коллагеновые материалы, пленки и способы их изготовления

Формула изобретения

1. Пленка, содержащая, по крайней мере, один коллагеновый слой, поверхность которого образована множеством доменов с преобладающей ориентацией коллагеновых волокон в каждом домене и непрерывным изменением ориентации волокон от одного домена к другому, где на границе упомянутых доменов расположены поры.

2. Пленка по п.1, отличающаяся тем, что является монослоем.

3. Пленка по п.1, отличающаяся тем, что дополнительно содержит, по крайней мере, один функциональный слой.

4. Пленка по п.3, отличающаяся тем, что упомянутый функциональный слой выбран из группы: липидной мембраны, коагулянта, слоя клеток живой ткани, адгезионного слоя, подложки, защитного слоя.

5. Пленка по п.1, отличающаяся тем, что упомянутые поры являются сквозными и ориентированы по нормали к плоскости коллагенового слоя.

6. Пленка по п.1, отличающаяся тем, что упомянутые поры заполнены веществом, выбранным из группы: гидрогель, биоматериал на основе пептидов, клетки живой ткани, встроенные лиганды, инкапсулированные ДНК, факторы роста.

7. Пленка по п.1, отличающаяся тем, что коллагеновый слой содержит металлические нанопроволоки или углеродные нанотрубки.

8. Пленка по п.1, отличающаяся тем, что волокна упакованы в пучки, причем одно волокно включено в, по крайней мере, два пучка.

9. Пленка по п.8, отличающаяся тем, что ориентация директоров упомянутых пучков волокон изменяется случайным образом от 0 до 360° по всему слою.

10. Пленка по п.1, отличающаяся тем, что коллагеновый слой дополнительно содержит вихреобразные домены.

11. Пленка по п.9, отличающаяся тем, что внутри вихреобразных доменов расположены поры, расстояние между центрами которых лежит в пределах от 500 нм до 20 мкм.

12. Пленка по п.11, отличающаяся тем, что поперечные размеры пор лежат в пределах от 100 нм до 20 мкм.

13. Пленка по п.11, отличающаяся тем, что глубина упомянутых пор не меньше 50 нм.

14. Пленка по п.8, отличающаяся тем, что межцентровое расстояние между упомянутыми пучками лежит в пределах от 50 нм до 5 мкм.

15. Пленка по п.1, отличающаяся тем, что коллагеновый слой является трехмерной матрицей, образованной доменами.

16. Пленка по п.15, отличающаяся тем, что дополнительно содержит анизотропную подложку с углом наклона более 2°.

17. Пленка по п.16, отличающаяся тем, что упомянутая подложка покрыта жидкокристаллическим материалом.

18. Пленка по п.16, отличающаяся тем, что упомянутая подложка имеет текстуру.

19. Способ изготовления пленки по пп.1-18, включающий следующие этапы:

приготовление ЖК раствора коллагена;

приложение к коллагеновому раствору сдвигающего усилия для формирования однородного слоя, при скорости сдвига не менее 100 с^-1;

высушивание полученного слоя.

20. Способ по п.19, в котором этап приложения сдвигающего усилия осуществляют через систему шлицевой экструзии при скорости сдвига не менее 1000 с^-1.

21. Способ по п.19, в котором сдвигающее усилие формируют путем относительного перемещения двух пластин, расположенных параллельно с зазором от 0 до 50 мкм, при этом коллагеновый раствор размещается между ними.

22. Способ по п.19, в котором сдвигающее усилие формируют путем перемещения жидкопленочного аппликатора, содержащего:

(i) по меньшей мере два продольных боковых элемента, имеющих форму параллельных клиновидных рельсов, основания которых находятся в одной плоскости с подложкой;

(ii) поперечный элемент, имеющий форму моста между упомянутыми боковыми элементами, причем поперечный элемент имеет, по крайней мере, одну плоскую поверхность и находится в контакте с каждым упомянутым рельсом в, по крайней мере, одной точке; и

(iii) зажимную систему, обеспечивающую точную фиксацию моста в любом заранее заданном положении на упомянутых рельсах, при этом мост может перемещаться вдоль обоих рельсов, так что плоская поверхность моста образует некоторый постоянный двугранный угол от 0 до 10 угловых минут с плоскостью подложки, а зазор между упомянутой плоской поверхностью и плоскостью подложки имеет величину от 0 до 50 мкм.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к коллагеновым материалам, пленкам и способам их изготовления и использования. В частности, оно направлено на создание коллагеновых пленок с биологически подобной пространственной структурой («тканый или плетеный узор»).

Коллаген - основной белок в составе человеческого тела, на его долю приходится примерно 30% от общей массы белков. Сегодня известно около 20 типов коллагена, отличающихся друг от друга по своей структуре, химическому составу и месту локализации в организме. По морфологическим характеристикам их принято делить на 4 группы: фибриллярные коллагены (I, II, III, V и XI типа); сетчатый коллаген (IV типа) в составе базальной мембраны; нитевидный коллаген (VI типа) и связанные с фибриллами коллагены (IX, XII и XIV типа), обеспечивающие взаимодействие коллагена с другими компонентами дермального матрикса. Самым распространенным является коллаген первого типа (здесь и далее «коллаген I»). Он присутствует в значительном количестве в коже, сухожилиях, костях, роговице глаза и других органах. Волокна коллагена I характеризуются периодичностью 67 нм, иммунореактивностью к специфическим антителам и окрашиванием определенными красителями. Коллагеновая фибрилла служит в качестве одного из важнейших строительных элементов у животных, где прочность отдельной коллагеновой молекулы напрямую связана со структурной целостностью и прочностью ткани.

Фибриллы коллагена I являются существенными компонентами кожи, сухожилий, связок, роговицы глаза, где их основные свойства обеспечивают выполнение специальных биомеханических и структурных функций и позволяют играть значительную роль в механотрансдукторной сигнализации. Многие из этих свойств вытекают из структурной организации в фибрилле: первичная структура этого белка характеризуется многократным повтором трех аминокислот, чаще всего - глицина - пролина - оксипролина. Благодаря этому в физиологических растворах такая цепочка скручивается в левую спираль, на каждый виток которой приходится 3 аминокислоты (вторичная структура белка). Три полипептидные цепочки объединяются в единую правозакрученную суперспираль, формируя характерную третичную структуру коллагена, стабилизированую водородными и ковалентными дисульфидными связями. Все эти процессы происходят внутри клеток - фибробластов на эндоплазматическом ретикулуме. Здесь же осуществляется гликозилирование: к остаткам аминокислоты гидроксилизина присоединяются моносахара (глюкоза или галактоза). Таким образом, происходит синтез проколлагена, который секретируется во внеклеточный матрикс. При участии ферментов - пептидаз - происходит отщепление концевых участков молекулы и образуется тропоколлаген. Его молекула имеет трехспиральную структуру, длина которой 300 нм, а молекулярная масса составляет 300 кДа. В соединительной ткани происходит самосборка молекул тропоколлагена в надмолекулярные структуры - фибриллы, которые затем могут объединяться в волокна, упрочняющиеся за счет внутри и межмолекулярных поперечных связей. Этот процесс иллюстрируется на фиг.1 и в сообщении M.J.Buehler, Proc Natl Acad Sci US 103, 12285-12290, 2006.

