фотобелок с повышенной биолюминесценцией

Формула изобретения

1. Химерный апофотобелок, характеризующийся аминокислотной последовательностью, соответствующей последовательности белка обелина, фрагмент которой от остатка в положении 50 до остатка в положении 94 заменен фрагментом аминокислотной последовательности белка клитина от остатка в положении 53 до остатка в положении 97, и обладающий повышенным по сравнению с обелином уровнем биолюминесценции.

2. Химерный апофотобелок по п.1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3.

3. Слитый белок, состоящий из аминокислотной последовательности химерного апофотобелка по любому из пп.1-2 и аминокислотной последовательности вспомогательного полипептида.

4. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая химерный апофотобелок, которая характеризуется нуклеотидной последовательностью, соответствующей аминокислотной последовательности химерного белка по любому из пп.1 и 2.

5. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты по п.4, имеющая и нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:5.

6. Применение химерного апофотобелка по любому из пп.1-2 в комбинации с субстратом люциферином для детектирования ионов кальция.

7. Применение по п.6 для количественного определения ионов кальция.

8. Применение по п.7 для определения внутриклеточной концентрации кальция.

9. Клетка-хозяин, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п.4 или 5 и экспрессирующая химерный апофотобелок.

10. Клетка-хозяин по п.9, выбранная из клеток бактерий, дрожжей, грибов, растений, насекомых и млекопитающих.

11. Способ получения химерного апофотобелка, включающий выращивание клетки-хозяина по п.9 или 10, в условиях, пригодных для экспрессии фотобелка, и извлечение экспрессированного белка.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к химерному фотобелку с повышенной люминесцентной активностью, его применению в качестве индикатора кальция в системах репортерных генов и в основанных на клетках анализах для выявления и измерения внутриклеточного кальция.

Уровень техники

Биолюминесценция является способностью живых организмов излучать видимый свет посредством систем хемилюминесцентных реакций. Для биолюминесцентных реакций требуются три основных компонента: люциферин, люцифераза и молекулярный кислород. Однако в некоторых реакциях также могут требоваться другие компоненты, включая катионы (Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺) и кофакторы (АТФ, НАД(Ф)H). Люциферазы являются ферментами, которые катализируют окисление субстрата, люциферина, и дают нестабильный промежуточный продукт. Свет испускается, когда нестабильный промежуточный продукт распадается до своего основного состояния, образуя оксилюциферин. Существует много различных неродственных типов люциферина, хотя многие виды по меньшей мере из семи филогенетических типов используют один и тот же люциферин, названный коэлентеразином, который содержит цикл, образованный тремя аминокислотами (2 тирозина и фенилаланин). У некоторых животных (например, медуз) система люциферин/люцифераза может быть экстрагирована в виде стабильного «фотобелка», который испускает свет при связывании кальция. Фотобелки отличаются от люцифераз тем, что они являются стабилизированными окисленными промежуточными комплексами люциферазы и люциферина. Фотобелки присутствуют у многих морских кишечнополостных и позволяют указанным организмам испускать свет для различных целей, включая размножение, питание и защиту [1]. В то время как бактерии испускают свет постоянно, у многих других организмов люминесценция происходит в виде вспышек продолжительностью обычно 0,1-1 сек. Это требует быстрого включения/выключения ферментативной реакции и присутствия реагентов, связываемых соответствующим образом и готовых для быстрой мобилизации. У кишечнополостных вспышки вызваны поступлением кальция. Сайты фотобелков для связывания кальция гомологичны кальмодулину. В присутствии кальция фотобелки испускают видимый свет посредством внутримолекулярной реакции. Существует много люминесцирующих организмов, но до настоящего времени выделены только семь фотобелков, а именно талассиколин [2, 3], экворин [4-6], митокромин (син. галистаурин) [7, 8], клитин (син. фиалидин) [8, 9], обелин [2, 6, 10, 11], мнемиопсин [12, 13] и беровин [12, 13]. Все указанные белки являются комплексами апобелка, хромофора имидазопиразина (коэлентеразина) и кислорода. Их структуры являются высококонсервативными, особенно в области, содержащей три сайта связывания кальция (структуры EF-руки). Указанные структуры EF-руки являются характерными для семейства связывающих кальций белков. Фотобелок испускает свет при взаимодействии с кальцием, который тесно связывается с карманом EF-руки. Реакция представляет собой событие в виде одного цикла и приводит к высвобождению CO₂ и испусканию света в голубой области ( _max = 470 нм). Термин «фотобелок» определяет связанный с люциферином полипептид, который способен к люминесценции, тогда как «апофотобелок» используется для указания на белок без люциферина.

