способ получения l-глутаминовой кислоты

Формула изобретения

1. Способ получения L-глутаминовой кислоты ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, в жидкой среде, рН которой доводится до значения, при котором L-глутаминовой кислоте, продуцированной микроорганизмом, дают возможность осаждаться, при допущении того, что L-глутаминовая кислота продуцируется и накапливается с сопровождаемым осаждением, в котором операцию, приводящую к присутствию кристаллов L-глутаминовой кислоты в среде, проводят, когда концентрация L-глутаминовой кислоты в среде ниже, чем концентрация, при которой происходит спонтанная кристаллизация, в котором операция, приводящая к присутствию кристаллов L-глутаминовой кислоты в среде, представляет собой добавление кристаллов L-глутаминовой кислоты, и в котором микроорганизм может метаболизировать источник углерода в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и источник углерода, при рН 5 или ниже и обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем концентрацию насыщения L-глутаминовой кислоты в жидкой среде при рН 5,0 или ниже.

2. Способ по п.1, в котором кристаллы являются -кристаллами.

3. Способ по п.1 или 2, в котором количество кристаллов, добавленное в среду, составляет 0,2 г/л или выше.

4. Способ по одному из пп.1 и 2, в котором микроорганизм относится к роду Enterobacter.

5. Способ по п.4, в котором микроорганизм является Enterobacter agglomerans.

Описание изобретения к патенту

Предпосылки изобретения

Настоящее изобретение относится к способу получения L-глутаминовой кислоты ферментацией. L-глутаминовая кислота широко используется в качестве сырья для приправ и так далее.

L-глутаминовую кислоту получают в основном ферментацией с использованием так называемых продуцирующих L-глутаминовую кислоту коринеформных бактерий, относящихся к роду Brevibacterium, Corynebacterium или Microbacterium, или их мутантных штаммов (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, pp.195-215, 1986). В качестве способов получения L-глутаминовой кислоты ферментацией с использованием других штаммов бактерий известен способ с использованием микроорганизма, относящегося к роду Bacillus, Streptomyces, Penicillium или тому подобное (патент США №3220929), способ с использованием микроорганизма, относящегося к роду Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida или тому подобное (патент США №3563857), способ с использованием микроорганизма, относящегося к роду Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (в настоящее время отнесенный к Enterobacter aerogenes) или тому подобное (публикация патента Японии (Kokoku) №32-9393), способ с использованием мутантного штамма Escherichia coli (выложенная заявка на патент Японии (Kokai) №5-244970) и так далее. Кроме того, авторы настоящего изобретения предложили способ получения L-глутаминовой кислоты с использованием микроорганизма, относящегося к роду Klebsiella, Erwinia или Pantoea (выложенная заявка на патент Японии №2000-106869).

Кроме того, раскрыты различные способы улучшения способности продуцировать L-глутаминовую кислоту путем повышения активности ферментов, принимающих участие в биосинтезе L-глутаминовой кислоты, с использованием методов рекомбинантной ДНК. Например, сообщалось, что введение гена, кодирующего цитратсинтазу из Escherichia coli или Corynebacterium glutamicum, было эффективным для усиления способности продуцировать L-глутаминовую кислоту у бактерий Corynebacterium или Brevibacterium (публикация патента Японии (Kokoku) №7-121228). Кроме того, в выложенной заявке на патент Японии №61-268185 раскрывается клетка, содержащая рекомбинантную ДНК, включающую ген глутаматдегидрогеназы из бактерий Corynebacterium. Кроме того, в выложенной заявке на патент Японии №63-214189 раскрывается способ усиления способности продуцировать L-глутаминовую кислоту амплификацией гена глутаматдегидрогеназы, гена изоцитратдегидрогеназы, гена аконитатгидратазы и гена цитратсинтазы.

Несмотря на то что продуктивность в отношении L-глутаминовой кислоты была значительно повышена вышеуказанной селекцией микроорганизмов или усовершенствованием способов получения, необходима разработка способов более эффективного, дешевого получения L-глутаминовой кислоты для удовлетворения возрастающих потребностей в ней в будущем.

Известен способ, в котором ферментацию проводят таким образом, что L-аминокислота, накапливающаяся в культуре, кристаллизуется (выложенная заявка на патент Японии №62-288). В данном способе концентрация L-аминокислоты в культуре поддерживается ниже определенного уровня осаждением накапливающейся в культуре L-аминокислоты. В частности, L-триптофан, L-тирозин или L-лейцин осаждается во время ферментации доведением температуры и рН культуры или добавлением в среду поверхностно-активного вещества.

Несмотря на то что известен, как описанный выше, способ проведения ферментации с сопровождающимся осаждением L-аминокислот, аминокислотами, подходящими для данного способа, являются таковые, которые обладают относительно низкой растворимостью в воде, и не известен пример применения способа для хорошо растворимых в воде аминокислот таких, как L-глутаминовая кислота. Кроме того, среда должна иметь низкое значение рН для осаждения L-глутаминовой кислоты. Однако продуцирующие L-глутаминовую кислоту бактерии такие, как упоминались выше, не могут расти в кислых условиях, и, следовательно, ферментацию L-глутаминовой кислоты проводят в нейтральных условиях (патенты США №3220929 и 3032474; К.С.Chao & J.W.Foster, J. Bacteriol., 77, pp.715-725 (1959)). Таким образом, получение L-глутаминовой кислоты ферментацией, сопровождаемой осаждением, неизвестно. Кроме того, известно, что рост наиболее ацидофильных бактерий ингибируется под действием органических кислот таких, как уксусная кислота, молочная кислота и янтарная кислота (Yasuro Oshima Ed., "Extreme Environment Microorganism Handbook", p.231, Science Forum; R.M.Borichewski, J.Bacteriol., 93, pp.597-599 (1967) etc.). Следовательно, полагается, что многие микроорганизмы чувствительны к L-глутаминовой кислоте, которая также является органической кислотой, в кислых условиях, и не сообщалось о попытке поиска микроорганизмов, показывающих способность продуцировать L-глутаминовую кислоту в кислых условиях.

Краткое описание изобретения

В обстоятельствах, описанных выше, целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения L-глутаминовой кислоты ферментацией с сопровождаемым осаждением L-глутаминовой кислоты.

Авторы настоящего изобретения установили, что в способе получения L-глутаминовой кислоты ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту при допущении того, что L-глутаминовая кислота продуцируется и накапливается в среде с сопровождаемым осаждением L-глутаминовой кислоты, выход L-глутаминовой кислоты, когда наличие кристаллов вызывается искусственно перед тем, как происходит спонтанная кристаллизация, выше, чем когда происходит спонтанная кристаллизация L-глутаминовой кислоты, продуцированной микроорганизмом. Таким образом они осуществили настоящее изобретение.

Настоящее изобретение обеспечивает следующее.

(1) Способ получения L-глутаминовой кислоты ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, в жидкой среде, рН которой доводится до значения, при котором L-глутаминовой кислоте, продуцированной микроорганизмом, дают возможность осаждаться, при допущении того, что L-глутаминовая кислота продуцируется и накапливается с сопровождаемым осаждением L-глутаминовой кислоты, в котором операцию, приводящую к присутствию кристаллов L-глутаминовой кислоты в среде, проводят, когда концентрация L-глутаминовой кислоты в среде ниже, чем концентрация, при которой происходит спонтанная кристаллизация.

(2) Способ по п.(1), в котором операция, приводящая к присутствию кристаллов L-глутаминовой кислоты в среде, представляет добавление кристаллов L-глутаминовой кислоты.

(3) Способ по п.(2), в котором кристаллы являются -кристаллами.

(4) Способ по п.(3), в котором количество кристаллов, добавленное в среду, составляет 0,2 г/л или выше.

(5) Способ по одному из п.п.(1)-(4), в котором микроорганизм относится к роду Enterobacter.

(6) Способ по п.(5), в котором микроорганизм является Enterobacter agglomerans.

(7) Способ по одному из п.п.(1)-(6), в котором микроорганизм может метаболизировать источник углерода в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и источник углерода, при определенном значении рН, и обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем концентрацию насыщения L-глутаминовой кислоты в жидкой среде при этом значении рН.

(8) Способ по п.(7), в котором определенное значение рН равно 5,0 или ниже.

Способами по настоящему изобретению можно эффективно получать L-глутаминовую кислоту. Кроме того, в предпочтительном воплощении можно получать -кристаллы, которые как продукт являются предпочтительными.