Коллаген I представляет собой широкораспространенный в животном мире белок, который обеспечивает опору клеткам, придает прочность и упругость коже, костям и сухожилиям. Поэтому не удивительно, что коллаген I часто используется в качестве биоматериала для многих медицинских применений, в том числе для ранозаживления, наращивания кожи, как шовный материал, искусственная кожа и т.д. Однако наука воссоздания структурированного коллагена для использования в биоматериалах еще только развивается. Множество проведенных вплоть до сего дня исследований позволили накопить обширный опыт применения различных типов коллагеновых препаратов. Эти эксперименты продемонстрировали, что коллаген I можно имплантировать в различные органы и это не приводит к иммунологическому отторжению. К безусловным достоинствам можно также отнести высокую биосовместимость таких материалов, способность к регулируемой деградации. Причем экзогенный коллаген является не только формообразователем, транспортной средой для лекарственных средств, но и сам обладает биологической активностью, стимулируя репаративные процессы.

Известны методы получения растворов коллагена из кожи и сухожилий разных животных или из человеческой кожи (трупный или хирургический материал) и формования из него волокна для хирургического применения.

Профессор Шмитт (Schmitt F.O.) и его группа, работавшие в Массачусетском технологическом институте во время второй мировой войны, исследовали использование коллагенового шовного материала и коллагеновых листов для покрытия раневых участков на коже. Они также начали изучение использования коллагеновых трубок для восстановления нервов. С тех пор коллагеновый шовный материал хорошо зарекомендовал себя, обладая лучшими свойствами, чем кетгут.

Коллаген I может осаждаться из раствора отливкой, лиофилизацией, электропрядением и другими известными в технологии способами. При этом могут быть получены коллагеновые волокна всевозможных диаметров (от микронного до нанометрового диапазона) и различной длины. Формируемая из переплетенных волокон «ткань» является хорошей подложкой для фиксации и роста клеток. Благодаря малым диаметрам электропряденых волокон ожидается, что они могут демонстрировать свойства, весьма отличные от их традиционных аналогов, встречающихся в природе (Belamie Е. et al. J. Phys. Condens. Matter, 2006, 18, 115-129).

Вскоре после открытия в 1888 году жидких кристаллов, они были выбраны в качестве наиболее подходящей модели для понимания механизма, посредством которого природа формирует живые структуры из гомогенных смесей множества веществ. Поскольку жидкие кристаллы проявляют «поразительную форму самоорганизации, в которой направленный порядок возникает в гомогенной жидкости самопроизвольно, а не постепенно, как при росте кристаллов слой за слоем на поверхности, но одновременно по значительному объему».

Жидкий кристалл представляет собой состояние вещества, которое является промежуточным между кристаллическим твердым телом и аморфной жидкостью. Существует три основные фазы жидких кристаллов, известные как смектическая фаза, нематическая фаза и холестерическая фаза (Фиг.2а-2с). Фиг.2а иллюстрирует смектическую фазу, в которой присутствует одномерный трансляционный порядок, а также ориентационное упорядочивание молекул в каждом слое. Фиг.2b иллюстрирует нематическую фазу, в которой присутствует только дальний ориентационный порядок. Холестерическая фаза также относится к нематическим ЖК с молекулами, уложенными параллельно друг другу в каждой плоскости, но при переходе к последующей плоскости их длинные оси поворачиваются на некоторый постоянный угол так, что они образуют спирали (Фиг.2с, Фиг.3 и Фиг.4а-4b). Холестерическая фаза является хиральной формой нематической фазы. (Хиральность - это свойство объекта не совпадать со своим зеркальным изображением). «Скрученная слоистая модель», показанная на Фиг.3, иллюстрирует организацию молекул в холестерической структуре. Эта модель объясняет формирование типичных дуговых узоров, наблюдаемых при сечении клеток и биологических тканей. Эти узоры являются следствием слоистой скрученной ориентации молекул (а не реального искривления волокон). Модель построена следующим образом: направления молекул представлены параллельными и эквидистантными прямыми линиями на ряде прямоугольников с ориентацией этих линий, повернутой от одного прямоугольника к последующему на малый, постоянный угол. В структуре существует периодичность, когда каждый поворот направлений молекул на 180° соответствует половине холестерического шага Р/2. Поворот выбран с левым вращением (против часовой стрелки), поскольку именно такое направление поворота обнаружено во всех изученных до сих пор биологических материалах. Холестерическая ось определяется правилом левой руки (пальцы сжатого кулака левой руки показывает направление поступательного движения скрутки, а вытянутый большой палец левой руки указывает положительное направление холестерической оси). На наклонных сторонах пирамиды непосредственно видны узоры в виде рядов параллельных дуг, вставленных одна в другую. В биологических системах эта конкретная геометрия зачастую описана как скрученная слоистая структура.

В жидких кристаллах и их биологических аналогах обнаружены два основных типа скрутки, которые определяются расположением фибриллярных элементов либо в параллельных плоскостях (планарная скрутка), либо в коаксиальных цилиндрах (цилиндрическая скрутка) (Фиг.4). Цилиндрическая скрутка описываются так же, как винтообразная. Во вторичных остеонах костной ткани наблюдается винтообразное строение коллагена, подобно расположению целлюлозы в стенках растительных клеток.

Необходимость формирования структурированных пленок на основе коллагенов требует разработки новых методов. Один из таких методов, о котором сообщалось недавно, предусматривал использование струйного принтера, с инжектированием чрезвычайно малых капелек краски при печати. Исследователи надеются, что созданная технология печати будет способна высевать живые клетки с микрометровым разрешением в компоновках, аналогичных биологическим тканям. Этот способ был описан в Nakamura М. et al., Tissue Engineering, 11:1659-1666 (2005), где авторы использовали биосовместимую струйную головку и исследовали осуществимость микровысевания живых клеток. Живые клетки легко повреждаются нагревом, поэтому они использовали струйную систему с электростатическим приводом, которая была способна инжектировать краску без выделения значительного тепла. Клетки бычьего сосудистого эндотелия были приготовлены и суспендированы в питательной среде. Эта клеточная суспензия, использованная в качестве «краски», инжектировалась на диски для культивирования. Наблюдение под микроскопом показало, что клетки эндотелия располагались в инжектированных каплях, и число клеток в каждой капле зависело от выбранной концентрации клеточной суспензии и частоты инжектирования. После инкубации в течение несколько часов, клетки приращивались к дискам для культивирования. Хотя первоначальные разработки были завершены, данный метод не нашел широкого применения. Он отчасти пригоден для доставки материала (к примеру, клеток) в конкретное место, но не позволяет создавать и фиксировать структуру материала.

