способ получения поли-гамма-глутаминовой кислоты и микроорганизм, используемый в указанном способе

Формула изобретения

1. Способ получения поли- -глутаминовой кислоты включающий

A) выращивание в питательной среде микроорганизма, принадлежащего к виду Bacillus subtilis, обладающего способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты и устойчивого к ингибитору системы транспорта электронов, и

B) выделение указанной поли- -глутаминовой кислоты из культуральной жидкости.

2. Способ получения поли- -глутаминовой кислоты по п.1, отличающийся тем, что указанный ингибитор системы транспорта электронов включает вещество, выбранное из группы, состоящей из ингибитора NADH-убихинонредуктазы, ингибитора сукцинат-убихинонредуктазы, ингибитора убихинол-цитохром С редуктазы, ингибитора цитохром С оксидазы, и комбинацию этих веществ.

3. Способ получения поли- -глутаминовой кислоты по п.2, отличающийся тем, что указанный ингибитор системы транспорта электронов включает вещество, выбранное из группы, состоящей из теноилтрифторацетона (TTFA), капсаицина, азида натрия, и комбинацию этих веществ.

4. Микроорганизм, принадлежащий к виду Bacillus subtilis, обладающий способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты, модифицированный таким образом, что такой микроорганизм является устойчивым к ингибитору системы транспорта электронов.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Настоящее изобретение относится к способу получения поли- -глутаминовой кислоты и микроорганизму, используемому в указанном способе.

Описание предшествующего уровня техники

Известно, поли- -глутаминовая кислота является основным компонентом, который обуславливает тягучесть ферментированных соевых бобов (натто). Кроме того, возможно использование поли- -глутаминовой кислоты в различных областях, включающих пищевые продукты, косметику, медицинские продукты и тому подобные. Поли- -глутаминовая кислота производится главным образом путем выращивания микроорганизмов, обладающих способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты, например штаммов рода Bacillus, и выделения поли- -глутаминовой кислоты из культуральной жидкости (ссылка на Gekkan Soshiki Baiyo (Monthly Tissue Culture), 16, 10, 369-372, 1990).

Способы увеличения количества поли- -глутаминовой кислоты, производимой в ходе ферментации микроорганизмов, разработанные до настоящего времени, включают использование штаммов, в которых модифицирована система метаболизма, производящих большие количества поли- -глутаминовой кислоты. Такие штаммы с модифицированной системой метаболизма могут включать системы синтеза и расщепления поли- -глутаминовой кислоты. К ним, например, относятся мутантные штаммы, обладающие низкой продукцией аммония (выложенный патент Японии (Kokai) 8-154616), мутантные штаммы, в которых элиминирована или снижена активность глутаматсинтазы (выложенный патент Японии 2000-333690), и подобные им. В ходе продолжительного культивирования поли- -глутаминовая кислота может расщепляться, что снижает накопление поли- -глутаминовой кислоты. Чтобы решить указанную проблему, были разработаны способы с использованием мутантного штамма, в котором активность фермента, кодируемого геном ywtD и расщепляющего поли- -глутаминовую кислоту, элиминирована или снижена (выложенный патент Японии 2003-235566, патентная заявка США 20030175936), и мутантного штамма, в котором активность фермента, кодируемого геном pghA (ywrD) и расщепляющего поли- -глутаминовую кислоту, элиминирована или снижена (выложенный патент Японии 2003-230384).

Было показано, что в ходе ферментации при увеличении количества макромолекул поли- -глутаминовой кислоты ферментационная среда становится псевдопластичной жидкостью, в результате чего демонстрирует текучесть неньютоновской жидкости вследствие увеличения вязкости, что приводит к снижению скорости переноса кислорода и уменьшению удельной скорости потребления кислорода микроорганизмами (Biotechnology and Bioengineering, 82, 3, 299-305, 2003). Известно, что аэрация культуральной жидкости является важным фактором при продукции поли- -глутаминовой кислоты методом ферментации с использованием микроорганизмов. Однако до настоящего времени не было сообщений о выращивании штаммов, демонстрирующих повышенную способность к продукции поли- -глутаминовой кислоты в условиях пониженного содержания кислорода.