Краткое пояснение фигур

Фиг.1 представляет карту рестрикции ферментами фрагмента ДНК из Enterobacter agglomerans в pTWVEK101.

На фиг.2 показано сравнение аминокислотной последовательности, установленной по нуклеотидной последовательности гена sucA из Enterobacter agglomerans (SEQ ID №1) и такового из Escherichia coli (вверху: Enterobacter agglomerans, внизу колонка: Escherichia coli (SEQ ID №5), тоже будет относится к последующему).

На фиг.3 показано сравнение аминокислотной последовательности, установленной по нуклеотидной последовательности гена sucB из Enterobacter agglomerans (SEQ ID №2) и такового из Escherichia coli (SEQ ID №6).

На фиг.4 показано сравнение аминокислотной последовательности, установленной по нуклеотидной последовательности гена sucC из Enterobacter agglomerans (SEQ ID №3) и такового из Escherichia coli (SEQ ID №7).

На фиг.5 показано сравнение аминокислотной последовательности, установленной по нуклеотидной последовательности гена sdhB из Enterobacter agglomerans (SEQ ID №4) и такового из Escherichia coli (SEQ ID №8).

На фиг.6 показана конструкция плазмиды pMWCPG, включающей ген gltA, ген ррс и ген gdhA.

На фиг.7 показана конструкция плазмиды RSF-Tet, включающей репликатор плазмиды RSF1010 для широкого спектра хозяев и ген устойчивости к тетрациклину.

На фиг.8 показана конструкция плазмиды RSFCPG, включающей репликатор плазмиды RSF1010 для широкого спектра хозяев, ген устойчивости к тетрациклину, ген gltA, ген ррс и ген gdhA.

На фиг.9 показана конструкция плазмиды pSTVCB, включающей ген gltA.

Подробное описание изобретения

В последующем настоящее изобретение будет пояснено подробно.

Способ получения по настоящему изобретению представляет способ получения L-глутаминовой кислоты ферментацией, который включает культивирование микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, в жидкой среде, рН которой доводится до значения, при котором L-глутаминовой кислоте, продуцированной микроорганизмом, дают возможность осаждаться, при допущении того, что L-глутаминовая кислота продуцируется и накапливается с сопровождаемым осаждением L-глутаминовой кислоты, в которой операцию, приводящую к присутствию кристаллов L-глутаминовой кислоты в среде, проводят, когда концентрация L-глутаминовой кислоты в среде ниже, чем концентрация, при которой происходит спонтанная кристаллизация.

Используемый здесь термин «спонтанная кристаллизация» означает, что за счет накопления L-глутаминовой кислоты микроорганизмом, обладающим способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, концентрация L-глутаминовой кислоты в среде превышает концентрацию насыщения и L-глутаминовая кислота спонтанно осаждается в среде.

Операция, приводящая к присутствию кристаллов L-глутаминовой кислоты в среде, означает операцию, при которой присутствие кристаллов вызывается искусственно. Примеры такой операции включают добавление кристаллов к среде, а также вынужденное осаждение при снижении, во время культивирования, рН среды, в которой определенное количество L-глутаминовой кислоты было растворено в начале культивирования.

Количество кристаллов, которое должно находиться в среде, обычно составляет от 0,01 до 10 г/л. Время, когда кристаллы должны присутствовать, предпочтительно является тем, когда накопившееся количество L-глутаминовой кислоты в среде возрастает до примерно концентрации насыщения (например, 25 г/л или выше при рН 4,5). Количество кристаллов, присутствующих в среде, и концентрацию L-глутаминовой кислоты можно определить способами, известными специалистам в данной области. Присутствующее количество кристаллов L-глутаминовой кислоты можно определить путем выдерживания среды при стоянии и выделения кристаллов из среды декантацией. Концентрация L-глутаминовой кислоты в среде означает концентрацию растворенной L-глутаминовой кислоты. Когда кристаллы осаждаются в среде, концентрация представляет определенную концентрацию осветленного раствора, полученного отделением твердых частиц центрифугированием (или фильтрованием).

Операция, приводящая к присутствию кристаллов L-глутаминовой кислоты, предпочтительно представляет добавление кристаллов L-глутаминовой кислоты.

Что касается кристаллов L-глутаминовой кислоты, то имеется -форма и -форма кристаллов (H.Takahashi, T.Takenishi, N.Nagashima, Bull. Chem. Soc. Japan, 35, 923 (1962); J.D.Bernal, Z.Krist, 78, 363 (1931); S.Hirokawa, Acta Cryst., 8, 637 (1955)). Когда предполагается получить -форму кристаллов, то предпочтительно добавляются кристаллы -формы.

Предпочтительное количество кристаллов варьируют в зависимости от условий таких, как форма кристаллов. Если кристаллы -формы, то обычно количество составляет 0,2 г/л или выше. Если количество больше, чем эта концентрация, кристаллы -формы можно получить с хорошей воспроизводимостью. Из-за их формы с кристаллами -формы легче обращаться по сравнению с кристаллами -формы.

Микроорганизмом, обладающим способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, используемым в первом способе получения по настоящему изобретению и во втором способе по настоящему изобретению, является микроорганизм, который накапливает значительное количество L-глутаминовой кислоты в среде, когда он культивируется в среде. Его примеры включают микроорганизмы, относящиеся к роду Enterobacter. Предпочтительным является Enterobacter agglomerans.

Кроме того, микроорганизмом, обладающим способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, используемым в способе получения по настоящему изобретению, предпочтительно является микроорганизм, который может метаболизировать источник углерода в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и источник углерода, при определенном значении рН, и обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем концентрацию насыщения L-глутаминовой кислоты в жидкой среде при вышеуказанном значении рН (далее также относящийся к «накапливающему L-глутаминовую кислоту микроорганизму»). Вышеуказанное определенное значение рН предпочтительно представляет значение рН, при котором L-глутаминовая кислота осаждается в среде, и такое значение рН обычно составляет 5,0 или ниже.

«Концентрация насыщения» означает концентрацию L-глутаминовой кислоты, растворенной в жидкой среде, когда жидкая среда насыщена L-глутаминовой кислотой.

Когда используется накапливающий L-глутаминовую кислоту микроорганизм, значение рН, подходящее для получения L-глутаминовой кислоты, предпочтительно равняется рН, при котором L-глутаминовая кислота осаждается в среде. Осуществляя культивирование при данном значении рН, L-глутаминовая кислота продуцируется и накапливается в среде с сопровождаемым осаждением.

Накапливающий L-глутаминовую кислоту микроорганизм можно получить следующим образом. Пробу, содержащую микроорганизмы, высевают в жидкую среду, содержащую L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения и источник углерода, при определенном значении рН, и отбирают штамм, который метаболизирует источник углерода. Несмотря на то что определенное значение рН особым образом не ограничивается, обычно оно составляет 5,0 или ниже, предпочтительно примерно 4,5 или ниже, более предпочтительно примерно 4,3 или ниже. Накапливающий L-глутаминовую кислоту микроорганизм используется для продуцирования L-глутаминовой кислоты ферментацией с сопровождаемым осаждением L-глутаминовой кислоты. Если значение рН является слишком высоким, становится затруднительным для микроорганизма продуцировать L-глутаминовую кислоту в количестве, достаточном для осаждения. Следовательно, значение рН предпочтительно находится в вышеуказанном пределе.

Если значение рН водного раствора, содержащего L-глутаминовую кислоту понижено, растворимость L-глутаминовой кислоты в значительной мере падает около значения рКа -карбоксильной группы (4,25, 25°С). Растворимость становится наименьшей в изоэлектрической точке (рН 3,2), и L-глутаминовая кислота в количестве, превышающем количество, соответствующее концентрации насыщения, осаждается. Несмотря на то что это зависит от состава среды, L-глутаминовая кислота растворяется в количестве 10-20 г/л при рН 3,2, 30-40 г/л при рН 4,0 и 50-60 г/л при рН 4,7 при примерно 30°С. Обычно нет необходимости делать рН 3,0 или ниже, поскольку эффект осаждения L-глутаминовой кислоты достигает своего верхнего предела, когда рН становится ниже определенного значения. Однако значение рН может быть равно 3,0 или ниже.

