способ определения активации плазминогена бактериями в условиях in vitro

Формула изобретения

Способ определения активации плазминогена бактериями в условиях in vitro, включающий реакцию взаимодействия плазмина с пептидным субстратом, отличающийся тем, что в качестве субстрата используют протамин сульфат, который вносят в количестве 100 мкл в подготовленный супернатант, последний готовят в виде смеси: 0,49 мл 0,2 М фосфатного буфера, рН 8,0, добавляют 0,5 мл суспензии бактерий в физиологическом растворе (5×10⁹ кл/мл) и 15 мкг человеческого плазминогена в конечном объеме 1 мл, затем полученную смесь инкубируют в течение одного часа при 37°С и клетки осаждают центрифугированием при 11000 об/мин в течение 5 мин, после этого супернатант с протамин сульфатом инкубируют 2 часа при 37 °С, белок осаждают добавлением 1 мл 20% ТХУ, помещают в ледяную баню, активацию плазминогена бактериями регистрируют по количеству отщепившегося аргинина, содержание которого определяют методом Сакагуши по окрашиванию проб в красный цвет, чем ярче окраска, тем выше содержание аргинина.

Описание изобретения к патенту

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии и может быть использовано при проведении прикладных и фундаментальных исследований, связанных с изучением тонких механизмов патогенеза, инвазии, бактериемии и диссеминации микроорганизмов.

Известно, что ряд микробных патогенов использует систему плазминоген/плазмин человека для преодоления тканевых барьеров во время так называемых бактериальных метастазов(1). Они экспрессируют на своей поверхности рецепторы для фиксации и последующей активации плазминогена под влиянием урокиназы (uАР) и тканевого активатора плазминогена (tAP) хозяина, другие для этого используют собственные протеазы, входящие в семейство омптинов. Таким образом, активация плазминогена в плазмин существенно усиливает патогенетические возможности возбудителя за счет усиления его деструктивного потенциала, направленная на слом врожденных защитных сил чувствительного хозяина. Поэтому актуальным является удобный и безопасный способ детекции активации плазминогена тем или иным возбудителем.

Известен способ активации плазминогена клетками Yersinia pestis KIM D34 по Haiko J. (2), заключающийся в том, что для регистрации активности плазмина используют хромогенный субстрат Val-Leu-Lys-p-нитроанилин дигидрохлорида (S-2251), который добавляют в инкубационную смесь. Образование плазмина регистрируют при помощи специального ридера для планшетов при 405 нм.

Однако известный синтетический хромогенный субстрат характеризуется нестабильностью при хранении, длительностью процесса (т.к. инкубация порой составляет 24 часа), дороговизной реагентов и требует специальной аппаратуры.

За прототип выбран способ определения плазминогена хромогенным субстратом (см. А.П. Мамот, А.И. Мамаев, З.С. Барназа и др. «Метод определения плазминогена отечественным хромогенным субстратом и его диагностическое значение», журнал Клиническая лабораторная диагностика, № 3, 2000 г., стр.21-23) (3), заключающийся в том, что к 0,5 мл суспензии бактерий в физиологическом растворе (10 ⁹ кл/мл) добавляют 15 мкг человеческого плазминогена и 30 мкл хромогенного субстрата For-Ala-Phe-Lys-pNa. HBr в количестве 4 мкг/мл в конечном объеме 540 мкл, затем инкубируют при 37°С в течение 0,5-24 часов, расщепление субстрата плазмином регистрируют при 405 нм по отщепившемуся pNa и выражают в цифрах экстинкции A₄₀₅=t₁-t₀, в результате гидролиза субстрата образуется окрашенное вещество, подтверждающее присутствие плазмина.

Недостатком прототипа является сложность и длительность процесса исследования, тем более что сам синтез коммерческого препарата For-Ala-Phe-Lys-pNa. HBr представляет собой трудоемкий многостадийный процесс, включающий 7 стадий.

Кроме того, регистрация способности протеазы белков наружной мембраны возбудителей особо опасных инфекций активировать плазминоген путем расщепления хромогенных субстратов представляется сложным из-за особенностей работы с особо опасными инфекциями.

Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка простого и более эффективного по времени и стоимости способа регистрации явления активации плазминогена бактериями особо опасных инфекций в условиях in vitro в максимально безопасных для экспериментатора условиях.

