного использования заявляемого люминесцентного биокатализатора для определения токсикантов в 3,5-180 раз превышает значения той же характеристики аналогов и прототипа.

5. Положительный эффект при реализации заявляемого изобретения может быть получен при использовании иммобилизованных клеток различных светящихся бактерий, обладающих люминесценцией (см. Примеры 1-3).

6. Заявляемый люминесцентный биокатализатор, в отличие от прототипа, может иметь различную форму и размеры, что существенно расширяет спектр различных устройств, которые могут быть использованы для регистрации биолюминесценции иммобилизованных клеток.

Таблица 2
Диапазоны концентраций различных фосфорорганических токсикантов, которые могут быть определены с использованием заявляемого люминесцентного биокатализатора, полученного, как описано в Примере 4, при экспонировании его в присутствии соответствующих токсикантов в течение 5 мин
Вещество	Паратион	Кумафос	Метилфосфоновая кислота	Малатион
Концентрация, мг/л	0,05-8,0	1,0-100,0	1,0-100,0	0,05-50