Кроме того, выражение, что микроорганизм «может метаболизировать источник углерода» означает, что он может размножаться или потреблять источник углерода, даже если он не может размножаться, т.е. оно указывает, что он катаболизирует источник углерода такой, как сахара или органические кислоты. В частности, например, если микроорганизм размножается, когда он культивируется в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения, при рН 5,0-4,0, предпочтительно при рН 4,5-4,0, более предпочтительно при рН 4,3-4,0, особенно предпочтительно при рН 4,0, при соответствующей температуре, например, 28°С, 37°С или 50°С, в течение 2-4 суток, данный микроорганизм может метаболизировать источник углерода в среде. Кроме того, например, если микроорганизм потребляет источник углерода, даже если микроорганизм не размножается, когда он культивируется в синтетической жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения, при рН 5,0-4,0, предпочтительно при рН 4,5-4,0, более предпочтительно при рН 4,3-4,0, особенно предпочтительно при рН 4,0, при соответствующей температуре, например 28°С, 37°С или 50°С, в течение 2-4 суток, микроорганизм представляет микроорганизм, который может метаболизировать источник углерода в среде.

Микроорганизм, который может метаболизировать источник углерода, включает микроорганизм, который может расти в вышеуказанной жидкой среде.

Кроме того, выражение, что микроорганизм «может расти» означает, что он может размножаться или может продуцировать L-глутаминовую кислоту даже, если он не может размножаться. В частности, например, если микроорганизм размножается, когда он культивируется в жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения, при рН 5,0-4,0, предпочтительно при рН 4,5-4,0, более предпочтительно при рН 4,3-4,0, особенно предпочтительно при рН 4,0, при соответствующей температуре, например 28°С, 37°С или 50°С в течение 2-4 суток, данный микроорганизм может расти в среде. Кроме того, например, если микроорганизм увеличивает количество L-глутаминовой кислоты в синтетической жидкой среде даже, если микроорганизм не размножается, когда микроорганизм культивируется в синтетической жидкой среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения, при рН 5,0-4,0, предпочтительно при рН 4,5-4,0, более предпочтительно при рН 4,3-4,0, особенно предпочтительно при рН 4,0, при соответствующей температуре, например 28°С, 37°С или 50°С в течение 2-4 суток, данный микроорганизм является микроорганизмом, который может расти в среде.

Описанный выше отбор может повторяться два или более раз в одинаковых условиях или при изменении рН, или концентрации L-глутаминовой кислоты. Отбор на ранней стадии может осуществляться в среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации ниже, чем концентрация насыщения, и затем последующий отбор может проводиться в среде, содержащей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения. Кроме того, могут быть отобраны штаммы с полезными свойствами такими, как высшая скорость размножения.

Накапливающий L-глутаминовую кислоту микроорганизм является микроорганизмом, который обладает способностью накапливать L-глутаминовую кислоту в количестве, превышающем количество, соответствующее концентрации насыщения L-глутаминовой кислоты в жидкой среде, в дополнении к свойствам, описанным выше. Значение рН вышеуказанной жидкой среды предпочтительно равняется тому же или близко к таковому значению для среды, использованной для скрининга микроорганизма, обладающего выше - указанными свойствами. Обычно микроорганизм становится чувствительным к L-глутаминовой кислоте при высокой концентрации, поскольку рН становится ниже. Следовательно, является предпочтительным, чтобы рН не было низким ввиду устойчивости к L-глутаминовой кислоте, но низкое значение рН является предпочтительным ввиду продуцирования L-глутаминовой кислоты с сопровождаемым ее осаждением. Для удовлетворения данных условий, значение рН может находиться в пределе 3-5, предпочтительно 4-5, более предпочтительно 4-4,7, еще более предпочтительно 4-4,5, особенно предпочтительно 4,0-4,3.

В качестве накапливающего L-глутаминовую кислоту микроорганизма или продуктов его селекции, можно упомянуть, например, микроорганизмы, относящиеся к роду Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus. Bacillus, Saccharomyces или тому подобное. Среди них микроорганизмы, относящиеся к роду Enterobacter, являются предпочтительными. В дальнейшем микроорганизм по настоящему изобретению будет пояснен в основном для микроорганизмов, относящихся к роду Enterobacter. Однако микроорганизм не ограничивается таковыми, относящимися к роду Enterobacter, и подобным образом могут быть использованы таковые, относящиеся к другим родам.

В качестве микроорганизма, относящегося к Enterobacter, особо можно упомянуть Enterobacter agglomerans, предпочтительно штамм Enterobacter agglomerans AJ13355. Данный штамм выделен из почвы в Iwata-shi, Shizuoka, Японии в качестве штамма, который может размножаться в среде, содержащей L-глутаминовую кислоту и источник углерода, при низком значении рН.

Физиологические свойства AJ13355 представлены ниже:

(1) Окрашивание по Граму: отрицательный (результат)

(2) Поведение в отношении кислорода: факультативный анаэроб

(3) Каталаза: положительный

(4) Оксидаза: отрицательный

(5) Способность восстанавливать нитраты: отрицательный

(6) Тест Вогес-Проскауера: положительный

(7) Тест с метиловым красным: отрицательный

(8) Уреаза: отрицательный

(9) Образование индола: положительный

(10) Подвижность: подвижен

(11) Образование H₂ S в среде TSI: слабоактивен

(12) -галактозидаза: положительный

(13) Свойство ассимилировать сахариды:

Арабиноза: положительный

Сахароза: положительный

Лактоза: положительный

Ксилоза: положительный

Сорбит: положительный

Инозит: положительный

Трегалоза: положительный

Мальтоза: положительный

Глюкоза: положительный

Адонит: отрицательный

Рафиноза: положительный

Салицин: отрицательный

Мелибиоза: положительный

(14) Свойство ассимилировать глицерозу: положительный

(15) Свойство ассимилировать органическую кислоту:

Лимонная кислота: положительный

Винная кислота: отрицательный

Глюконовая кислота: положительный

Уксусная кислота: положительный

Малоновая кислота: отрицательный

(16) Аргининдегидратаза: отрицательный

(17) Орнитиндекарбоксилаза: отрицательный

(18) Лизиндекарбоксилаза: отрицательный

(19) Фенилаланиндезаминаза: отрицательный

(20) Образование пигмента: желтый

(21) Способность разжижать желатин: положительный

(22) Значение рН роста: рост возможен при рН 4, хороший рост при рН 4,5-7.

(23) Температура роста: хороший рост при 25°С, хороший рост при 30°С, хороший рост при 37°С, рост возможен при 42°С, рост невозможен при 45°С.

Основываясь на данных бактериологических свойствах, AJ13355 был определен, как Enterobacter agglomerans.

Enterobacter agglomerans AJ13355 был депонирован в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (в настоящее время International Patent Organism Depositary National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) 19 февраля 1998 г. и получил инвентарный номер FERM Р-16644. Затем он был передан на международное хранение по Будапештскому соглашению от 11 января 1999 г. и получил инвентарный номер FERM BP-6644.

Накапливающий L-глутаминовую кислоту микроорганизм может быть микроорганизмом, исходно обладающим способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, или таковым, обладающим способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, наделенной или усиленной в результате селекции с использованием мутагенеза, методов рекомбинантной ДНК или тому подобное.

Способность продуцировать L-глутаминовую кислоту можно придать или усилить, например, повышением активности фермента, который катализирует реакцию биосинтеза L-глутаминовой кислоты. Способность продуцировать L-глутаминовую кислоту также можно усилить снижением или устранением активности фермента, который катализирует реакцию, которая расходится с путем биосинтеза L-глутаминовой кислоты, и в результате которой образуется иное соединение, чем L-глутаминовая кислота.

В качестве примеров фермента, который катализирует реакцию биосинтеза L-глутаминовой кислоты, можно упомянуть глутаматдегидрогеназу (в последующем также упоминаемую как «GDH»), глутаминсинтетазу, глутаматсинтазу, изоцитратдегидрогеназу, аконитатгидратазу, цитратсинтазу (в последующем также упоминаемую как «CS»), фосфоенолпируваткарбоксилазу (в последующем также упоминаемую как «РЕРС»), пируватдегидрогеназу, пируваткиназу, энолазу, фосфоглицеромутазу, фосфоглицераткиназу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу, триозофосфатизомеразу, фруктозобифосфатальдолазу, фосфофруктокиназу, глюкозофосфатизомеразу и так далее. Среди данных ферментов один, два или три из CS, РЕРС и GDH являются предпочтительными. Кроме того, является предпочтительным, чтобы у накапливающего L-глутаминовую кислоту микроорганизма была повышена активность всех трех ферментов CS, РЕРС и GDH. В частности, CS Brevibacterium lactofennentum является предпочтительной, поскольку она не испытывает ингибирования -кетоглутаровой кислотой, L-глутаминовой кислотой и NADH.