Все существующие способы формирования коллагеновых пленок на сегодняшний день имеют ряд ограничений, главное из которых невозможность устойчивого формирования структур, подобных природному коллагену. Например, способы электропрядения и отливки не могут устанавливать дальнюю ориентацию. Основанные на коллагенах пленки не могут повторить природные полукристаллические структуры внеклеточного матрикса живых биологических систем. Другие способы, подобные, например, способу Ленгмюра-Блоджетта, имеют ограниченные возможности по ориентации фибрилл и слабую воспроизводимость. Поэтому имеется значительная потребность в новых материалах на основе коллагенов, имитирующих живые биологические структуры, и надежных способах производства таких материалов.

Для ясного понимания сути настоящего изобретения ниже приведены основные термины, используемые в описании:

ДОМЕН представляет собой область, содержащую стержневидные коллагеновые волокна, выровненные параллельным образом (Фиг.5, позиция 105);

ДИРЕКТОР - это направление, вокруг которого в основном ориентированы стержневидные волокна (Фиг.5, позиция 108);

ПОРЫ - углубления в коллагеновом слое; есть неглубокие поры (чашевидные образования) (Фиг.5, позиция 107) наподобие рвов, лежащие на границе доменов; и глубокие поры (Фиг.5, позиция 106), лежащие внутри вихреобразных доменов (Фиг.5, позиция 104);

ПУЧКИ ВОЛОКОН (Фиг.5, позиция 102) - образования, сформированные из слияния и переплетения стержневидных волокон; ориентацию пучков можно охарактеризовать директором;

ПОПЕРЕЧНО СВЯЗАННЫЕ ВОЛОКНА (Фиг.5, позиция 110) - это волокна, отходящие от одного пучка и соединяющиеся с другим;

ПРЕОБЛАЮАЩАЯ ОРИЕНТАЦИЯ ДОМЕНА (Фиг.5, позиция 110) - направление, соответствующее усредненной ориентации волокон в домене.

Настоящее изобретение направлено на создание пленок ориентированного коллагена, в которых волокна образуют «тканый узор» (или «плетеный узор») наподобие пространственных структур коллагена в живом организме. Такая пленка содержит, по крайней мере, один коллагеновый слой, поверхность которого образована множеством доменов с преобладающей ориентацией коллагеновых волокон в каждом домене. Ориентации волокон непрерывно изменяются от одного домена к другому. На границе упомянутых доменов располагаются поры (чашевидные образования). При этом пленка может являться как монослоем, так и многослойной структурой.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения ориентация стержневидных волокон может непрерывно изменяться и внутри доменов (вихревые домены), и при переходе от одного домена к другому. Директор при этом меняет свое направление в пределах 360°. Например, в одном домене директор изменяет ориентацию в пределах от 25° до 210°, тогда как в соседнем домен ориентация директора может изменяться в пределах от 170° до 5°.

Способ изготовления пленки с биологическиподобной структурой коллагена включает этап приготовление ЖК раствора коллагена; приложения к коллагеновому раствору сдвигающее усилие для формирования однородного слоя, при скорости сдвига не менее 100 с^-1, и высушивание полученного слоя.

Раствор коллагена обычно готовят таким образом, чтобы он образовал нематическую ЖК фазу. Используют мономерный человеческий или бычий коллаген при концентрации от 20 мг/мл или выше, растворенный в кислой среде (например, при добавлении уксусной кислоты). Могут использовать и растворы с меньшей концентрацией коллагена 1-10 мг/мл, которые затем загущаются известными способами, например, диализом, до требуемой концентрации.

При изготовлении пленок в раствор могут добавляться серебряные нанопроволочки или углеродные нанотрубки, при этом концентрация коллагена остается такой же. После завершения процесса нанесения и сушки эти объекты оказываются включены в пространственную коллагеновую структуру.

В некоторых случаях коллагеновый слой является трехмерной матрицей, образованной доменами. При этом его готовят путем сдвиговой деформации раствора и высушивания на анизотропной подложке с контролируемым предварительным углом наклона (угол натирки) более двух градусов.

Сущность настоящего изобретения поясняется следующими чертежами:

на Фиг.1 показана схема, изображающая известную иерархическую структуру коллагена. Структурные признаки коллагена варьируются от аминокислотной последовательности, тропоколлагеновых молекул и коллагеновых фибрилл до коллагеновых волокон;

на Фиг.2а-2с представлена структуры жидких кристаллов в смектической (2а), нематической (2b) и холестерической (2с) форме, составленные из стержневидных структур;

на Фиг.3 представлена схема, изображающая скрученную слоистую модель биологической ткани;

на Фиг.4а, 4а¹, 4b, 4b¹ представлены скрученные структуры, причем:

(4а) - в планарной скрутке эквидистантные прямые линии, начерчены на горизонтальных плоскостях, а направление этих линий регулярно повернуто от плоскости к плоскости;

(4а¹ ) - в традиционном начертании для холестерической геометрии, приложенной к планарной скрутке, линии представляют молекулы в продольном направлении к плоскости чертежа, а точки представляют молекулы, перпендикулярные к ней; молекулы в наклонном положении представлены иглами, острия которых направлены к наблюдателю;

(4b) - в цилиндрической скрутке эквидистантные спирали начерчены на семействе цилиндров, а угол спиралей регулярно повернут от одного цилиндра к следующему.

(4b¹ ) - традиционное представление холестерической геометрии, приложенное к цилиндрической скрутке;

на Фиг.5 представлено изображение в атомно-силовом микроскопе (АСМ) коллагенового слоя, иллюстрирующее используемую терминологию;

на Фиг.6а-6с представлено изображение (АСМ) различных коллагеновых слоев изготовленных в соответствии с настоящим изобретением;

на Фиг.7 представлено изображение (АСМ) коллагеновой пленки на стекле, изготовленной согласно настоящему изобретению;

на Фиг.8а-8b представлено изображение (АСМ) коллагенового монослоя на стекле;

на Фиг.9 представлена трехмерная модель (АСМ) сканирования коллагеновой матрицы с разрешением 512×512 точек на площади 5 мкм × 5 мкм и при средней глубине шага 120 нм;

на Фиг.10 представлено изображение человеческих фибропластовых клеток, растущих на коллагеновой матрице, изготовленной согласно настоящему изобретению;

на Фиг.11а-11d представлены изображения (АСМ) коллагеновых слоев;

на Фиг.12а-12с представлены изображения (АСМ) коллагеновых слоев и соответствующие им гистограммы и таблица данных, иллюстрирующие их тополографические характеристики;

на Фиг.13 представлено теневое изображение (АСМ) коллагенового слоя, иллюстрирующее определение параметров пор.

Без ограничения настоящего изобретения, Фиг.5, 6а-6с, 7 и 8a, 8b иллюстрируют различные варианты структур коллагеновых материалов. Слой 100 коллагенового материала содержит пучки 102 волокон. Под «пучком волокон» здесь понимается структура, образованная смешиванием и сплетением стержневидных волокон 103 (Фиг.5).