Наиболее исследованным фотобелком является экворин, выделенный из Aequorea victoria [14], и обелин, выделенный из Obelia longissima [15]. При связывании Ca ⁺⁺ экворин подвергается конформационному изменению, сам по себе превращаясь в оксигеназу (люциферазу), которая затем катализирует окисление коэлентеразина посредством связи молекулярного кислорода. Голубой флуоресцирующий белок состоит из коэлентерамида, который является продуктом окисления коэлентеразина, нековалентно связанного с апофотобелком. Фотобелок может быть регенерирован из апофотобелка путем инкубирования с коэлентеразином, молекулярным кислородом, EDTA и 2-меркаптоэтанолом или дитиотрейтолом. Так как коэлентеразин является общим люминесцентным субстратом, используемым фотобелками экворином, митокромином, клитином и обелином, то реакция испускания света, вероятно, является одной и той же в случае указанных четырех фотобелков [16]. Недавнее получение первичной структуры и кристаллографических данных об экворине и обелине дало дополнительную информацию об их функционировании. Нативный обелин из гидроида Obelia longissima является одноцепочечным белком из 195 аминокислотных остатков (а/к) с приблизительной молекулярной массой 20 кД, который содержит нековалентно связанную хромофорную группу коэлентеразин. Анализ первичных структур клитина показывает, что он содержит 189 а/к и относится к семейству фотобелков. Однако Ca⁺⁺-связывающий фотобелок гидроидов отличается от других Ca⁺⁺-связывающих белков, таких как кальмодулин и тропонин C, относительно высоким содержанием остатков цистеина, гистидина, триптофана, пролина и тирозина.

Исследования структуры и функции обелина описаны у Bondar VS et al., Biochemistry (2001), 66(9): 1014-8, Vysotski ES et al., (2003), 42(20): 6013-24 и Deng L. et al., FEBS Lett. (2001), 506(3): 281-5. В частности, в двух последних публикациях описаны биолюминесцентные и эмиссионные свойства мутанта обелина W92F.

Фотобелки широко используются в методике репортерных генов для наблюдения за событиями в клетке, связанными с сигнальной трансдукцией и экспрессией генов.

Исследование клеточных событий и их регуляции требует чувствительных, неинвазивных аналитических способов. Фотобелки и в общем биолюминесценция являются прекрасными репортерными системами, так как они практически не имеют фона в отличие от флуоресцентных систем.

Фотобелки экспрессированы в клетках млекопитающих для мониторинга изменений кальция в ответ на различные стимулы. Внутриклеточная концентрация кальция может быть измерена при добавлении кофактора коэлентеразина к клеткам млекопитающих, экспрессирующим фотобелок, и дальнейшей регистрации испускания фотонов, которое является показателем внутриклеточной концентрации кальция.

Описание изобретения

Обнаружено, что при химеризации белка обелина (апобелина) посредством замены его области, находящейся между первыми двумя сайтами связывания кальция, соответствующей областью фотобелка, выбранного из клитина, экворина, талассиколина, митокромина, мнемиопсина и беровина, получают новый фотобелок с повышенной биолюминесценцией.

В используемом в данном описании смысле обелин может относиться к любому из фотобелков, выделенных из различных видов Obelia, включая Obelia longissima и Obelia geniculata [17]. Базовые нуклеотидная и аминокислотная последовательности обелина указаны в SEQ ID NO: 1 и 2 соответственно. Базовые аминокислотные и нуклеотидные последовательности клитина, митокромина и экворина депонированы в GenBank с номерами доступа Q08121, P39047, AAA27720 и соответственно L13247, L31623, L29571, тогда как последовательности талассиколина, мнемиопсина и беровина описаны в ссылках 2, 3, 12 и 13.