Для того чтобы повысить активность CS, РЕРС или GDH, например, можно клонировать ген, кодирующий CS, РЕРС или GDH, в соответствующей плазмиде, и микроорганизм-хозяин можно трансформировать полученной плазмидой. Число копий гена, кодирующего CS, РЕРС или GDH (в последующем обозначенные соответственно, как «ген gltA», ген «ррс» и ген «gdhA»), в трансформированной клетке штамма возрастает, приводя к повышению активности CS, РЕРС и GDH.

Клонированные гены gltA, ррс и gdhA вводят в вышеуказанный исходный родительский штамм по отдельности или в комбинации из них произвольных двух или трех видов. Когда вводят два или три вида генов, два или три вида генов можно клонировать в одном виде плазмиды и вводить в хозяина или клонировать по отдельности в одном или трех видах плазмид, которые могут сосуществовать, и вводить в хозяина.

Два или более видов генов, кодирующих фермент одного и того же вида, но полученные из различных микроорганизмов, можно вводить в одного и того же хозяина.

Описанные выше плазмиды особым образом не ограничиваются при условии, что они воспроизводятся автономно в клетке микроорганизма, относящегося, например, к роду Enterobacter или тому подобное. Однако можно упомянуть, например, pUC19, pUC18, PBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pACYC177, pACYC184 и так далее. Помимо них можно также использовать фаговые ДНК-векторы.

Трансформацию можно проводить, например, по методу D.M.Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), методом, в котором проницаемость клеток бактерий-реципиентов для ДНК увеличивается при обработке клеток хлоридом кальция (Mandel М. and Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), электропорацией (Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992) и тому подобное.

Активность CS, РЕРС или GDH также можно увеличить за счет присутствия множественных копий гена gltA, гена ррс или гена gdhA в хромосомной ДНК вышеуказанного исходного родительского штамма, который является хозяином. Для того чтобы ввести множественные копии гена gltA, гена ррс или гена gdhA в хромосомную ДНК микроорганизма, относящегося к роду Enterobacter или тому подобное, можно использовать последовательность этих множественных копий, находящихся в хромосомной ДНК, такую, как повторяющаяся ДНК и инвертированные повторы, находящиеся в конце перемещающегося элемента. Альтернативно, множественные копии генов можно вводить в хромосомную ДНК с использованием перемещения транспозона, включающего ген gltA, ген ррс или ген gdhA. В результате число копий гена gltA, гена ррс или гена gdhA в трансформированной штаммовой клетке увеличивается, и таким образом, увеличивается активность CS, РЕРС или GDH.

Что касается организмов, используемых в качестве источника гена gltA, гена ррс или гена gdhA, чье число копий следует увеличить, то можно использовать любой организм при условии, что он обладает активностью CS, РЕРС или GDH. Кроме того, предпочтительными являются бактерии, которые представляют прокариоты, например, таковые, относящиеся к роду Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium или Bacillus. В качестве конкретных примеров можно упомянуть Escherichia coli, Brevibacterium lactofermentum и так далее. Ген gltA, ген ррс и ген gdhA можно получить из хромосомной ДНК микроорганизмов, описанных выше.

Ген gltA, ген ррс и ген gdhA можно получить с использованием мутантного штамма, который имеет недостаток активности CS, РЕРС или GDH, с выделением фрагмента ДНК, который усиливает его ауксотрофность, из хромосомной ДНК вышеуказанного микроорганизма. Кроме того, поскольку нуклеотидные последовательности данных генов бактерий Escherichia и Corynebacterium уже установлены (Biochemistry, 22, pp.5243-5249 (1983); J. Biochem., 95, pp.909-916 (1984); Gene, 27, pp.193-199 (1984); Microbiology, 140, pp.1817-1828 (1994); Mol. Gen. Genet., 218, pp.330-339 (1989); Molecular Microbiology, 6, pp.317-326 (1992), они также могут быть получены ПЦР с использованием праймеров, синтезированных на основе каждой нуклеотидной последовательности и хромосомной ДНК в качестве матрицы.

Активность CS, PEPC или GDH также можно повысить увеличением экспрессии гена gltA, гена ррс или гена gdhA, помимо вышеуказанной амплификации генов. Например, экспрессию можно увеличить, заменив промотор гена gltA, гена ррс или гена gdhA на другой более сильный промотор. Например, в качестве более сильных промоторов известны промотор lac, промотор trp, промотор trc, промотор tac, промотор P_R и промотор P_L лямда-фага и так далее. Ген gltA, ген ррс и ген gdhA, чей промотор замещен, клонируются в плазмиде и вводятся в микроорганизм-хозяин, или вводятся в хромосомную ДНК микроорганизма-хозяина с использованием повторяющейся ДНК, инвертированной повторности, транспозона или тому подобное.

Активность CS, PEPC или GDH также можно повысить замещением промотора гена gltA, гена ррс или гена gdhA в хромосоме на другой более сильный промотор (смотри W087/03006 и выложенную заявку на патент Японии №61-268183) или вставкой более сильного промотора выше кодирующей последовательности каждого гена (смотри Gene, 29, pp.231-241 (1984)). В частности, можно провести гомологичную рекомбинацию между геном gltA, геном ррс или геном gdhA, чей промотор замещен на более сильный, или ДНК, включающей его часть, и соответствующим геном в хромосоме.

Примеры фермента, который катализирует реакцию, которая расходится с путем биосинтеза L-глутаминовой кислоты, и в результате которой образуется иное соединение, чем L-глутаминовая кислота, включают -кетоглутаратдегидрогеназу (в последующем также именуемую как « KGDH»), изоцитратлиазу, фосфатацетилтрансферазу, ацетаткиназу, ацетоксигидрокси(кислота)-синтазу, ацетолактатсинтазу, форматацетилтрансферазу, лактатдегидрогеназу, глутаматдекарбоксилазу, 1-пирролиндегидрогеназу и так далее. Среди данных ферментов предпочтительной является KGDH.

Для того чтобы уменьшить или устранить активность вышеуказанных ферментов у микроорганизма, относящегося к роду Enterobacter, или тому подобное, можно ввести мутации для уменьшения или устранения внутриклеточной активности ферментов в гены вышеуказанных ферментов обычным методом мутагеназа или генно-инженерным методом.

Примеры метода мутагенеза включают, например, методы, в которых используется облучение рентгеновскими лучами или ультрафиолетовыми лучами, методы, в которых используется обработка мутагенным агентом таким, как N-метил-N'-нитро-N-нитрозо-гуанидин, и так далее. Сайт гена, куда вводят мутацию, может находиться в кодирующей области, кодирующей фермент-белок, или области, регулирующей экспрессию такой, как промотор.

Примеры генно-инженерных методов включают, например, методы, в которых используется рекомбинация генов, трансдукция, слияние клеток и так далее. Например, ген резистентности к лекарственному препарату вставляется в клонированный целевой ген с получением гена, который потерял его функцию (дефектный ген). Затем данный дефектный ген вводится в клетку микроорганизма-хозяина, и целевой ген в хромосоме замещается на вышеуказанный дефектный ген с использованием гомологичной рекомбинации (разрыв генов).

Снижение или недостаток внутриклеточной активности целевого фермента и степень снижения активности можно подтвердить определением активности фермента в клеточном экстракте или его очищенной фракции, полученных из штамма-кандидата, и сравнением ее с таковой у дикого штамма. Например, активность KGDH можно определить методом Reed et al. (Reed L.J. and Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, pp.55-61 (1969)).

В зависимости от целевого фермента целевой мутантный штамм можно отобрать, основываясь на фенотипе мутантного штамма. Например, мутантный штамм, в котором активность KGDH устранена или понижена, не может размножаться или показывает заметно пониженную скорость размножения в минимальной среде, содержащей глюкозу, или минимальной среде, содержащей уксусную кислоту или L-глутаминовую кислоту, в качестве единственного источника углерода в аэробных условиях культивирования. Однако нормальное размножение делается возможным в тех же условиях при добавлении янтарной кислоты или лизина, метионина и диаминопимелиновой кислоты в минимальную среду, содержащую глюкозу. Используя данные явления в качестве индикаторов, можно отобрать мутантный штамм с пониженной активностью или недостаточной активностью KGDH.

Способ получения штамма Brevibacterium lactofermentum с дефицитным геном KGDH с использованием гомологичной рекомбинации подробно описан в W095/34672. Подобные методы можно использовать для других микроорганизмов.