Краткое описание изобретения

Целью настоящего изобретения является предоставление способа более эффективной по сравнению с традиционными технологиями продукции поли- -глутаминовой кислоты методом ферментации и микроорганизма, используемого в указанном способе.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что способность микроорганизма рода Bacillus к продукции поли- -глутаминовой кислоты улучшалась в случае придания штамму указанного микроорганизма устойчивости к ингибитору системы транспорта электронов. На основе этого факта было совершено настоящее изобретение.

Объектом настоящего изобретения является предоставление способа получения поли- -глутаминовой кислоты, включающего выращивание в питательной среде микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus, обладающего способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты и устойчивого к ингибитору системы транспорта электронов, и выделение поли- -глутаминовой кислоты из культуральной жидкости.

Также объектом настоящего изобретения является предоставление способа получения поли- -глутаминовой кислоты, описанного выше, в котором к ингибиторам системы транспорта электронов относится вещество, выбранное из группы, состоящей из ингибитора NADH-убихинонредуктазы, ингибитора сукцинат-убихинонредуктазы, ингибитора убихинон-цитохром С редуктазы, ингибитора цитохром С оксидазы или их комбинация.

Также объектом настоящего изобретения является предоставление способа получения поли- -глутаминовой кислоты, описанного выше, в котором к ингибиторам системы транспорта электронов относится вещество, выбранное из группы, состоящей из теноилтрифторацетона (TTFA), капсаицина, азида натрия, или их комбинация.

Также объектом настоящего изобретения является предоставление способа получения поли- -глутаминовой кислоты, описанного выше, в котором указанным микроорганизмом является Bacillus subtilis.

Также объектом настоящего изобретения является предоставление микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus, обладающего способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты и модифицированного таким образом, что такой микроорганизм является устойчивым к ингибитору системы транспорта электронов.

Также объектом настоящего изобретения является предоставление микроорганизма, описанного выше, в котором указанным микроорганизмом является Bacillus subtilis.

В соответствии с настоящим изобретением предоставляется эффективный способ получения поли- -глутаминовой кислоты. В соответствии с настоящим изобретением предоставляется новая бактерия, обладающая устойчивостью к ингибитору системы транспорта электронов, а использование указанной бактерии делает возможным эффективную продукцию поли- -глутаминовой кислоты.

Описание изобретения

Авторы настоящего изобретения предположили, что, поскольку для синтеза поли- -глутаминовой кислоты необходим АТФ, продукция поли- -глутаминовой кислоты в значительной степени зависит от продукции АТФ в ходе окислительного фосфорилирования, связанного с системой транспорта электронов, в случае увеличения вязкости культуральной жидкости и снижения скорости переноса кислорода.

<1> Микроорганизм, обладающий способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты.

В настоящем описании фраза "способность к продукции поли- -глутаминовой кислоты" означает способность к продукции и выделению поли- -глутаминовой кислоты.

Примерами микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus, обладающих способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты и используемых в настоящем изобретении, являются, например, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus anthracis, Bacillus megaterium и подобные им.

Более конкретно к ним относятся, например, Bacillus subtilis NBRC 3335, Bacillus subtilis NBRC 3336 (M.Kunioka and A.Goto, Appl. Microbiol. Biotechnol., 40, 867-872, 1994), Bacillus subtilis NBRC 16449, Bacillus licheniformis ATCC 9945 (F.A.Troy, J. Biol. Chem., 248, 305-315 (1973)) и подобные им, а также коммерчески доступные бактерии - продуценты натто, обычно используемые для получения ферментированных соевых бобов, такие как Miyagino, Takahashi, Asahikawa, Matsumura и Naruse.

Штаммы NBRC 3335, NBRC 3336 и NBRC 16449 могут быть приобретены в Национальном институте технологии и оценки (Отдел биотехнологии, Центр биологических ресурсов) (National Institute of Technology and Evaluation (NITE), Department of Biotechnology, NITE Biological Resource Center (NBRC) (адрес: 292-0818, 2-5-8, Kazusa Kamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japan). Штамм ATCC 9945 может быть приобретен в Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection, адрес: 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110, United States of America).