«Соответствующая область или фрагмент» в используемом в данном описании смысле означает любую аминокислотную последовательность в выбранном фотобелке, совпадающую с последовательностью обелина при соответствующих выравниваниях, за исключением по меньшей мере 1, предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, которые не являются консервативными в соответствующих белках (обелин и выбранный фотобелок), при этом указанная область или фрагмент предпочтительно охватывает остатки 42-122, более предпочтительно - остатки 50-95, которые относятся к последовательности обелина.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения химерный белок получают заменой остатков с 50 по 94 аминокислотной последовательности обелина фрагментом последовательности клитина, простирающимся от остатка 53 до остатка 97. Полученный таким образом фотобелок, который назван «фотин», имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

Химерные белки, предлагаемые в изобретении, могут быть далее модифицированы путем делеции, добавления или замены одного или нескольких аминокислотных остатков, при условии, что профиль активности фотобелка в отношении испускания света и реактивности в отношении кальция сохраняется или увеличивается. Особенно предпочтительными являются замены в положениях 55, 66, 67, 73, 74, 75, 78, 83, 84, 87, 89 и 94, которые относятся к последовательности обелина.

Как показано исследованиями in vitro, фотин вырабатывает интенсивную биолюминесценцию в ответ на стимуляцию кальцием, которая обычно выше, чем биолюминесценция, наблюдаемая в случае природных фотобелков.

Для получения химерных фотобелков готовят конструкцию рекомбинантной ДНК, несущую части кодирующих последовательностей обелина и выбранного другого фотобелка, отличного от обелина, используя обычную генетическую инженерию, полученный в результате химерный продукт встраивают в вектор, экспрессируют в подходящем хозяине и затем выделяют и очищают. Например, кДНК, кодирующие обелин и другой фотобелок, можно амплифицировать в ПЦР или сконструировать in vitro с синтетическими олигонуклеотидами, и продукты можно рекомбинировать, воспользовавшись подходящими сайтами рестрикции, встречающимися в природе или искусственно введенными в олигонуклеотиды, используемые для амплификации или для конструирования in vitro. Экспрессирующий вектор может содержать, кроме рекомбинантной конструкции, промотор, сайт связывания рибосомы, кодон инициации, стоп-кодон или консенсусный сайт энхансеров транскрипции. Вектор также может содержать селектируемый маркер для выделения клеток-хозяев, содержащих конструкцию ДНК. Подходящими векторами являются, например, плазмиды дрожжей или бактерий, бактериофаги, вирусы, ретровирусы или ДНК. Векторы, несущие рекомбинантную конструкцию, могут быть введены в хозяина с помощью обычных методик. Клетками-хозяевами могут быть прокариотические или эукариотические клетки, такие как клетки бактерий, дрожжей или млекопитающих. Предпочтительными хозяевами для экспрессии/продукции фотобелка являются клетки млекопитающих, включая клетки эпителиального или лимфобластного происхождения, такие как Hek-293, CHO-K1, HepG2 и HL-60. Указанные клетки могут экспрессировать апофотобелок в цитоплазме [18], в митохондриях при добавлении к фотобелку направляющей в митохондрии последовательности или в любом другом компартменте клетки [19-21]. Альтернативно можно использовать другие клетки, отличные от клеток млекопитающих, такие как клетки бактерий или грибов. После выбора типа клетки-хозяина генетические конструкции можно ввести путем осаждения фосфатом кальция, электропорации или другими традиционными способами. После трансфекции клетки выращивают в подходящих средах и подвергают скринингу в отношении соответствующих активностей. Фотобелок, предлагаемый в изобретении, можно выделить и очистить традиционными способами, такими как экстракция, осаждение, хроматография, аффинная хроматография, электрофорез.

Точечные мутации можно ввести в химерный продукт путем удлинения перекрывающихся участков с помощью ПЦР.

Чтобы получить фотин, NdeI/MunI-фрагмент гена обелина заменяли фрагментом из 135 нуклеотидов, соответствующим кодирующей последовательности клитина в пределах нуклеотидов от 156 до 291.

В следующем аспекте изобретение направлено на молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую химерные белки, раскрытые в данном описании. Кодирующие последовательности ДНК могут быть модифицированы на основании вырожденности генетического кода, например, изменением использования кодонов для улучшения экспрессии в гетерологичных системах.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения последовательность ДНК, кодирующая белок фотин, выбрана из SEQ ID NO: 4 и 5.