В некоторых случаях пучки 102 волокон могут образовывать один или несколько вихреобразных доменов 104 и пор 106. В целом коллагеновый материал можно рассматривать как структуру, образованную множеством доменов 105. Под «доменом» 105 здесь понимается область «стержневидных волокон» 103. Домены 105 можно также рассматривать как гомогенный участок, ограниченный каналами, чашевидными образованиями, порами или иными дефектами. В некоторых случаях стержневидные волокна выровнены практически параллельно (в общем случае угол расхождения в домене не превышает 5°). Волокна в домене 105 можно охарактеризовать посредством одного или нескольких директоров 108. «Директор» 108 представляет собой вектор, вокруг которого предпочтительно ориентированы стержневидные волокна 103. В «переплетенных структурах» директора 108 случайно и практически равномерно распределены по 360 градусам. Под «вихреобразными доменами» 104 здесь подразумеваются структуры, сформированные примыкающими группами из множества доменов 105. Коллагеновый слой может включать в себя глубокие поры 106 и/или чашевидные образования 107 (неглубокие поры, ямки). Поры 106 и 107 могут быть окружены примыкающими группами доменов. В целом форма пор может быть любой, иногда они описываются эллипсом или кругом.

Например, как более подробно обсуждается ниже и как показано на Фиг.5, поры 106 представляют собой темные участки, выявляемые атомно-силовой микроскопией (АСМ). В некоторых вариантах осуществления вихреобразные домены 104 окружают поры 106. Чашевидные образования 107 находятся, как правило, рядом с пучками 102 волокон и имеют глубину, которая меньше глубины пор 106. В некоторых вариантах осуществления каждый вихреобразный домен 104 имеет также ориентацию, которую можно охарактеризовать директором 108, который меняет угловое направление по мере того, как он оплетает сердцевину. Преобладающая ориентация 109 домена представляет собой среднюю ориентацию волокон в домене.

Согласно настоящему изобретению коллагеновый слой 100 может состоять из перекрестно-связанных волокон 110. Под «перекрестно-связанными волокнами» здесь понимаются волокна 102, которые отходят практически ортогонально от пучка волокон до соединения с соседним пучком волокон таким образом, что волокно переходит из одного пучка в другой, образуя сетчатую структуру.

Помимо этого, возможно получение коллагенового материала, состоящего из многодоменной структуры со стержневидными волокнами, ориентированными практически параллельно друг другу в каждом домене. Ориентация доменов может непрерывно изменяться от одного домена к другому с некоторыми исключениями, если домены перекрываются. Этот коллагеновый материал имеет поры (или ямки), которые образуют сингулярные участки. Эти поры вызывают подобные смещению с поворотом или вихреобразные дефекты в поле направлений фибрилл.

Коллагеновый материал или слой можно охарактеризовать размером пор и расстояниями между порами. Поперечные размеры пор лежат в пределах от 50 нм до 5 мкм, обычно в пределах от 100 нм до 1 мкм.

Ориентация директора в пучках волокон может меняться случайным образом от 0 до 360 градусов по всей матрице, образованной коллагеном. Широкий диапазон изменчивости угловой ориентации директора является характеристикой «тканого» внешнего вида матрицы.

В некоторых вариантах осуществления межцентровое расстояние между соседними порами, которые лежат вблизи от центра вихреобразного домена, варьируются от 50 нм до 5 мкм, обычно от 200 нм до 1 мкм.

Расстояние между осями поперечно-связанных волокон лежит в пределах от 20 нм до 20 мкм, обычно от 50 до 200 нм.

В соответствии с настоящим изобретением из коллагенового материала с тканым узором могут в дальнейшем производить мембраны, монослои и многослойные структуры. Эти объекты представляют значительный интерес как с практической, так и теоретически-исследовательской точек зрения.

Пленки (монослойные, многослойные, трехмерные матрицы), приготовленные из коллагеновых материалов согласно настоящему изобретению, являются на настоящий день одними из самых интересных материалов с точки зрения как практического использования, так и теоретических изысканий. Прежде всего, такие пленки интересны для биомедецинских применений. Помимо прочего, поверхность этих пленок можно модифицировать в соответствии с различными приложениями.

Одним из объектов настоящего изобретения являются коллагеновые пленки, содержащие наностержни и нанопроволоки (например, углеродные нанотрубки или серебряные/золотые нанопроволоки) и прочие добавки (например, сульфоновые жидкие кристаллы) для изменения их оптических и электромагнитных свойств. Недавно в работе R.Valluzzi et al., Philosophical Magazine, 84:3439-3447 (2004) была приведена магнитоуправляемая система для микрообработки. Аналогичная система может быть использована для прикрепления магнитных частиц к коллагеновому материалу.

Формирования трехмерных коллагеновых матриц предполагает нанесение коллагеновой пленки на подложку с предварительно обработанной анизотропной поверхностью. Этот процесс аналогичен формированию предварительного угла наклона в жидкокристаллических дисплеях.

Коллагеновые пленки можно формировать на различных подложках: пластике (включая ПММА), пластмассе, стекле, металле или различных биологических материалах.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения коллагеновые материалы модифицируются путем включения в них гидрогелей, биоматериалов на основе пептидов и других биоактивных материалов, в том числе присоединенных лигандов, инкапсулированных ДНК и факторов роста. Например, такие белки, как фибронектин, способствуют прикреплению клеток к коллагену. Для получения желательной биологической активности могут быть присоединены посредством ковалентных связей различные синтетические пептиды, содержащие биологически активные аминокислотные последовательности. Различные протеогликаны, включенные в структуру коллагена, будут связывать различные факторы роста и усиливать желательные биологические свойства, в том числе восстановление и регенерацию тканей.

Способ изготовления

Настоящее изобретения включает способ изготовления коллагеновых материалов с биологически подобной структурой («тканым узором»). В частности, коллагеновую пленку формируют из раствора коллагена находящегося в ЖК фазе. Например, готовят раствор мономерного человеческого или бычьего коллагена I в кислой среде (растворе уксусной кислоты), при концентрации коллагена 20 мг/мл или выше. Во многих биологических системах коллагеновая матрица имеет жидкокристаллическую структуру. Это природное состояние коллагена, которое обеспечивает дальнюю ориентацию. Настоящий способ предполагает формирование нематической или холестерической фазы коллагена I за счет самосборки мономерного коллагена в кислом растворе при определенных концентрации и температуре (например: 20 мг/мл и 6°С). Особенностью предложенного способа является формирование и сохранение природной жидкокристаллической структуры коллагеноподобных материалов.

Жидкокристаллическое состояние коллагена может контролироваться различными способами: наблюдением типичного узора в материале между скрещенными поляризоционными пластинами; поляризоционной микроскопией; измерениями матрицы Мюллера; и поляриметрией (к примеру, поляриметром Axometrics). Показано, что высокие концентрации (5-30 мг/мл) проколлагеновых молекул в физиологическом буферном растворе способствуют формированию нематической и холестерической ЖК фазы в дальней зоне, с доменными структурами порядка 10 мкм² (R.Martin et al., J.Mol. Biol. 301:11-17 (2000)). Концентрации проколлагена в живом организме оцениваются в несколько десятков миллиграмм на миллилитр в секреторских везикулах, и зачастую наблюдается, что молекулы при этом выстраиваются в подобный нематическому порядок.