Поставленная задача достигается тем, что в известном способе определения активации плазминогена у бактерий в условиях in vitro, включающем реакцию взаимодействия плазмина с пептидным субстратом, в качестве последнего используют протамин сульфат, который вносят в количестве 100 мкл в подготовленный супернатант, который готовят в виде смеси: к 0,49 мл 0,2М фосфатного буфера, рН 8.0, добавляют 0,5 мл суспензии бактерий в физиологическом растворе (5×10⁹ кл/мл) и 15 мкг человеческого плазминогена в конечном объеме 1 мл, затем полученную взвесь инкубируют в течение 1 часа при 37°С и осаждают центрифугированием при 11000 об/мин в течение 5 минут, после этого пробы инкубируют 2 часа при 37°С, затем белок в пробах осаждают добавлением 1 мл 20% ТХУ, помещают в ледяную баню и регистрируют активацию плазминогена бактериями по количеству отщепившегося аргинина, содержание которого определяют методом Сакагуши по окрашиванию проб в красный цвет, чем ярче окраска, тем большее количество отщепившегося аргинина, и соответственно выше активность исследуемого штамма.

Способ осуществляется следующим образом. Для подтверждения работы способа были использованы штаммы микроорганизмов V. cholerae (5879, 17259, 17779, 17625); Y. pestis (EV, TRU, ЖВR); F.tularensis (Schu, 543, novicidae, 1510) и штаммы бактерий E. coli (QD₅₀₀₃, QD₅₀₀₃ pRD13) из коллекции Ростовского-на-Дону противочумного института.

Предварительно готовят суспензию бактерий по оптическому стандарту мутности в концентрации (5×10⁹кл/мл), которые обеззараживают добавлением мертиолата натрия (1:10000).

Затем для проведения реакции готовят инкубационную смесь, для этого к 0,49 мл 0,2М фосфатного буфера, рН 8.0, добавляют 0,5 мл суспензии бактерий в физиологическом растворе (5×10 ⁹ кл/мл) и 15 мкг человеческого плазминогена в конечном объеме 1 мл. В первую контрольную пробирку вместо суспензии клеток вносят физиологический раствор (контроль плазминогена), во вторую вносят физиологический раствор вместо бактериальной суспензии и плазминогена (контроль протамина). Инкубацию ведут 1 час при 37°С, после чего клетки осаждают центрифугированием (11000 об/мин, биофуга Heareus) в течение 5 минут. Супернатант переносят в чистую пробирку. В опытные и контрольные пробы вносят по 100 мкл протамина, что соответствует 10 мг/мл упомянутого субстрата.

После этого пробы инкубируют 2 часа при 37°С. Затем белок осаждают добавлением 1 мл 20% ТХУ, чем достигается дополнительное обеззараживание содержимого пробы. Осветленный центрифугированием супернатант переносят в стеклянные пробирки, которые помещают в ледяную баню и используют для определения содержания аргинина методом Сакагуши (4).

Количество отщепленного активированным плазминогеном аргинина определяют по калибровочной кривой, которую строят с использованием в качестве стандарта препарата солянокислого аргинина. Активность выражают в мкг аргинина, отщепленного от протамина плазмином, образовавшимся вследствие активации плазминогена клетками исследуемого микроорганизма за 1 час инкубации при 37°С.

Кроме того, способ сопровождается окрашиванием проб в красный цвет, чем ярче окраска, тем выше содержание аргинина и следовательно выше активность исследуемого штамма.

Пример № 1.

В качестве исследуемых штаммов использовали культуры V. cholerae 5879, 17259 (изолированные от больных и несущие интактный ген ompT, детерминирующий плазминогенактивирующую способность штаммов) и 17625, 17779 (выделенные из проб воды и лишенные интактного гена ompT в результате мутационных событий).

Как видно из таблицы 1, штаммы холерных вибрионов, полученные из клинического материала, обладали способностью активировать плазминоген человека в условиях in vitro, на что указывают высокие показатели содержания аргинина и окрашивание проб, тогда как штаммы, выделенные из проб воды, такой способностью не обладали.

Пример № 2.

Для изучения были взяты экспериментальные штаммы Е. coli QD₅₀₀₃, E. coli QD₅₀₀₃pRD13 (с плазмидой несущий ген активатора плазминогена pla⁺ Yersinia pestis).