Чтобы проверить, является ли химерный продукт функциональным, осуществляли эксперименты по транскрипции и трансляции in vitro в бесклеточной системе трансляции зародышей пшеницы в присутствии коэлентеразина. В указанных экспериментах образование активного фотобелка регистрируют, тестируя люминесценцию смеси для трансляции после добавления ионов кальция. Чтобы сопоставить измеряемую люминесценцию с количеством продуцированного белка, реакцию трансляции осуществляют в присутствии ³⁵S-метионина. Количество новосинтезированного полипептида определяют путем измерения включения ³⁵S-метионина в нерастворимую в трихлоруксусной кислоте фракцию. Результаты данных экспериментов демонстрируют чувствительность и эффективность фотина в генерировании биолюминесценции в ответ на стимуляцию ионами кальция.

В следующем варианте осуществления изобретения предлагаемые химерные белки используют в качестве индикаторов кальция, особенно для измерения внутриклеточной концентрации кальция. В типичном анализе добавляют кофактор, такой как коэлентеразин, к клеткам млекопитающих, экспрессирующим фотобелок, и испускание света регистрируют способами, известными в данной области, например, используя коммерчески доступный люминометр.

Клетки, экспрессирующие как фотобелок, так и рецептор, вовлеченный в мобилизацию внутриклеточного кальция, можно использовать для тестирования молекул-кандидатов в отношении их влияния на модулирование рецептора. Химерный фотобелок согласно изобретению можно использовать во множестве основанных на клетках функциональных анализов, в которых используют измерение внутриклеточного кальция, чтобы оценить активность белков, в частности, рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR), и ионных каналов плазматической мембраны. Хотя большое и быстрое увеличение внутриклеточной концентрации кальция после стимуляции GPCR и ионных каналов можно выявить различными репортерами, такими как чувствительные к кальцию флуоресцирующие красители, применение биолюминесцентных фотобелков [22] предпочтительно, так как их фоновое свечение практически отсутствует, в отличие от флуоресцирующих красителей; кроме того, измерение кальция с помощью фотобелков, кроме продуцирования быстрых сигналов, дает высокое отношение сигнала к шуму с широким диапазоном чувствительности регистрации [22, 23]. Основанные на клетках функциональные анализы обычно заключаются в добавлении соответствующего агониста к культуре клеток, экспрессирующих как GPCR или ионные каналы, так и фотобелок, и затем определении какого-либо изменения концентрации кальция, например, увеличения содержания кальция, индуцированного либо быстрым притоком из внеклеточной среды, либо высвобождением из внутриклеточных запасов (18), посредством измерений активности фотобелка.

Применение клеток, которые экспрессируют как фотин, так и рецептор, вовлеченный в модулирование внутриклеточной концентрации кальция, обеспечивает эффективную систему для скрининга соединений в отношении их влияния на высвобождение внутриклеточного кальция. Высокопроизводительные скрининговые анализы также могут быть выполнены с использованием фотобелка согласно изобретению в качестве репортерной системы. Чувствительность системы, а также высокое отношение сигнала к шуму позволяет использовать небольшие объемы для анализа.

В следующем варианте фотобелок согласно изобретению конъюгируют с молекулой, представляющей аналитический, диагностический или терапевтический интерес, и конъюгированный продукт используют в конкурентном твердофазном иммуноанализе, чтобы определить количество данной молекулы в биологических образцах. Например, фотобелок может быть химически конъюгирован с гормональным белком и использован в твердофазном иммуноанализе со специфичными в отношении гормона антителами, чтобы определить уровни гормона в слюне [24]. В еще одном варианте получают слитый продукт между фотобелком согласно изобретению и другим (поли)пептидом, таким как гормон, антигенный пептид, легкая или тяжелая цепь иммуноглобулина, авидин, стрептавидин или белок A, известными способами генетической инженерии, которые описаны в патенте US6087476 (который включен в данное описание в виде ссылки), и используют в способах иммунодиагностики или визуализации.

Следующие примеры иллюстрируют изобретение более подробно.