В случае необходимости коллагеновый раствор концентрируется различными известными из уровня техники способами, в том числе фильтрацией, роторным испарением и диализной мембраной. Подходящий коллагеновый материал можно также приготовить посредством ультразвуковой обработкой (как, например, это описано в работе Brown Е.М. et al. Journal of American Leather Chemists Association, 101:274-283 (2006)).

Обычно коллагеновую пленку формируют на подложке. Имеется несколько различных способов подачи раствора на подложку в зависимости от площади покрываемой поверхности, поперечных размеров покрытия и требуемой однородности.

Например, коллагеновый раствор может подаваться экструзией через иглу или капилляр со смещением в поперечном направлении. Однако при значительных поперечных размерах может нарушаться однородность покрытия в направлении сдвига. В этом случае бывает предпочтительней использовать шлицевую экструзию, известную из уровня техники (технология шлицевой экструзии описана в работах Chang Y.R. et al., Journal of Colloid and Interface Science 308:222-230 (2007), Paukshto M., et al, Journal of the SID 13:765-772 (2005), Fenell, L., et al, Asian Display /IDW'01:602-603, и в патентах США 4,299,789, 4,869,200 и 6,174,394).

Особенность настоящего изобретения состоит в том, что коллагеновые слои формируют путем приложения сдвигающего усилия. Такой способ обеспечивает определенное размещение коллагеновых фибрилл и способствует формированию необходимых узоров в получающихся коллагеновых пленках. Предпочтительно, чтобы скорость сдвига устройства, обеспечивающего приложение сдвигового усилия к раствору коллагена, была не менее 100 мм/сек. Раствор коллагена при этом находится в одном из жидкокристаллических состояний (предпочтительно в нематической фазе).

Для создания сдвигового усилия может быть использовано любое подходящее средство, известное из уровня техники. Например, это может быть устройство для шлицевой экструзии под давлением. Сначала готовят коллагеновый раствор с требуемой концентрацией коллагена, кислотностью, солевым составляющим и другими параметрами. Затем подают его под давлением через шлицевую головку на чистую поверхность подложки. Этим процессом можно управлять с помощью компьютера, чтобы гарантировать однородность покрытия, скорость нанесения и другие параметры.

Формировать коллагеновую пленку в соответствии с настоящим изобретением можно также с помощью специального устройства для формирования пленок из жидкой фазы, описанного в заявке US 60/860,230, от 21 ноября 2006. Такое устройство включает: устройство для формирования пленки (наносящую головку) и передающее устройство, предназначенное для закрепления наносящей головки и компенсации неровностей поверхности подложки. Дополнительно оно содержит подложкодержатель и средство, обеспечивающее прямолинейное относительное перемещение наносящей головки и подложки. Уникальность этого устройства заключается в возможности создавать большую площадь покрытия при высокой скорости нанесения и низком расходе материала, при этом одновременно с высокой точностью контролировать толщину покрытия и его оптические параметры (матрицу Мюллера, однородность, плоскостность и т.д.). Кроме того, важной особенностью этого устройства является достаточно протяженная область зоны сдвигового воздействия.

Другое устройство, позволяющее создать требуемое сдвиговое усилие, включает две параллельные пластины с ровной гладкой поверхностью (обычно из стекла). Коллагеновый материал наносят на первую пластину и накрывают его второй, создавая «сэндвич». Соответствующее усилие прикладывается для сжатия этих двух пластин вместе для создания необходимого зазора между ними. Затем пластины смещают относительно друг друга вдоль плоскости. Обычно используют плоские пластины, однако в случае необходимости пластины могут быть цилиндрически изогнутыми или иметь какую-нибудь иную непланарную топологию. В этом случае смещение осуществляют вдоль образующих поверхности.

Основными параметрами, которые влияют на ориентацию коллагена, являются: скорость сдвигающего усилия, толщина покрытия, гладкость сдвигающей пластины, поверхностная энергия сдвигающей пластины, концентрация коллагена и добавок, относительная влажность и температура, скорость высушивания и поверхностная обработка. Без ограничения общности коллагеновое покрытие формируют: при скорости сдвига в диапазоне от 0 до 1000 мм/с, обычно от 20 мм/с до 100 мм/с; зазор между наносящей поверхностью и подложкой составляет от 1 мкм до 50 мкм, обычно от 5 мкм до 30 мкм. Зона сдвига может быть относительно длинной, до 30 мм и более. В целом требуемые параметры процесса могут быть подобраны на основании эксперимента. Например, коллагеновые структуры, показанные на фиг.6а и 6b, были сделаны на двух разных скоростях покрытия - 200 мм/с и 60 мм/с соответственно с наносящим зазором - 5 мкм.

Предложенные здесь способы формирования пленки позволяют создать различные узоры ориентации коллагена (см., например, фиг.6а-6с) за счет относительно недорогого способа сдвига с чрезвычайно низким потреблением материала, что особенно важно при использовании уникальных биоматериалов. Сильно ориентированные структуры коллагена получают путем сдвига с высокой скоростью (до 1000 мм в секунду), на большой длине (до 30 мм) и с точно контролируемым зазором в диапазоне 1 мкм - 50 мкм. Дополнительную возможность для создания пленки с необходимой структурой дает управление процессом выравнивания и сушки при нанесении.

В случае необходимости коллагеновые слои могут быть сформированы поверх анизотропного слоя. Например, структура на фиг.6с была сформирована поверх анизотропного слоя с осью анизотропии, параллельной направлению нанесения.

Изучение результирующей ориентации коллагена показывает многодоменную структуру со стержневидными волокнами, ориентированными параллельно друг другу в каждом домене. Кроме того, ориентация доменов непрерывно изменяется в диапазоне углов от 0° и 360° от домена к домену. Структура имеет поры (или ямки), которые проявляются как окрашенные черным сингулярные участки. Эти поры вызывают дефекты в поле фибрилл, подобно смещению с поворотом или вихрям.

Аналогично описанному выше процессу за счет последовательных покрытий может быть создана многослойная структура. Эта многослойная структура может иметь различные функциональные слои, в том числе и коллагеновый слой, созданный в соответствии с настоящим изобретением. Подбирая адгезионные свойства первого слоя на подложке можно обеспечить легкое отслоение всей структуры и использование ее в качестве отдельной пленки.

Отдельную коллагеновую пленку с биологически подобной пространственной структурой («тканым узором») можно формировать бесконтактными способами типа шлицевой экструзии. Такой способ характеризуются: (1) высокой скоростью сдвига; (2) высоким (по сравнению с другими) потреблением текучего материала, за счет начального заполнения полости экструзионной головки и насоса коллагеновым раствором; (3) контролируемым размером зазора; (4) большой длиной зоны сдвига; и (5) возможностью контролируемого выравнивания и сушки в промышленных условиях.