Кроме того, такие способы, как клонирование генов и расщепление и лигирование ДНК, трансформация и так далее, подробно описаны в Molecular Cloning, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Press (1989) и так далее.

В качестве конкретного примера мутантного штамма с недостаточной активностью KGDH или пониженной активностью KGDH, полученного как описано выше, можно упомянуть Enterobacter agglomerans AJ13356. Enterobacter agglomerans AJ13356 был депонирован в National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (в настоящее время International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Techgology) в феврале 1998 г. и получил инвентарный номер FERM Р-16645. Затем он был передан на международное хранение по Будапештскому соглашению от 11 января 1999 г., и получил инвентарный номер FERM BP-6615. Enterobacter agglomerans AJ13356 имеет недостаток активности KGDH в результате разрыва субъединичного гена KGDH-E1 (sucA).

Когда Enterobacter agglomerans, который представляет пример микроорганизма, используемого по настоящему изобретению, культивируют в среде, включающей сахарид, внеклеточно секретируется слизь, иногда приводящая к низкой эффективности процесса. Следовательно, когда используется Enterobacter agglomerans, имеющий такое свойство секреции слизи, предпочтительно использовать мутантный штамм, который секретирует меньше слизи по сравнению с диким штаммом. Примеры методов мутагенеза включают, например, методы с использованием облучения рентгеновскими лучами или ультрафиолетовыми лучами, метод с использованием обработки мутагенным агентом таким, как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина, и так далее. Мутантный штамм с пониженной секрецией слизи можно отобрать при посеве полученных в результате мутации бактериальных клеток в среду, содержащую сахарид, например, на чашках со средой LB, содержащей 5 г/л глюкозы, культивируя их при наклоне чашки под углом примерно 45° и отбирая колонию, которая не показывает стекания слизи.

В настоящем изобретении придание или усиление способности продуцировать L-глутаминовую кислоту и придание других полезных свойств таких, как мутация в отношении меньшей секреции слизи, описанная выше, можно провести в произвольном порядке.

Культивированием микроорганизма, обладающего способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту, в жидкой среде, рН которой доводится до условия, которое позволяет L-глутаминовой кислоте осаждаться, L-глутаминовую кислоту можно получить и накопить с сопровождаемым ее осаждением в среде.

Предпочтительно культивированием накапливающего L-глутаминовую кислоту микроорганизма в жидкой среде, рН которой доводится до условия, которое позволяет L-глутаминовой кислоте осаждаться, L-глутаминовую кислоту можно получить и накопить с сопровождаемым ее осаждением в среде. Кроме того, возможно, чтобы культивирование начиналось при нейтральном значении рН, и рН становится условием, которое позволяет L-глутаминовой кислоте осаждаться, когда культивирование завершено.

«Условие, которое позволяет L-глутаминовой кислоте осаждаться», упомянутое здесь, означает условие, которое позволяет L-глутаминовой кислоте осаждаться, когда вышеуказанный микроорганизм продуцирует и накапливает L-глутаминовую кислоту. Например, оно обычно равно 3-5, когда микроорганизм представляет бактерию Enterobacter.

Микроорганизм можно культивировать при значении рН, подходящем для его роста в начале, и затем культивировать при условии, которое позволяет L-глутаминовой кислоте осаждаться. Например, когда среда содержит источник сахара, который микроорганизм не может ассимилировать при условии, которое позволяет L-глутаминовой кислоте осаждаться, или органическую кислоту, которая ингибирует рост микроорганизма при условии, которое позволяет L-глутаминовой кислоте осаждаться, микроорганизм можно культивировать при условии, при котором микроорганизм может ассимилировать источник сахара, или рост микроорганизма не ингибируется под действием органической кислоты для того, чтобы микроорганизм потреблял источник сахара или органическую кислоту, и затем культивировался при условии, которое позволяет L-глутаминовой кислоте осаждаться.

В качестве среды для культивирования можно использовать обычную питательную среду, содержащую источник углерода, источник азота, минеральные соли и органические питательные вещества в следовых количествах такие, как аминокислоты и витамины, при условии, что значение рН доведено таким образом, чтобы удовлетворить заранее определенному условию. Можно использовать синтетическую среду или естественную среду. Источник углерода и источник азота, используемые в среде, могут быть любыми, при условии, что они могут использоваться штаммом, который культивируется.

В качестве источника углерода используются сахариды такие, как глюкоза, глицерин, фруктоза, сахароза, мальтоза, манноза, галактоза, гидролизат крахмала и меласса. Кроме того, можно использовать органические кислоты такие, как уксусная кислота и лимонная кислота, одни или в сочетании с другим источником углерода.

В качестве источника азота используют аммиак, соли аммония такие, как сульфат аммония, карбонат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония и ацетат аммония и так далее.

В качестве органических питательных веществ в следовых количествах используют аминокислоты, витамины, жирные кислоты, нуклеиновые кислоты, содержащие их вещества такие, как пептон, касаминокислоты, дрожжевой экстракт и продукты разложения соевого белка. Когда для ауксотрофного мутантного штамма необходима аминокислота и так далее для метаболизма или роста, необходимо добавить требуемый питательный компонент.

В качестве минеральных солей используют фосфаты, соли магния, соли кальция, соли железа, соли марганца и так далее.

Культивирование обычно проводят при аэрации при условии температуры культивирования от 20 до 42°С и рН от 3 до 5, предпочтительно от 4 до 5, более предпочтительно от 4 до 4,7, особенно предпочтительно от 4 до 4,5. Значительное количество L-глутаминовой кислоты обычно накапливается после культивирования в течение примерно от 10 ч до примерно 4 суток. Часть накопившейся L-глутаминовой кислоты, которая превышает концентрацию насыщения, осаждается в среде.

После окончания культивирования осажденную L-глутаминовую кислоту в культуре можно собрать центрифугированием, фильтрованием и тому подобное. Растворенную в среде L-глутаминовую кислоту также можно собрать известными способами. Например, L-глутаминовую кислоту можно выделить концентрированием культурального бульона с ее кристаллизацией или выделением ионообменной хроматографией или тому подобное. Также возможно выкристаллизовать растворенную в среде L-глутаминовую кислоту и затем собрать осажденную L-глутаминовую кислоту в культуральном бульоне вместе с выкристаллизовавшейся L-глутаминовой кислотой.

Когда L-глутаминовая кислота, превышающая концентрацию насыщения, осаждается, концентрация растворенной в среде L-глутаминовой кислоты сохраняется на постоянном уровне. Следовательно, влияние L-глутаминовой кислоты в высокой концентрации на микроорганизмы может быть снижено. Соответственно, также становится возможным селекционировать микроорганизм, обладающий дополнительно улучшенной способностью продуцировать L-глутаминовую кислоту. Кроме того, поскольку L-глутаминовая кислота осаждается в виде кристаллов, подавляется подкисление культурального бульона за счет накопления L-глутаминовой кислоты, и, следовательно, можно значительно снизить количество щелочи, использованной для сохранения рН культуры. При условии, что настоящее изобретение не предназначено для связывания с какой-либо теорией, причиной того, что выход L-глутаминовой кислоты улучшен при осуществлении операции, приводящей к присутствию кристаллов L-глутаминовой кислоты в среде, когда концентрация L-глутаминовой кислоты в среде ниже, чем концентрация, при которой происходит спонтанная кристаллизация, в случае, когда L-глутаминовая кислота осаждается, как описано выше, полагается следующее.

При ферментации L-глутаминовой кислоты с сопровождаемым осаждением, продуцирование L-глутаминовой кислоты имеет тенденцию достигать своего предела, когда происходит спонтанная кристаллизация. Полагается, что это имеет место за счет того, что концентрация L-глутаминовой кислоты является наиболее высокой на поверхностях клеток, когда происходит спонтанная кристаллизация, и осаждение происходит на поверхностях, тем самым мешая веществам двигаться около мембраны, снижая активность бактерий. Если присутствие кристаллов вызывается искусственно, перед тем, как происходит спонтанная кристаллизация, кристаллы служат в качестве затравки, чтобы вызвать осаждение на поверхностях кристаллов, тем самым предотвращая снижение активности бактерий.

ПРИМЕРЫ

В дальнейшем настоящее изобретение будет более конкретно пояснено при обращении к следующим примерам. В примерах аминокислоты являются L-аминокислотами, если не указано иначе.