Описание чертежей

Фиг.1. Индуцированная кальцием биолюминесценция новосинтезированных фотобелков. Фотобелки транслировали в бесклеточной системе зародышей пшеницы в присутствии коэлентеразина. Все аликвоты смеси для трансляции инкубировали в течение 2 час в темноте при 30°C. В реакционную смесь добавляли CaCl₂ 50 мМ и регистрировали люминесценцию в течение 10 секунд.

Фиг.2. Трансляция ДНК фотобелков в присутствии коэлентеразина с измерением люминесценции при разбавлении реакционной смеси. AQ: экворин, PH: фотин, OB: обелин.

Фиг.3. (A) Зависимое от дозы АТФ испускание света при стимуляции эндогенного рецептора АТФ, экспрессированного клеткой CHO-K1, трансфицированной ДНК фотина. Трансфекцию клеток, сбор и экспрессию фотина осуществляли, как описано в примере 1. Клетки обрабатывали двумя разными концентрациями АТФ. (B) Клетки CHO-K1, трансфицированные ДНК обелина, использовали в качестве позитивного контроля. Люминесценцию выражали в RLU (относительные единицы света).

Фиг.4. Дозозависимая кривая активности фотина в клетках CHO-K1, трансфицированных как рецептором эндотелина A, так и фотином. Рецептор активировали инъекцией эндотелина в концентрации 100 и 500 нМ.

Фиг.5. Дозозависимая кривая, полученная на основе клеток, экспрессирующих фотобелок фотин и рецептор ваниллоида 1 крыс (VR1). Специфичный агонист капсаицин использовали в концентрации 10 и 50 мкМ.

ПРИМЕРЫ

1. Транскрипция/трансляция in vitro ДНК фотобелка

Трансляцию фотобелков осуществляли в бесклеточной системе зародышей пшеницы (набор TNT, Promega), следуя общим инструкциям поставщика. Для каждой реакционной смеси для транскрипции/трансляции in vitro использовали примерно 2 мкг ДНК. Объем для трансляции (50 мкл) содержал 25 мкл экстракта зародышей пшеницы, 2 мкл буфера реакции, смесь аминокислот, за исключением метионина, РНазин и коэлентеразин (40 мкМ), полимеразу T7. Смесь содержала также ³⁵S-метионин (удельная активность 1000 Ки/ммоль). ³⁵S-метионин использовали для определения количества фотобелка, синтезированного in vitro. С этой целью 5 мкл из каждого образца смеси для трансляции осаждали ТХУ на льду в течение 30 мин, фильтровали, промывали холодной 5% ТХУ, метанолом, сушили и помещали во флаконы для счета.

Количества фотина и обелина, полученные в бесклеточной системе, показаны в таблице I.

Таблица I Включение радиоактивной метки в продукты трансляции фотобелков
Добавленная ДНК	Обелин (1 мкг)	Фотин (1 мкг)	Экворин (1 мкг)
35S-счет после 90-мин трансляции (имп./мин)	8169	8290	13049

2. Анализ фотобелка

5 и 10 мкл смеси для трансляции непосредственно смешивали с 95-90 мкл раствора PBS в 96-луночном планшете, который устанавливали в люминометре (Berthold). Чтобы запустить испускание света фотобелком, в лунку инъецировали 50 мкл раствора (50 мМ CaCl₂) и регистрировали люминесценцию в течение 10 секунд.

Результаты трансляции in vitro ДНК фотина, обелина и экворина показаны на фиг.1. Измерения люминесценции, полученные при разведении реакционных смесей для трансляции фотобелка in vitro, показаны на фиг.2. Сравнение данных люминесценции со счетом ТХУ-нерастворимых фракций, полученных в ходе трансляции с разными количествами ДНК фотина и обелина, показаны в таблице II (измеренная люминесценция пропорциональна количеству новосинтезированного фотобелка).