Особое преимущество такого способа состоит в возможности формирования многослойных покрытий биологических материалов на гибких подложках по технологии «с рулона на рулон». Это позволяет наладить производство биологических материалов в недоступных ранее масштабах.

Полученные образцы исследовали с помощью АСМ (результаты представлены на Фиг.6а-6с). Повторные измерения с месячным интервалом показали устойчивость пленок, сформированных в соответствии с настоящим изобретением, и стабильность коллагеновых структур.

Все описанные выше способы позволяют создать различные узоры ориентированного коллагена при изменении параметров нанесения (смотрите, например, Фиг.6а-6с и Фиг.7-9). Типичный, подобный каракулю узор показан на Фиг.7. Он имеет очень несимметричную гистограмму с нулевым средним значением высоты и стандартным отклонением 254 А.

Для математического описания профиля распределения высоты коллагенового материала была использована методика, предложенная в J.M.Bennett and L. Mattson, Introduction to Surface Roughness and Scattering, OSA, Washington, D.C., 1999, 130 p. Этот тип распределения сравнивался с нормальным распределением. Нормальное распределение имеет то же самое среднее значение (которое равно нулю) и то же самое среднеквадратическое значение.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения коллагеновый слой можно получить путем комбинирования различных способов нанесения, таких как, например, шлицевой экструзии и струйной печати.

Применения

Пленки и материалы, полученные в соответствии с настоящим изобретением, находят широкое применение во многих биомедецинских приложениях.

А. Культура клеток

Коллагеновые материалы, созданные в соответствии с настоящим изобретением, находят применение в клеточных культурах.

Коллаген как пленка или покрытие на других материалах может быть использован в культуре тканей для выращивания стволовых клеток. Предполагается, что белковая поверхность и ориентация волокон способствуют росту клеток в искусственной среде, подобно тому, как это происходит в живом организме.

Под «культурой клеток» или «культурой» здесь понимается сохранение клеток в искусственной, лабораторной среде. Следует понимать, однако, что термин «культура клеток» является родовым понятием и может охватывать культивирование не только отдельных прокариотических (к примеру, бактериальных) или эукариотических (к примеру, животных, растительных и грибных) клеток, но также тканей, органов, систем органов и целых организмов, для которых термины «культура тканей», «культура органов», «культура систем органов» или «органотипическая культура» могут время от времени использоваться взаимозаменяемо с термином «культура клеток».

Под «культивированием» здесь понимается сохранение клеток в искусственной среде при условиях, способствующих их разрастанию, дифференциации, продуцированию конкретных белков с рекомбинантной и природной или продленной живучестью, в активном или латентном состоянии.

Выращивания клеток осуществляют в сосуде для культивирования в присутствии среды клеточной культуры. В качестве сосудом для культивирования обычно используют стеклянный, пластмассовый или металлический контейнер, который может обеспечить асептическую среду для культивирования клеток, включая чашки Петри и 96-луночные планшеты.

Коллагеновый слой может покрывать поверхность сосуда для культивирования клеток.

Использование различных биологических макромолекул в качестве покрытия широко применяется в культуре тканей, также они используется при покрытии медицинских устройств. Такие биологические материалы включают в себя коллагены, желатин, фибронектин, фибрин, гепарин и другие вещества. При использовании в качестве покрытий эти вещества поддерживают лучшую биосовместимость и обеспечивают усиление прикрепления, живучести, роста, миграции и дифференциации клеток, введенных в сосуд. Существующие концепции предполагают, что такие покрытия связываются с рецепторами на поверхности клеток, которые затем поддерживают размножение, прикрепление и поведение клеток. Недостатком существующих ныне устройств является невысокая однородность покрытия, кроме того, сама структура коллагена отличается от структуры биологических тканей и в значительной степени носит случайный характер.

Поверхности, на которых растут клетки, играют ключевую роль в управлении их поведением (Spradling A. et al., Nature; 414:98-104 (2001); Streuli С.Curr Opin Cell Biol; 11(5): 634-40 (1999)). Такие свойства, как шероховатость поверхности, гидрофобность и конкретное взаимодействие с клеточной поверхностью, могут все влиять на активность клеток (Saltzman W.M. Cell Interactions with Polymers. In: Lanza RP, Langer RS, Vacanti J., and editors. Principles of Tissue Engineering. 2 ^nd ed. San Diego: Academic Press; 221-35 (2000)). Модуляция клеточной активности посредством взаимодействия с подложкой является важным фактором, оказывающим значительный лечебный эффект. Организация процесса размножения клеток вне живых организмов и их инкапсуляции требует создание специального типа взаимодействий между клетками и окружающим материалом для их роста, функционирования и доставки (Lanza R.P., Langer R.S., Vacanti. J. Principles of Tissue Engineering. 2^nd ed. San Diego: Academic Press, 2000). Модуляция биоактивности может осуществляться посредством выбора подходящих материалов (Hubbell J.A., Curr Opin Biotechnol 1999; 10(2) 123-9). Один из таких примеров - гидрогели, которые могут усиливать клеточный рост посредством включения связанных адгезивных лигандов (Lutolf М.Р. et al., Nat Biotechnol 21:513-8 (2003)). Управление клеточной функцией посредством выбора материала-основы является потенциально мощным инструментом для управления стволовыми клетками, которые имеют возможность разделяться на множество типов тканей. Например, самособирающийся на основе пептида биоматериал, который может специфично направлять дифференциацию нейтрального предшественника в нейроны, был недавно описан в работе Silva G.A. et al., Science 303:1352-5 (2004). Множество исследований в настоящее время сфокусировано на разработке биоактивных материалов с включением лигандов, инкапсуляцией ДНК и факторов роста (Chen R.R. and Mooney D.J. Pharmaceutical Research 20:1103-12 (2003); Sakiyama-Elbert S.E. and Hubbell J.A. Ann Rev Mater Res; 31:183-201 (2001)).

Имеется много различных типов сред для культивирования клеток, которые можно использовать для поддержания живучести клеток, например, среда DMEM (Н.J.Morton, in Vitro, 6, 89/1970), среда F12 (R.G.Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 288/1965) и среда RPMI 1640 (J.W.Goding, J.Immunol. Methods, 39, 285/1980; JAMA 1996 519/1957). Такие среды (часто называемые «базальными средами»), зачастую, не имеют в достатке питательных веществ, требуемых большинством животных клеток. Поэтому к базальным средам приходиться добавлять сыворотку для преодоления этой недостаточности. Обычно, используется эмбриональная бычья сыворотка (ЭБС), лошадиная сыворотка или человеческая сыворотка в значительных концентрациях.

Хотя использование ЭБС желательно, а зачастую необходимо, для должного роста клеток, она имеет ряд недостатков. Она относительно дорога и ее использование в значительной степени увеличивает стоимость клеточной культуры. Помимо этого, трудно получить сыворотку с одинаковыми параметрами. Далее, биохимическая сложность ЭБС может усложнить последующую подготовку выделенных белков, тем самым поднимая стоимость производства.