Ссылочный пример 1

<1> Скрининг микроорганизма, обладающего резистентностью к L-глутаминовой кислоте в кислых условиях

Скрининг микроорганизма, обладающего резистентностью к L-глутаминовой кислоте в кислых условиях, проводили следующим образом. Один (1) г каждой из примерно 500 проб, полученных из природы, включая почву, фрукты, растения, речную воду и так далее, суспендировали в 5 мл стерильной воды, и 200 мкл из нее высевали на 20 мл твердой среды с рН, доведенным до 4,0, с помощью HCl. Состав среды был следующим: 3 г/л глюкозы, 1 г/л сульфата аммония, 0,2 г/л сульфата магния гептагидрата, 0,5 г/л первичного кислого фосфата калия, 0,2 г/л хлорида натрия, 0,1 г/л хлорида кальция дигидрата, 0,01 г/л сульфата железа (2) гептагидрата, 0,01 г/л сульфата марганца тетрагидрата, 0,72 мг/л сульфата цинка дигидрата, 0,64 мг/л сульфата меди пентагидрата, 0,72 мг/л хлорида кобальта гексагидрата, 0,4 мг/л борной кислоты, 1,2 мг/л молибдата натрия дигидрата, 50 мкг/л биотина, 50 мкг/л пантотената кальция, 50 мкг/л фолиевой кислоты, 50 мкг/л инозита, 50 мкг/л ниацина, 50 мкг/л п-аминобензойной кислоты, 50 мкг/л пиридоксина гидрохлорида, 50 мкг/л рибофлавина, 50 мкг/л тиамина гидрохлорида, 50 мкг/л циклогексимида и 20 г/л агара.

Засеянные вышеуказанными пробами среды инкубировали при 28°С, 37°С или 50°С в течение 2-4 суток и получали 378 колониеобразующих штаммов.

Затем каждый из штаммов, полученных как описано выше, высевали в культуральную пробирку длиной 16,5 см и диаметром 14 мм, содержащую 3 мл жидкой среды (с рН, доведенным HCl до 4,0), включающей L-глутаминовую кислоту в концентрации насыщения, и культивировали при 28°С, 37°С или 50°С в течение от 24 ч до 3 суток при встряхивании. Затем отбирали выросшие штаммы. Состав вышеуказанной среды был следующим: 40 г/л глюкозы, 20 г/л сульфата аммония, 0,5 г/л сульфата магния гептагидрата, 2 г/л первичного кислого фосфата калия, 0,5 г/л хлорида натрия, 0,25 г/л хлорида кальция дигидрата, 0,02 г/л сульфата железа (2) гептагидрата, 0,02 г/л сульфата марганца тетрагидрата, 0,72 мг/л сульфата цинка дигидрата, 0,64 мг/л сульфата меди пентагидрата, 0,72 мг/л хлорида кобальта гексагидрата, 0,4 мг/л борной кислоты, 1,2 мг/л молибдата натрия дигидрата и 2 г/л дрожжевого экстракта.

Таким образом, с успехом было получено 78 штаммов микроорганизмов, показывающих резистентность к L-глутаминовой кислоте в кислых условиях.

<2> Отбор штаммов, показывающих наибольшую скорость роста, из микроорганизмов, обладающих резистентностью к L-глутаминовой кислоте в кислых условиях

Различные микроорганизмы, обладающие резистентностью к L-глутаминовой кислоте в кислых условиях, полученные как описано выше, высевали в культуральную пробирку длиной 16,5 см и диаметром 14 мм, содержащую 3 мл среды (с рН, доведенным HCl до 4,0), полученную добавлением 20 г/л глутаминовой кислоты и 2 г/л глюкозы к среде М9 (Sambrook, J., Fritsh E.F. and Maniatis Т., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989), и во времени определяли мутность среды для отбора штаммов, показывающих подходящую скорость роста. В результате был получен штамм AJ13355 в качестве штамма, показывающего подходящий рост, из почвы в Iwata-shi, Shizuoka, Японии. Данный штамм был определен как Enterobacter agglomerans, основываясь на его бактериологических свойствах, описанных выше.

<3> Получение штамма с наименьшей секрецией слизи штамма Enterobacter agglomerans AJ13355

Поскольку штамм Enterobacter agglomerans AJ13355 внеклеточно секретирует слизь при культивировании в среде, содержащей сахарид, эффективность процесса является неудовлетворительной. Следовательно, был получен штамм с меньшей секрецией слизи облучением ультрафиолетовыми лучами (Miller J.H. et al., "A Short Course in Bacterial Genetics; Laboratory Manual", p.150, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.).

Штамм Enterobacter agglomerans AJ13355 облучали ультрафиолетовыми лучами в течение 2 мин на расстоянии 60 см от ультрафиолетовой лампы 60-W и культивировали в среде LB в течение ночи для фиксированной мутации. Полученный в результате мутации штамм разбавляли и высевали в среду LB, содержащую 5 г/л глюкозы и 20 г/л агара так, чтобы появилось примерно 100 колоний на чашку, и культивировали при 30°С в течение ночи при наклоне чашки примерно под углом 45°, и затем отбирали 20 колоний, не показывающих стекания слизи.

В качестве штамма, удовлетворяющего условиям о том, чтобы ревертанты не появлялись даже после субкультивирования в течение 5 раз в среде LB, содержащей 5 г/л глюкозы и 20 г/л агара, и чтобы наблюдался рост, эквивалентный родительскому штамму в среде LB, среде LB, содержащей 5 г/л глюкозы, и среде М9 (Sambrook, J. et al., "Molecular Cloning", 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Press, U.S.A., 1989) при добавлении 20 г/л L-глутаминовой кислоты и 2 г/л глюкозы и доведении рН HCl до 4,5, выбрали штамм SC17 из отобранных выше штаммов.

<4> Конструкция продуцирующей L-глутаминовую кислоту бактерии из штамма Enterobacter agglomerans SC17

(1) Получение дефицитного по KGDH штамма из штамма Enterobacter agglomerans SC17

Получили штамм, дефицитный по KGDH и обладающий повышенным биосинтезом L-глутаминовой кислоты из штамма Enterobacter agglomerans SC17.

(i) Клонирование гена KGDH (в последующем именуемым как «sucAB») штамма Enterobacter agglomerans AJ13355

Ген sucAB штамма Enterobacter agglomerans AJ13355 клонировали отбором фрагмента ДНК, комплементарного свойству не ассимилировать уксусную кислоту субъединичного гена KGDH-E1 (в последующем именуемым как «sucA») - дефицитного штамма Escherichia coli из хромосомной ДНК штамма Enterobacter agglomerans АJ13355.

Хромосомную ДНК штамма Enterobacter agglomerans АJ13355 выделяли методом, обычно используемым для экстракции хромосомной ДНК из Escherichia coli (Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Япония, pp.97-98, Baifukan, 1992). pTWV228 (резистентная к ампициллину), использованная в качестве вектора, представляла коммерческий продукт от Takara Shuzo Co., Ltd.

Хромосомную ДНК штамма AJ13355 расщепляли ЕсоТ221, и PTWV228, расщепленную PstI, лигировали с использованием Т4-лигазы и использовали для трансформации sucA-дефицитного штамма Escherichia coli JRG465 (Herbert, J. et al., Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). Штамм, растущий в ацетатной минимальной среде отбирали из штаммов-трансформантов, полученных выше, из него выделяли плазмиду и обозначали как pTWVEK101. Штамм Escherichia coli JRG465, включающий pTWVEK101, проявлял ауксотрофность в отношении янтарной кислоты или L-лизина и L-метионина, помимо признака свойства не ассимилировать уксусную кислоту. Данное предполагает, что pTWVEK101 включала ген sucA Enterobacter agglomerans.

На фиг.1 представлена карта рестрикции ферментами фрагмента ДНК, выделенного из Enterobacter agglomerans, в pTWVEK101. В нуклеотидной последовательности полученного участка на фиг.1 считается, что нуклеотидные последовательности представляют полные длины ORFs, и считается, что две нуклеотидные последовательности представляют неполные последовательности ORFs. В результате поиска их взаимной гомологии было установлено, что участки, чьи нуклеотидные последовательности были определены, включали 3'-конец неполной последовательности гена сукцинатдегидрогеназы-содержащего железо-серу белка (sdhB), полной длины sucA и субъединичного гена KGDH-E2 (ген sucB) и 5'-конец неполной последовательности субъединичного гена сукцинил-СоА-синтетазы (ген sucC). Результаты сравнения аминокислотных последовательностей, полученных по данным нуклеотидных последовательностей, с таковыми, полученными из Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, pp.351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, pp.361-374 (1984); Biochemistry, 24, pp.6245-6252 (1985)), представлены на фиг.2-5. Аминокислотные последовательности или их части, кодированные sucA, sucB и sucC, полученными из Enterobacter agglomerans, показаны последовательностями SEQ ID №№1-4, и кодированные последовательностями, полученными из Escherichia coli, показаны последовательностями SEQ ID №№5-8. Таким образом, аминокислотные последовательности показали очень высокую взаимную гомологию друг к другу. Кроме того, было установлено, что кластер sdhB-sucA-sucB-sucC входил в состав хромосомы Enterobacter agglomerans, как и у Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, pp.351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, pp.361-374 (1984); Biochemistry, 24, pp.6245-6252 (1985)).