Таблица II Содержание радиоактивно меченного фотобелка и его люминесценция в смеси для трансляции
Обелин			Фотин
ДНК (нг)	Счет в ТХУ (имп./мин/мкл)	Люминесценция (RLU/мкл)	Счет в ТХУ (имп./мин/мкл)	Люминесценция (RLU/мкл)
250	2722	358944	2927	990308
125	2396	271952	2094	858046
63	1030	139241	807	339348
31	579	41970	502	88326
16	265	13482	196	30617

3. Примеры основанных на клетках функциональных анализов

3.1. Экспрессирующие фотин клоны получали путем трансфекции клеток CHO-K1 (материалы и способы). Через два дня после трансфекции клетки обрабатывали трипсином и разводили в 10 или 100 раз. После того как клетки вырастали до хорошо изолированных колоний, колонии переносили на новые чашки и проводили селекцию на основе их функционального ответа (люминесцентного сигнала) на разные концентрации АТФ, который, как известно, стимулирует эндогенный рецептор CHO и повышает концентрацию Ca⁺⁺ в цитоплазме. В конце каждого эксперимента клетки лизировали путем перфузии раствором, содержащим тритон X-100 и CaCl₂ . Активный фотобелок реконструировали, инкубируя клетки с 10 мкМ коэлентеразина, разбавленного в PBS, содержащем 2 мМ кальций, в темноте при 37°C в атмосфере с 5% CO₂ в течение 3 час. Для измерения испускания света клетки лизировали в присутствии кальция и регистрировали испускаемую люминесценцию. Количество фотонов, испускаемых в течение 10 секунд, интегрировали люминометром и визуализировали на экране. Клетки, трансфицированные пустой плазмидой или нетрансфицированные (данные не показаны), не увеличивали испускание фотонов. Чтобы выявить изменения в концентрациях кальция, инъецировали 10, 50 и 100 мкМ АТФ и определяли кинетику ответа на кальций. Полученная кривая показана на фиг.3 (A). Линию клеток, экспрессирующих фотобелок обелин, использовали в качестве позитивного контроля, фиг.3 (B).

3.2. Создали линию клеток CHO, экспрессирующих рецептор эндотелина A и фотин. При стимуляции агонистом данный рецептор индуцирует увеличение внутриклеточной концентрации кальция, которую измеряют по люминесценции фотина. Клетки культивировали в виде монослоя в среде DMEM/F12, содержащей 10% фетальной сыворотки теленка (FBS), в 96-луночном планшете. В день эксперимента культуральную среду удаляли и клетки инкубировали в присутствии 10 мкМ коэлентеразина в PBS в течение по меньшей мере 3 час. Пептид эндотелина разбавляли в PBS при концентрации 100 и 500 нМ. Примерно 50 мкл эндотелина инъецировали в каждую лунку и измеряли ответ. Испускаемый свет сразу же регистрировали в течение периода времени 30 секунд. Зависимый от дозы ответ на эндотелин показан на фигуре 4.

3.3. Линии клеток CHO, экспрессирующие как апофотин, так и рецептор капсаицина VR1 - проницаемый для кальция ионный канал - выращивали до слияния на 80-95% во флаконах для культуры ткани и собирали при обработке трипсином. Клетки распределяли по 10000 клеток/лунку в 96-луночные белые планшеты в среде роста и инкубировали в течение ночи при 37°C в увлажненном инкубаторе при 5% CO₂. Для экспериментов по люминесценции к клеткам добавляли коэлентеразин 10 мкМ на 3 час при 37°C, 5% CO₂. Кальциевый ответ стимулировали добавлением 10 и 50 мкМ капсаицина в каждую лунку. За кинетикой люминесцентных вспышек следили, используя Labsystem Luminoskan Ascent, который осуществляет инъекции реагентов и регистрацию испускания света из каждой отдельной лунки. Добавление капсаицина вызывало быстрый и кратковременный люминесцентный сигнал в течение 30 секунд с пиковым уровнем, имеющим место примерно в точке 10 секунд (фигура 5).

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Реагенты

Ферменты рестрикции приобретали у New England Biolabs и использовали согласно инструкциям поставщика. РНазин и набор TNT для транскрипции и трансляции in vitro были от Promega (Madison, WI). Полимераза Pfu Turbo, реагенты для ПЦР и компетентные клетки штаммов E. coli XL-1Blue и BL21 были от Stratagene (La Jolla, CA). Олигонуклеотиды приобретали у Primm (Milan). Коэлентеразин был от Prolume Ltd. (Pittsburg, PA). Все другие химические вещества были из стандартных источников и были чистыми для анализа или лучшего качества.