Свободная от сыворотки среда является прекрасной альтернативой стандартным содержащим сыворотку средам для культивирования клеток. Она имеет несколько преимуществ, которые включают в себя лучшее определение состава, сниженное загрязнение и более низкую стоимость. Давно уже ведутся поиски свободной от сыворотки среды со способностью культивирования, сравнимой с такой же способностью традиционной содержащей сыворотку среды.

Одна из стратегий для разработки свободной от сыворотки среды состоит в дополнении базальных сред подходящими питательными веществами, способными обеспечить такой же темп роста клеток и/или производства белка. Примеры таких компонентов включают в себя бычий сывороточный альбумин (БСА) или человеческий сывороточный альбумин (ЧСА); определенные факторы роста, выделенные из природных (животных) или рекомбинантных источников, в том числе эпидермальный фактор роста (ЭФР) или фибропластовый фактор роста (ФФР); такие липиды, как жирные кислоты, стеролы и фосфолипиды; производные и комплексы липидов, такие как фосфоэтаноламин, этаноламин и липопротеины; белковые и стероидные гормоны, такие как инсулин, гидрокортизон и прогестерон; нуклеотидные прекурсоры; и некоторые элементы в следовых количествах. См. работу Cell Culture Methods for Molecular and Cell Biology, Vol.1, Barnes, D.W. et al., eds., New York: Alan R. Liss, Inc., (1984), включенную сюда во всей полноте посредством ссылки.

В. Структурные каркасы с ориентированным коллагеном

Другим приложением настоящего изобретения является создание структурных каркасов с ориентированным коллагеном.

Коллагеновые слои с тканым узором используют в клеточной культуре для получения платформы или направляющей для выращивания клеток. Имеется экспериментальное подтверждение того, что ориентированный коллагеновый слой обеспечивает направление для выращивания клеток и увеличивает скорость их размножения. В работе Yoshizato К. et al., Growth and Differ. 23 (2), 175-184 (1981) была использована коллагеновая пленка, с выравненными коллагеновыми волокнами. Структура пленки была изучена посредством сканирующей электронной микроскопии. Ориентация клеток на этой пленке изучалась в лабораторных условиях с помощью человеческих фибробластов и миобластов куриных зародышей. Девяносто четыре процента инокулированных фибробластов выравнивались по направлению коллагенового волокна. Миобласты показывали аналогичное выравнивание по направлению коллагенового волокна. Слияние миобластов ускорялось на выровненной мембране по сравнению со случайно ориентированной пленкой, что предполагает некоторую роль контактной направляющей в дифференциации мышечных клеток.

Коллагеновые пленки с биологически подобным тканым узором должны демонстрировать аналогичные или даже улучшенные результаты.

Помимо этого, такие пленки создают структурный каркас для роста стволовых клеток. Фиг.10 показывает стволовые клетки, растущие на коллагеном слое, сформированном согласно настоящему изобретению. В экспериментах была продемонстрирована высокая скорость размножения стволовых клеток.

Еще одним возможным приложением настоящего изобретения является использование ориентированного коллагена в процессе заживления ранок. При этом ориентированный коллаген обеспечивает модуляцию размножения и миграции клеток и является важным фактором в процессе затягивания ранок (Cuttle L. et al., Wound Repair and Regeneration, 13:198-204 (2005)). Узоры коллагеновой ткани при естественном заживлении ран у зародышей и взрослых особей заметно отличаются. Кожа зародыша регенерирует коллагеновые волокна в аккуратные хорошо организованные узоры с близкой к совершенной архитектурой ткани, тогда как раны на послеродовой и взрослой коже заживляются коллагеном, уложенным в толстые дезорганизованные узоры и рубцовые образования (Colwell A.S. et al., Front Biosci; 8:sl240-8 (2003)). Свойства зародышевой кожи залечивать раны без рубцов теряются у многих животных на поздних сроках беременности. Дальнейшее свидетельство важности коллагеновой структуры для лечения ранок без рубцов было представлено в работе Goffin A.J. et al., Oriented Collagen Films for Wound-Healing Applications, 2006, Annual Meeting, Society for Biological Engineering.

Ориентированные коллагены могут также быть использованы в тканевой инженерии. Различные формы коллагена являются наиболее важными материалами тканевой инженерии. Их широко используют для лечения ожоговых ран, сооружения искусственных нервов, регенерирования поврежденной сердечной ткани и т.п. Поскольку внеклеточная матрица человеческого тела имеет хорошо ориентированную структуру, которая изменяется с возрастом и условиями человеческого существования, исследователи пытались использовать эти структуры для диагностики (G.Avtandilov et al., Journal of Applied Crystallography, 33:511-514 (2000); P.Lazarev et al., Annual International Conference of the IEEE Engineering in Medicine and Biology - Proceedings, 2000, v.4, p.3230-3233; Cuttle et al., Wound Repair and Regeneration, 13:198-204 (2005)). Значительные усилия потрачены на достижение желательной ориентации коллагеновых фибрилл за счет механического однонаправленного растяжения, за счет использования микроканавок и иных микроструктурированных подложек, за счет использования потоковой ориентации сдвига и т.п. Настоящее изобретение позволило создать коллагеновые пленки с биологически подобными структурами.

С. Клинические применения коллагена

В подготовке коллагена к использованию в качестве биоматериала можно выделить два разных подхода. В одном случае биологические ткани обрабатывают таким образом, чтобы удалить неколлагеновый материал и упрочнить оставшийся коллаген. Существующие структуры коллагена и, вероятно, многие из межмолекулярных поперечных связей сохраняются. Во втором подходе коллаген сначала солюбилизируют и очищают, а затем пытаются заново сформировать нужную структуру и обеспечить поперечные связи. Первый из двух подходов имеет преимущество в сохранении нормальной биологической трехмерной структуры в биоматериале, но имеет ограничения в использовании существующих конфигураций. При втором подходе существует проблема воспроизведения коллагеновых структур с требуемой прочностью, но имеется очень широкий потенциал возможных приложений.

Успех коллагеновых ксенотрансплантатов позволяет сделать вывод, что клинически значимая антигенность в общем не является проблемой. Одной из полностью исследованных структур был коллагеновый артериальный трансплантат бычьего происхождения, производимый фирмой Джонсон и Джонсон.

Можно предположить, что восстановленный коллаген имеет больший потенциал для использования в биоматериалах. Восстановленный коллаген может быть очищен, его структура определена, боковые группы изменены, и затем спроектировано биомедицинское устройство любого типа. Основные медицинские применения на сегодняшний день - это экструдированные коллагеновые волокна, коллагеновые мембраны, коллагеновые гели и коллагеновые губки.

В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь коллагеновые пленки используются для предотвращения спаек, следующих за повреждениями сухожилий, для глазной хирургии по удлинению поднимающих мышц века и для восстановления перерезанных нервов. Aparray & Tanner сообщили об успешном использовании коллагеновой пленки при лечении ожогов роговицы. Prudden & Wolarky использовали коллаген, приготовленный из обработанного ферментами бычьего хряща, для улучшения заживления ранок. Они обнаружили, что данная подготовка купирует вызванное стероидами замедление заживления ранок.