Более того, микроорганизмом согласно настоящему изобретению может быть микроорганизм, принадлежащий к роду Bacillus, обладающий повышенной способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты и полученный путем селекции из любого из вышеописанных бактериальных штаммов. Микроорганизм рода Bacillus согласно настоящему изобретению, обладающий повышенной способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты, может быть получен, например, подавлением экспрессии гена, кодирующего глутаматсинтазу (ген gltA), путем разрушения указанного гена (выложенный патент Японии 2000-333690). Более того, микроорганизм рода Bacillus, обладающий повышенной способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты, также может быть получен путем снижения или элиминирования системы расщепления поли- -глутаминовой кислоты (выложенный патент Японии 2003-235566, патентная заявка США 20030175936, выложенный патент Японии 2003-230384).

<2> Способ получения микроорганизма, модифицированного таким образом, что указанный микроорганизм является устойчивым к ингибитору системы транспорта электронов.

Бактерию согласно настоящему изобретению получают путем придания бактерии рода Bacillus, обладающей способностью к продукции и секреции поли- -глутаминовой кислоты, устойчивости к ингибитору системы транспорта электронов. Фраза "устойчивость к ингибитору системы транспорта электронов" означает, что бактерия обладает способностью к росту на питательной среде, содержащей ингибитор системы транспорта электронов, при этом указанный ингибитор присутствует в такой концентрации, что бактерия рода Bacillus, не являющаяся устойчивой к указанному ингибитору системы транспорта электронов, например природный или немодифицированный штамм бактерии рода Bacillus, не способна к росту. Эта фраза также означает, что скорость роста модифицированного микроорганизма, устойчивого к указанному ингибитору, является более высокой, чем у природного или немодифицированного штамма бактерии рода Bacillus, в условиях, когда оба штамма выращивают в питательной среде, содержащей ингибитор системы транспорта электронов. В частности, например, если бактерию рода Bacillus переносят на агаризованную среду, подходящую для роста бактерии Bacillus, например LB агаризованную среду, дополнительно содержащую ингибитор системы транспорта электронов, выращивают при оптимальной температуре и при этом указанная бактерия рода Bacillus образует колонии в течение двух дней, а природный или немодифицированный штамм бактерии рода Bacillus не образует колонии в течение двух дней, указанную бактерию рода Bacillus считают устойчивой к указанному ингибитору системы транспорта электронов. Вышеуказанной оптимальной температурой является температура, при которой бактерия демонстрирует благоприятный рост в условиях, когда указанную бактерию выращивают в питательной среде, не содержащей ингибитор системы транспорта электронов. Или же штамм, который в течение двух дней образует колонии на агаризованной среде, содержащей ингибитор системы транспорта электронов, например теноилтрифторацетон (TTFA) или капсаицин в концентрации от 0.1 до 10 мМ, считают устойчивьм к ингибитору системы транспорта электронов.

Бактерия рода Bacillus, устойчивая к ингибитору системы транспорта электронов, может быть получена, например, путем отбора и выделения мутантного штамма, способного к росту на питательной среде, содержащей ингибитор системы транспорта электронов.

Система транспорта электронов в микроорганизмах состоит из комплекса NADH-убихинонредуктазы, комплекса сукцинат-убихинонредуктазы, комплекса убихинол-цитохром С редукцтазы, и комплекса цитохром С оксидазы, при этом ингибиторы, специфические для каждого комплекса, известны (Handbook of Enzyme Inhibitors, Ed. by Helmward Zollner, Wiley-VCH, 1999). Например, ингибиторами NADH-убихинон редуктазы являются ротенон, капсаицин и амитал (Amytal); примерами ингибиторов сукцинат-убихинонредуктазы являются антимицин А и циннеризин; примерами ингибиторов убихинол-цитохром С редуктазы являются антимицин А, дифениламин и теноилтрифторацетон (TTFA); а примерами ингибиторов цитохром С оксидазы являются азид натрия, лидокаин и цианид калия. Ниже описан способ получения бактерий рода Bacillus, устойчивых к различным ингибиторам системы транспорта электронов.

Бактерия рода Bacillus, устойчивая к ингибитору системы транспорта электронов, может быть получена путем выращивания бактерии рода Bacillus в питательной среде, содержащей ингибитор системы транспорта электронов в концентрации, при которой рост указанной бактерии ингибируется, и отбора штаммов, способных к росту. Под ингибированием роста в данном случае понимается задержка роста и/или остановка роста. Селекция может быть проведена один, два или более раз. Количество ингибитора системы транспорта электронов, добавленного в питательную среду, не ограничено каким-либо образом при условии, что он присутствует в концентрации, ингибирующей рост, при этом такая концентрация может варьироваться в зависимости от типа ингибитора. Однако концентрация от 0.1 до 10 мМ является в общем достаточной.