ПЦР-сборка для синтеза последовательностей ДНК обелина в одну стадию

Для ПЦР-сборки необходимо четыре стадии: синтез олигонуклеотидов, сборка гена, амплификация гена и клонирование. Авторы синтезировали 30 олигонуклеотидов длиной 40 нуклеотидов, которые вместе кодируют обе нити последовательности гена обелина. Перекрывание комплементарных олигонуклеотидов составляло 20 нуклеотидов. Равные объемы, взятые из каждого раствора 30 олигонуклеотидов, объединяли до конечной концентрации примерно 250 мкМ смешанных олигонуклеотидов перед 250-кратным разведением в 20 мкл смеси для ПЦР Geneamp XL (Perkin Elmer). Процесс амплификации осуществляли в три стадии. Первую стадию проводили с объединенными олигонуклеотидами следующим образом: 40°C в течение 2 мин, затем добавление полимеразы, 72°C в течение 10 сек, затем 40 циклов (94°C в течение 15 сек, 40°C в течение 30 сек и 72°C в течение 10 сек). Реакционную смесь разводили в три раза свежей смесью для ПЦР и полимеразы. Вторая стадия представляла собой 25 циклов (94°C в течение 15 сек, 40°C в течение 30 сек и 72°C в течение 45 сек). Реакционную смесь снова разбавляли в три раза в полной смеси для ПЦР. Условия для третьей стадии представляли собой 20 циклов (94°C в течение 15 сек, 40°C в течение 30 сек и 72°C в течение 70 сек). Продукты реакции анализировали путем электрофореза в 1% агарозном геле и отдельные фрагменты клонировали в векторе pcrBlunt для дальнейших стадий клонирования. Плазмида была названа pcr-OB. Точность реакций ПЦР подтверждали дидезокси-секвенированием.

Конструирование химерного белка

Четыре пары олигонуклеотидов были сконструированы на основе последовательности гена клитина. Область между EF-рукой I и EF-рукой II была выбрана для химеризации гена. Олигонуклеотидные праймеры представляли собой следующее:

Отожженные олигонуклеотиды клонировали в уникальных NdeI/MunI-сайтах в векторе pcr-OB. Плазмида, содержащая химерный генный продукт, названа pcr-Photin. ДНК фотина была далее субклонирована в векторе pcDNA3, который содержит промотор T7.

Основанное на ПЦР изменение использования кодонов

Способ удлинения перекрывающихся участков на основе ПЦР использовали для получения мутанта обелина. Конструировали шесть пар праймеров с десятью различными точковыми мутациями, которые создают изменения использования десяти различных кодонов. Чтобы амплифицировать фрагменты ДНК, используемые для удлинения перекрывающихся фрагментов, осуществляли реакции ПЦР с 2,5 единицами полимеразы Pfu, 50 нг матрицы ДНК, 250 мкМ каждого dNTP и 50 пмоль каждого праймера в общем объеме 100 мкл. Параметры используемого цикла представляли собой 94°C в течение 1 мин, 45°C в течение 1 мин и 72°C в течение 1 мин 30 сек в ходе первых 10 циклов, с последующими 20 циклами с температурой отжига 50°C. Сайт-специфические мутации подтверждали посредством секвенирования ДНК, выполненного в Primm (Milan). Все молекулярные способы осуществляли, используя стандартные протоколы.

Культура клеток CHO

Все клетки культивировали в стандартных влажных условиях при 37°C и 5% CO₂. Клетки CHO поддерживали в DMEM/F12 + FBS 10% + пен./стрепт. + G418 0,5 мг/мл + пируват 1,6 мМ + NaHCO₃ 0,2%, все реагенты от Life Technologies. Трансфекцию ДНК осуществляли, когда клетки были выращены на чашках до слияния на 70-80%.

ССЫЛКИ

1. Kendall, J.M., and Badminton, M.N. (1998). Aequorea victoria bioluminescence moves into an exciting new era. Trends Biotechnology. 16(5):216-24.

2. Campbell, A. K., Hallet, R.A., Daw, M.E., Ryall, R.C., Hart and Herring P.J. (1981). Application of the photoprotein obelin to the measurement of free Ca ⁺⁺ in cells. In Bioluminescence and Chemiluminescence, basic Chemistry and Analytical applications (Edited by M.A. deLuca and W. D. McElroy), pp. 601-607. Academy Press, New York.