Предложенные в настоящем изобретении коллагеновые пленки можно также использовать для закрывания ожогов и лечения ран. В некоторых вариантах осуществления изобретения коллагенновые структуры в пленке не имеют сильных поперечных связей. Это может быть полезно, если пленки используют как саморассасывающееся перевязочное средство. Когда коллаген в пленке имеет сильные поперечные связи, она не может встраиваться в ткань. С другой стороны, коллагеновый войлок или губка (образованные коллагеном с прочными поперечными связями) могут функционировать как настоящая искусственная кожа. Лечение костных дефектов и ран также оказывается успешным за счет использования коллагена.

Все приведенные выше примеры служат только целям иллюстрации настоящего изобретения и не ограничивают возможностей его модификации и использования. Все процитированные здесь публикации, патенты и заявки на патенты включены сюда целиком посредством ссылки.

Пример

Нижеприведенный пример иллюстрирует возможности количественного описания пленки, выполненной в соответствии с настоящим изобретением. Тканый узор коллагена можно охарактеризовать количественно через размер пор и расстояние между ними. Четыре различных материала, показанных на Фиг.11a-11d были описаны с помощью измерительных инструментов Автокада (AutoCAD). Результаты показаны в нижеследующих таблицах.

На Фиг.11a измерения были сделаны в 11 точках в различных местоположениях на коллагеновой пленке. Вокруг каждой из пор была обозначена граница в виде эллипса. Были отмечены большие и малые оси этих эллипсов. Таблица 1 показывает результаты измерений этих измерений.

Таблица 1
Размеры эллиптических пор
№ поры	Большая ось (нм)	Малая ось (нм)	Отношение
1	420	245	1,7
2	508	280	1,8
3	438	210	2,1
4	315	210	1,5
5	315	158	2,0
6	385	140	2,8
7	263	140	1,9
8	858	245	3,5
9	508	298	1,7
10	420	193	2,2
11	438	193	2,3
Среднее	442	210
Стандартное отклонение	158	53

Далее для определения типичных расстояний между порами было измерено расстояние от центра эллипса, окружающего одну пору, до центра эллипса, окружающего соседнюю пору.

Таблица 2
Типичное расстояние между порами
№ № пор	Расстояние (нм)
1-2	998
2-3	945
3-1	998
3-4	665
5-6	770
2-7	665
8-9	683
10-11	595
Среднее	790
Стандартное отклонение	165

Было измерено типичное расстояние между поперечно-связанными волокнами, и результаты показаны в Таблице 3 ниже.

Таблица 3
Расстояние между поперечно-связанными волокнами
№ №	Расстояние, нм
12-13	140
14-15	123
Среднее	131

Таблицы 4-6 показывают результаты измерений по Фиг.11b с использованием той же самой методологии, которая описана выше:

Таблица 4
Размеры эллиптических пор
№	Большая ось (нм)	Малая ось (нм)	Отношение
1	245	142	1,7
2	336	116	2,9
3	168	129	1,3
4	207	181	1,1
5	155	129	1,2
6	168	129	1,3
7	194	103	1,9
8	220	129	1,7
Среднее	212	132
Станд. отклонение	59	23

Таблица 5
Типичные расстояния между порами
№ № пор	Расстояние (нм)
1-2	646
2-3	633
3-1	917
2-4	698
3-4	762
4-5	801
3-6	465
7-8	607
Среднее	691
Стандартное отклонение	137

Таблица 6
Расстояние между поперечно-связанными волокнами
№ №	Расстояние, нм
9-10	103
10-11	78
12-13	116
14-15	103
16-17	103
18-19	103
Среднее	101
Стандартное отклонение	13

Таблицы 7-9 показывают результаты измерений по Фиг.11c с использованием той же самой методологии, которая описана.

Таблица 7
Размеры эллиптических пор
№	Большая ось (нм)	Малая ось (нм)	Отношение
1	575	226	2,5
2	265	207	1,3
3	155	149	1,0
4	187	110	1,7
5	174	110	1,6
6	268	136	2,0
7	123	123	1,0
Среднее	250	151
Стандартное отклонение	153	47

Таблица 8
Типичное расстояние между порами
№ № пор	Расстояние (нм)
1-2	824
2-3	1056
3-1	849
3-4	585
4-7	581
7-6	778
6-3	753
4-5	191
Среднее	702
Стандартное отклонение	256

Таблица 9
Расстояние между поперечно-связанными волокнами
№ №	Расстояние, нм
8-9	90
10-11	87
Среднее	89

Таблицы 10-12 показывают результаты измерений на Фиг.11d с использованием той же самой методологии.

Таблица 10
Размеры круговых пор
Точка	Диметр (нм)
1	193
2	203
3	203
4	166
5	101
6	157
7	166
8	212
9	203
10	249
Среднее	185
Стандартное отклонение	40

Таблица 11
Расстояние между порами
№ № пор	Расстояние (нм)
1-2	635
3-4	645
5-6	672
7-8	847
8-9	562
9-10	672
Среднее	672
Стандартное отклонение	95

Таблица 12
Расстояние между поперечно-связанными волокнами
№ №	Расстояние, нм
11-12	64
13-14	64
Среднее	64

Таблица 13
Обобщение результатов измерений по фиг.11а-d.
	Форма пор (большая ось эллипса или диаметр круга) (нм)	Расстояние между порами (нм)	Расстояние между поперечно-связанными волокнами (нм)
Фиг.11(a)	442	790	131
Фиг.11(b)	212	691	101
Фиг.11(c)	250	702	89
Фиг.11(d)	185	672	64
Среднее	272	714	96

На фиг.12a-12c представлена топография коллагеновых пленок, изготовленных в соответствии с настоящим изобретением. На Фиг.12a представлены изображения различных структур в АСМ. Распределение по высоте поверхности коллагеновых пленок характеризует в общем случае поверхностную структуру коллагена. Усредненный размер коллагеновых пор пропорционален статистических параметрам Sa (средняя шероховатость) или Sq (среднеквадратичная шероховатость). На Фиг.12b приведены соответствующие гистограммы и на Фиг.12c связанные с ними данные, относящиеся к трем коллагеновым пленкам и характерезующим их топологию.

Для определения размеров пор и ширины пучков использовалось изображение АСМ рельефа, как показано на Фиг.13. Для оценки рельефа формировалась маска поперечного сечения. Уровень поперечного сечения рельефа был выбран на 50% от максимальной высоты рельефа. Размер пор измерялся как усредненный размер по наибольшей и наименьшей осям с последующим усреднением по всем порам на изображении. Размер пучка измерялся как расстояние между ближайшими краями двух ближайших пор с последующим усреднением по всем измеренным значениям.

Вышеприведенные примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, пояснения его принципов и описания некоторых областей практического применения и не исчерпывают всех возможных форм его воплощения.