(ii) Получение дефицитного по KGDH штамма из штамма Enterobacter agglomerans SC17

Проводили гомологичную рекомбинацию с использованием гена sucAB Enterobacter agglomerans, полученного, как описано выше, с получением дефицитного по KGDH штамма Enterobacter agglomerans.

После расщепления pTWVEK101 с помощью SphI для вырезания фрагмента, включающего sucA, у фрагмента «затупляли концы» фрагментом Кленова (Takara Shuzo Co., Ltd.) и лигировали с pBR322, расщепленной EcoRI, и «затупляли концы» фрагментом Кленова с использованием Т4 ДНК-лигазы (Takara Shuzo Co., Ltd.). Полученную плазмиду расщепляли в рестрикционном сайте узнавания фермента BglII, расположенном примерно в центре sucA с использованием фермента, «затупляли концы» фрагментом Кленова и затем вновь лигировали с использованием Т4 ДНК-лигазы. Полагалось, что ген sucA, ставший нефункциональным в результате мутации со сдвигом рамки, вводили в sucA вновь сконструированной плазмиды вышеуказанным методом.

Плазмиду, сконструированную как описано выше, расщепляли ферментом рестрикции ApaLI и подвергали электрофорезу в агарозном геле с получением фрагмента ДНК, включающего sucA, в который ввели мутацию со сдвигом рамки и ген резистентности к тетрациклину, полученный из pBR322. Выделенный фрагмент ДНК вновь лигировали с использованием Т4 ДНК-лигазы в целях конструирования плазмиды для разрыва гена KGDH.

Плазмиду для разрыва гена KGDH, полученную как описано выше, использовали для трансформации штамма Enterobacter agglomerans SC17 электропорацией (Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", p.279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992), и получали штамм, в котором sucA в хромосоме замещали одним мутантным типом плазмиды гомологичной рекомбинацией, с использованием резистентности к тетрациклину в качестве маркера. Полученный штамм обозначали как штамм SC17sucA.

Для подтверждения того, что штамм SC17sucA является дефицитным по активности KGDH, определяли активность фермента по методу Reed et al. (Reed L.J. and Mukherjee В.В., Methods in Enzymology, 13, pp.55-61 (1969)) с использованием клеток штамма, культивированного в среде LB в логарифмической фазе роста. В результате в штамме SC17 была определена активность KGDH, равная 0,073 ( ABS/мин/мг белка), в то время как активность KGDH не была обнаружена в штамме SC17sucA, и таким образом было подтверждено, что sucA был элиминирован, как и предполагалось.

(2) Усиление системы биосинтеза L-глутаминовой кислоты штамма Enterobacter agglomerans SC17sucA

Затем полученные из Escherichia coli ген цитратсинтазы, ген фосфоенолпируваткарбоксилазы и ген глутаматдегидрогеназы вводили в штамм SC17sucA.

(i) Получение плазмиды, включающей ген gltA, ген ррс и ген gdhA из Escherichia coli

Методы получения плазмиды, включающей ген gltA, ген ррс и ген gdhA, будут пояснены при обращении к фиг.6 и 7.

Плазмиду, включающую ген gdhA из Escherichia coli, pBRGDH (выложенная заявка на патент Японии №7-203980), расщепляли HindIII и SphI, оба конца «затупляли» обработкой Т4 ДНК-полимеразой, и затем очищали и выделяли фрагмент ДНК, включающий ген gdhA. Отдельно плазмиду, включающую ген gltA и ген ррс из Escherichia coli, pMWCP (W097/08294), расщепляли XbaI, и затем оба конца «затупляли» с использованием Т4 ДНК-полимеразы. Ее смешивали с выделенным выше фрагментом ДНК, включающим ген gdhA, и лигировали с использованием Т4-лигазы с получением плазмиды pMWCPG, которая относится к pMWCP, дополнительно включающей ген gdhA (фиг.6).

В то же время плазмиду pVIC40 (выложенная заявка на патент Японии №8-047397), включающую репликатор плазмиды RSF1010 для широкого спектра хозяев, расщепляли NotI, обрабатывали Т4 ДНК-полимеразой и расщепляли PstI. pBR322 расщепляли ЕсоТ14I, обрабатывали Т4 ДНК-полимеразой и расщепляли PstI. Оба продукта смешивали и лигировали с использованием Т4-лигазы с получением плазмиды RSF-Tet, включающей репликатор RSF1010 и ген устойчивости к тетрациклину (фиг.7).

Затем pMWCPG расщепляли EcoRI и PstI, и фрагмент ДНК, включающий ген gltA, ген ррс и ген gdhA, очищали и выделяли. RSF-Tet подобным образом расщепляли EcoRI и PstI, и фрагмент ДНК, включающий репликатор RSF1010, очищали и выделяли. Оба продукта смешивали и лигировали с использованием Т4-лигазы с получением плазмиды RSFCPG, которая соответствовала RSF-Tet, включающей ген gltA, ген ррс и ген gdhA (фиг.8). Было подтверждено, что полученная плазмида RSFCPG экспрессировала ген gltA, ген ррс и ген gdhA, основываясь на дополнении ауксотрофности дефицитного по гену gltA, гену ррс или гену gdhA, штамма, полученного из Escherichia coli и определений активности каждого фермента.

(ii) Получение плазмиды, включающей ген gltA, полученный из Brevibacterium lactofermentum

Плазмиду, включающую ген gltA, полученный из Brevibacterium lactofermentum, конструировали следующим образом. Проводили ПЦР с использованием ДНК-праймеров, которые получали на основе нуклеотидной последовательности гена gltA Corynebacterium glutamicum (Microbiology, 140, pp.1817-1828 (1994)) и хромосомной ДНК Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 в качестве матрицы для получения фрагмента гена gltA размером примерно 3 т.п.о. Данный фрагмент вставляли в плазмиду pHSG399 (получена от Takara Shuzo Co., Ltd.), расщепленную Smal, с получением плазмиды pHSGCB (фиг.9). Затем pHSGCB расщепляли HindIII и вырезанный фрагмент гена gltA размером примерно 3 т.п.о. вставляли в плазмиду pSTV29 (полученную от Takara Shuzo Co., Ltd.), расщепленную HindIII, с получением плазмиды pSTVCB (фиг.9). Было подтверждено, что полученная плазмида pSTVCB экспрессировала ген gltA по определению активности фермента в штамме Enterobacter agglomerans AJ13355.

(iii) Введение RSFCPG и pSTVCB в штамм SC17sucA

Штамм Enterobacter agglomerans SC17sucA трансформировали с использованием RSFCPG электропорацией с получением штамма-трансформанта SC17sucA/RSFCPG, показывающего резистентность к тетрациклину. Затем штамм SC17sucA/RSFCPG трансформировали pSTVCB электропорацией с получением штамма-трансформанта SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB, показывающего резистентность к хлорамфениколу.

<5> Получение штамма с повышенной реаистентностыо к L-глутаминовой кислоте при низком значении рН

Штамм с повышенной резистентностью к L-глутаминовой кислоте в высокой концентрации при низком значении рН (в последующем также именуемый как «штамм с Glu-резистентностыо в высокой концентрации при низком рН») выделяли из штамма Enterobacter agglomerans SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB.

Штамм SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB культивировали в течение ночи при 30°С в среде LBG (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl, 5 г/л глюкозы) и клетки, промытые физиологическим раствором, соответствующим образом разбавляли и высевали на чашки со средой М9-Е (4 г/л глюкозы, 17 г/л Na₂HPO₄ ·12H₂O, 3 г/л КН₂PO₄, 0,5 г/л NaCl, 1 г/л NH₄Cl, 10 мМ MgSO₄, 10 мкМ CaCl₂, 50 мг/л L-лизина, 50 мг/л L-метионина, 50 мг/л DL-диаминопимелиновой кислоты, 25 мг/л тетрациклина, 25 мг/л хлорамфеникола, 30 г/л L-глутаминовой кислоты, с рН, доведенным до 4,5 водным раствором аммиака). Колонию, появившуюся после культивирования при 32°С в течение 2 суток, получали в качестве штамма с Glu-резистентностью в высокой концентрации при низком рН.