3. Herring, P.J. (1979) Some features of the bioluminescence of the radiolarian Thalassicola sp. Mar. Biol. 53, 213-216.

4. Shimomura, O., Johnson F.H., and Saiga, Y (1962) Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 59, 223-239.

5. Shimomura, O., Johnson F.H., and Saiga, Y (1963) Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62, 1-8.

6. Morin, J.G. and Hastings J.W. (1971) Biochemistry of the bioluminescence of colonial hydroids and other coelenterates. J. Cell. Physiol. 77, 305-311.

7. Shimomura, O., Johnson, F.H. and Saiga, Y. (1963) Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan Halistaura. J. Cell. Physiol. 62, 9-15.

8. Shimomura, O., and Shimomura, A. (1985) Halistaurin, phialidin and modified forms of aequorin as Ca⁺⁺ indicator in biological systems. Biochem. J. 228, 745-749.

9. Levine, L.D., and Ward, W.W. (1982) Isolation and characterization of a photoprotein "phialidin" and a spectrally unique green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish Phialidium gregarium. Comp. Biochem. Physiol. 72B, 77-85.

10. Morin, J.G. and Hastings (1971) Energy transfer in a bioluminescent system. J. Cell. Physiol. 77, 313-318.

11. Campbell, A.K. (1974) Extraction, partial purification and properties of obelin the calcium-activated protein from the hydroid Obelia geniculata. Biochem. J. 143, 411-418.

12. Ward, W.W. and Selinger (1974) Extraction and purification of calcium-activated photoprotein from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Bern ovata. Biochemistry 13, 1491-1499.

13. Ward, W.W. and Seliger H.H. (1974) Properties of mnemiopsin, and berovin, calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroë ovata. Biochemistry 13, 1500-1510.

14. Johnson, F.H. and Shimomura, O. (1978) Introduction to the bioluminescence of medusae, with special reference to the photoprotein aequorin. Methods Enzymol. 57, 271-291.

15. Illarionov BA, Bondar VS, Illarionova VA, Vysotski ES. Sequence of the cDNA encoding the Ca⁺⁺-activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima. Gene. 1995 14; 153(2):273-4.

16. Blinks, J.R., Weir, W.G., Hess, P. and Prendergast, F.G. (1982). Measurement of Ca⁺⁺ concentrations in living cells. Prog. Biophys. Mol. Biol. 40, 1-114.

17. Markova SV, Vysotski ES, Blinks JR, Burakova LP, Wang BC, Lee J., (2002) Obelin from the bioluminescent marine hydroid Obelia geniculata: cloning, expression, and comparison of some properties with those of other Ca2+-regulated photoproteins. Biochemistry. 2002 Feb 19; 41(7):2227-36.

18. Button D, Brownstein M. (1993) Aequorin-expressing mammalian cell lines used to report Ca⁺⁺ mobilization. Cell Calcium. Oct; 14(9):663-71.

19. Mattheakis, L., and Ohler, L.D. (2002) Seeing the light: Calcium imaging in cells for drug discovery. Drug Discovery Today S, 15-19.

20. Stables J, Green A, Marshall F, Fraser N, Knight E, Sautel M, Milligan G, Lee M., Rees S. (1997). A bioluminescent assay for agonist activity at potentially any G-protein-coupled receptor. (1997) Anal Biochem 1; 252(1):115-26.

21. Brini M., Pinton P., Pozzan Т., Rizzuto R. (1999). Targeted recombinant aequorins: tools for monitoring Ca⁺⁺ in the various compartments of a living cell. Microsc. Res. Tech. 46, 380-389.

22. Creton R., Kreiling J.A., Jaffe LF. (1999) Calcium imaging with chemiluminescence. Microsc. Res. Tech. 46, 390-397.

23. Shimomura, O. et al. (1993) Light-emitting properties of recombinant semi-synthetic Aequorins and recombinant fluorescin-conjugated Aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium 14, 373-378.

24. Mirasoli, M. et al. (2002) Bioluminescence immunoassay for cortisol using recombinant aequorin as a label. Analytical Biochemistry 306, 204-211.