Как следует из таблицы 2, штаммы кишечной палочки обладали плазминогенактивирующей способностью, причем у штамма, трансформированного плазмидой pRD13 с геном рlа из чумного микроба, активность была в 2 раза выше, чем у исходного в связи с суммацией активностей двух генов.

Пример № 3.

В качестве исследуемых использовали штаммы возбудителя туляремии - Francisella tularensis Schu, 543 (вирулентные штаммы), 1510 и F. novicidae (авирулентные штаммы) (табл.3).

Из данных таблицы 3 можно заключить, что вирулентные штаммы обладали высокой способностью активировать плазминоген, тогда как непатогенные для человека варианты - сниженной.

Пример № 4.

В качестве исследуемых штаммов использовали культуры возбудителя чумы - Yersinia pestis EV (pla+, вакцинный штамм), TRU, ЖВК ( pla, авирулентные штаммы) (табл.4).

Из данных таблицы 4 видно, что штамм, несущий ген pla, обладает высокой способностью активировать плазминоген, тогда как штаммы, не содержащие в своем геноме pla, данной активностью не обладали.

Из примеров 1-4 следует, что заявленный способ позволяет характеризовать бактерии по плазминогенактивирующей способности, не уступая при этом методу, изложенному в ближайшем аналоге, с соблюдением правил противоэпидемической защиты экспериментатора.

Таким образом, регистрацию активации плазминогена бактериями осуществляют с использованием в качестве субстрата протамин сульфата, на 60% состоящего из остатков аргинина, связи между которыми расщепляет плазмин.

Использование предлагаемого изобретения позволяет с помощью протамина простым, не требующим дорогостоящих реагентов и оборудования, а также эффективным по времени (в течение 4-х часов), безопасным для экспериментатора условиях проводить регистрацию явления активации плазминогена бактериями в условиях in vitro.

В дальнейшем предложенный способ может быть использован при изучении патогенеза холеры, туляремии и др. инфекций, а также при разработке и характеристике вакцинных препаратов из возбудителей особо опасных инфекций на основе белков наружной мембраны и пузырьков из них.

Источники информации

1. Lahteenmaki К., Edelman S., Korhonen Т.К. Bacterial metastasis: the host plasminogen system in bacterial invasion // Trends in Microbiology. - 1984 - Vol.13. - N2. - P.79-85.

2. Haiko J., Suomalainen M., Ojala Т., Lahteemaki K., Korhonen Т.К., Breaking barriers - attack on innate immune defence by omptin surface proteases ofenterobactsrial pathogens. // Innate Immunity 2009. - Vol.15. - № 2. - р.67-80.

3. Момот А.П., Мамаев А.Н., Баркаган З.С., Неведрова О.Е., Макаров В.А., Воюшина Т.Л., Ерин Д.М. Метод определения плазминогена с отечественным хромогенным субстратом и его диагностическое значение. // Клиническая лабораторная диагностика., 2000, № 3, с.21-24.

4. Gilboe D.D., Williams J.N. Evaluation of the Sakagushi reaction for quantitative determination of arginine. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1956 - Vol.91. - № 4. - р.535-536.

Таблица 1
№	Штамм V. cholerae	Протамин	Хромогенный субстрат
		мкгАрг/109 м.к/час	ОП405, A405 =t1-t0 (за 24 ч)
1.	5879	48,0	0,19
2.	17259	22,0	0,153
3.	17779	0	0
4.	17625	0	0

Таблица 2
№	Штамм E. coli	Протамин	Хромогенный субстрат
		мкгАрг/109м.к/час	ОП405, A405=t1 -t0 (за 24 ч)
1.	QD5003	9,22	0,378
2.	QD5003 pRD13	19,83	0,512

Таблица 3
№	Штамм F. Tularensis	Протамин	Хромогенный субстрат
		мкгАрг/10м9.к/час	ОП405, А405=t1 -t0 (за 24 ч)
1.	Schu	10,0	0,137
2.	543	5,6	0,128
3.	novicidae	2,6	0,155
4.	1510	1,55	0,277

Таблица 4
№	Штамм Y. pestis	Протамин	Хромогенный субстрат
		мкгАрг/109м.к/час	ОП405, А405=t1 -t0 (за 24 ч)
1.	EV	155,19	0,149
2.	TRU	0,78	0
3.	ЖВR	0	0