Для полученного штамма определяли степень роста в жидкой среде М9-Е и тестировали способность продуцировать L-глутаминовую кислоту в больших культуральных пробирках емкостью 50 мл, содержащих 5 мл опытной среды для продукции L-глутаминовой кислоты (40 г/л глюкозы, 20 г/л сульфата аммония, 0,5 г/л сульфата магния гептагидрата, 2 г/л первичного кислого фосфата калия, 0,5 г/л хлорида натрия, 0,25 г/л хлорида кальция дигидрата, 0,02 г/л сульфата железа (2) гептагидрата, 0,02 г/л сульфата марганца тетрагидрата, 0,72 мг/л сульфата цинка дигидрата, 0,64 мг/л сульфата меди пентагидрата, 0,72 мг/л хлорида кобальта гексагидрата, 0,4 мг/л борной кислоты, 1,2 мг/л молибдата натрия дигидрата, 2 г/л дрожжевого экстракта, 200 мг/л L-лиэина гидрохлорида, 200 мг/л L-метионина, 200 мг/л DL- , -диаминопимелиновой кислоты, 25 мг/л тетрациклина гидрохлорида и 25 мг/л хлорамфеникола). Штамм, который показывал наилучшую степень роста и такую же способность продуцировать L-глутаминовую кислоту, как и его родительский штамм, штамм SC17/RSFCPG+pSTVCB, обозначали как Enterobacter agglomerans AJ13601. Штамм был депонирован в National Institute of Bio-science and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (в настоящее время International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Япония) 18 августа 1999 г. и получил инвентарный номер FERM Р-17516. Затем он был передан на международное хранение по Будапештскому соглашению от 6 июля 2000 г. и получил инвентарный номер FERM BP-7207.

Пример 1

Штамм Enterobacter agglomerans AJ13601 культивировали на агаровой среде LBG (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl и 15 г/л агара), содержащей 25 мг/л тетрациклина гидрохлорида и 25 мг/л хлорамфеникола при 30°С в течение 14 ч и собирали клетки на одной чашке (диаметр: 8,5 см), и высевали в 300 мл культуральной среды, содержащей 50 г/л глюкозы, 4 г/л сульфата аммония, 0,4 г/л сульфата магния гептагидрата, 2 г/л первичного кислого фосфата калия, 10 мг/л сульфата железа (2) гептагидрата, 10 мг/л сульфата марганца пентагидрата, 4 г/л дрожжевого экстракта, 400 мг/л L-лизина гидрохлорида, 400 мг/л DL-метионина, 400 мг/л DL- , -диаминопимелиновой кислоты, 25 мг/л тетрациклина гидрохлорида и 25 мг/л хлорамфеникола в баночном ферментере емкостью 1 л для культивирования при 34°С при рН 6,0. Значение рН при культивировании контролировали добавлением газообразного аммиака. Культивирование заканчивали примерно через 16 ч после начала культивирования в фазе, в которой происходило истощение глюкозы.

60 мл культурального бульона, культивированного как описано выше, высевали в 300 мл основной культуральной среды, содержащей 50 г/л глюкозы, 5 г/л сульфата аммония, 0,4 г/л сульфата магния гептагидрата, 5 г/л первичного кислого фосфата калия, 20 мг/л сульфата железа (2) гептагидрата, 20 мг/л сульфата марганца пентагидрата, 6 г/л дрожжевого экстракта, 800 мг/л L-лизина гидрохлорида, 600 мг/л DL-метионина, 600 мг/л DL- , -диаминопимелиновой кислоты, 1,5 г/л хлорида натрия, 0,75 г/л хлорида кальция дигидрата, 25 мг/л тетрациклина гидрохлорида и 25 мг/л хлорамфеникола в баночном ферментере емкостью 1 л для культивирования при 34°С при рН 6,0. По мере накопления L-глутаминовой кислоты значение рН спонтанно снижалось, достигая рН 4,5 примерно через один или два часа после начала культивирования. После чего рН культуры доводили до рН 4,5 добавлением газообразного аммиака. После того как первоначально внесенная глюкоза была израсходована, постепенно добавляли 700 г/л водного раствора глюкозы со скоростью 6 мл/ч.

Когда продуцирование L-глутаминовой кислоты ферментацией продолжалось, как описано выше, концентрация накопившейся L-глутаминовой кислоты в культуральном бульоне примерно через 14 ч после начала культивирования составляла примерно 45-55 г/л.

В это время в культуральный бульон добавляли кристаллы L-глутаминовой кислоты -формы или -формы в виде сухих кристаллов из верхней части баночного ферментера в количестве в пределах от 0,008 до 1,0 г (0,022-2,778 г/л по отношению к количеству среды в начале культивирования), и культивирование продолжали и заканчивали через 36 ч после начала культивирования. В баночном ферментере осаждалось значительное количество кристаллов L-глутаминовой кислоты. Кристаллы отделяли декантацией и высушивали в течение ночи при комнатной температуре. Кристаллическую форму (Тип кристаллической решетки) полученных высушенных кристаллов исследовали порошковой рентгенографией. Результаты представлены в таблице 1. Результат контрольного опыта, в котором во время культивирования не добавляли кристаллы, также представлен в таблице 1.

Таблица 1
номер опыта	Условие добавления кристаллов				Результат культивирования
	Форма кристалла	Добавленная масса (г)	Добавленная концентрация (г/л)	Накопление Glu при добавлении (г/л)	Форма осажденных кристаллов	Общее накопление Glu (г/л)	Всего осажденных кристаллов (г/л)
1	-кристалл	1.000	2.778	44.5	-кристалл	145.0	98.0
2	-кристалл	1.000	2.778	47.0	-кристалл	118.0	72.0
3	-кристалл	1.000	2.778	46.5	-кристалл	132.0	73.0
4	-кристалл	1.000	2.778	47.0	-кристалл	131.0	86.0
5	-кристалл	1.000	2.778	46.0	-кристалл	104.0	58.0
6	- кристалл	1.000	2.778	45.5	-кристалл	142.0	90.0
7	-кристалл	0.400	1.111	41.5	-кристалл	102.0	60.0
8	-кристалл	0.400	1.111	30.5	-кристалл	92.0	50.0
9	-кристалл	0.400	1.111	55.5	-кристалл	94.0	50.0
10	-кристалл	0.400	1.111	59.5	-кристалл	93.0	56.0
11	-кристалл	0.400	1.111	61.0	-кристалл	110.0	67.0
12	-кристалл	0.080	0.222	44.5	-кристалл	118.0	77.5
13	-кристалл	0.080	0.222	46.5	-кристалл	132.0	91.0
14	-кристалл	0.080	0.222	46.0	-кристалл	104.0	63.0
15	-кристалл	0.080	0.222	41.5	-кристалл	142.0	101.0
16	-кристалл	0.080	0.222	55.5	-кристалл	102.0	62.0
17	-кристалл	0.040	0.111	50.0	-кристалл	129.0	52.0
18	-кристалл	0.040	0.111	55.0	-кристалл	122.0	81.0
19	-кристалл	0.040	0.111	47.5	-кристалл	123.0	81.0
20	-кристалл	0.040	0.111	49.5	-кристалл	122.0	88.0
21	-кристалл	0.040	0.111	49.0	-кристалл	101.0	67.0
22	-кристалл	0.040	0.111	48.0	-кристалл	100.0	65.0
23	-кристалл	0.008	0.022	52.5	-кристалл	113.0	72.0
24	-кристалл	0.008	0.022	54.0	-кристалл	91.0	50.0
25	-кристалл	1.000	2.778	44.5	-кристалл	113.0	71.0
Контроль	Нет	-	-	-	-кристалл	82.0	39.5

На основе результатов, представленных в таблице 1, было установлено, что накопление L-глутаминовой кислоты на время окончания культивирования, когда добавляют кристаллы, увеличилось по сравнению с тем, когда кристаллы не добавляют совсем.

Кроме того, было установлено, что при добавлении кристаллов L-глутаминовой кислоты -формы, доля осаждения кристаллов L-глутаминовой кислоты -формы возрастает. В частности, было установлено, что если кристаллы добавляют в количестве 0,2 г/л или более, кристаллы L-глутаминовой кислоты -формы можно осадить в среде с хорошей воспроизводимостью.