Перед селекцией бактерия рода Bacillus может быть подвергнута мутагенезу. Обычными методами мутагенеза являются обработка ультрафиолетом или обработка мутагенным агентом, таким как N-метил-N'-нитро-N-нитрозогианидин (NTG). Селекция штамма, устойчивого к ингибитору системы транспорта электронов, может быть проведена как для одного вида ингибитора, так и для двух и более видов ингибиторов системы транспорта электронов. Более того, селекция может быть проведена один, два или более раз для каждого ингибитора системы транспорта электронов.

Бактерия рода Bacillus, устойчивая к ингибитору системы транспорта электронов, полученная описанным выше способом, может расти даже в присутствии ингибитора системы транспорта электронов, когда указанный ингибитор присутствует в концентрации, при которой родительский штамм расти не может.

Более того, также возможно дополнительно улучшить продукцию поли- -глутаминовой кислоты бактерией рода Bacillus путем получения мутации, приводящей к устойчивости к антибиотикам различного рода, в дополнение к приданию устойчивости к ингибитору системы транспорта электронов. Например, было показано, что мутация, придающая устойчивость к стрептомицину, обусловлена мутацией в рибосомальном белке S12, что приводит к увеличению продукции веществ микроорганизмами (J.Shima, A.Hesketh, S.Okamoto, S.Kawamoto, К.Ochi, J.Bacteriol, 178: 7276-7284, 1996). Следовательно, способность к продукции поли- -глутаминовой кислоты может быть далее улучшена путем получения мутации, приводящей к устойчивости к стрептомицину, в бактерии, принадлежащей к роду Bacillus.

<3> Продукция поли- -глутаминовой кислоты с использованием микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus.

Путем выращивания микроорганизма рода Bacillus, обладающего способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты и устойчивого к ингибитору системы транспорта электронов, может быть получено и секретировано в культуральную жидкость значительное количество поли- -глутаминовой кислоты. Было оценено, что продукция и секреция поли- -глутаминовой кислоты может быть улучшена путем придания устойчивости к ингибитору системы транспорта электронов, поскольку эффективность синтеза АТФ путем окислительного фосфорилирования, связанного с системой транспорта электронов, не снижается в условиях пониженной скорости переноса кислорода в питательной среде вследствие наличия такой устойчивости.

Питательной средой, пригодной для продукции поли- -глутаминовой кислоты, может быть традиционная среда, содержащая источники углерода, азота, неорганические ионы, и, если требуется, другие питательные вещества органического происхождения. В частности, предпочтительно добавление в среду глутаминовой кислоты или ее соли, например глутамата натрия, глутамата калия или другой подобной соли, поскольку это приводит к эффективной продукции поли- -глутаминовой кислоты. Конкретные примеры ингредиентов питательной среды включают подходящие комбинации следующих веществ.

Во-первых, в качестве источников углерода могут быть использованы глюкоза, фруктоза, сахароза, мальтоза, сахар-сырец, меласса (например, свекловичная меласса, меласса сладкого картофеля), различные крахмалы (например, тапиока, саго, крахмалы сладкого картофеля, картофеля, кукурузы) или их сахаристые растворы либо подходящие комбинации двух или более источников. Указанные источники углерода могут быть получены с использованием кислот, ферментов или другим подобным способом.

Далее, в качестве источника азота могут быть использованы глутаминовая кислота, глутамат натрия, глутамат калия, соевый соус кодзи или соевый экстракт, продукты ферментации соевого соуса, такие как соевый соус и осадок соевого соуса, или их смесь, органические источники азота, такие как пептон, мука соевых бобов, замочный зерновой сироп, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, соевые бобы или обезжиренные соевые бобы, их порошок, крупа или экстракт, а также мочевина, неорганические источники азота, такие как аммонийные соли серной кислоты, азотной кислоты, соляной кислоты, угольной кислоты, и так далее, газообразный аммиак и водный аммоний, подходящие комбинации двух и более типов указанных источников.

В дополнение к вышеуказанным источникам углерода и азота могут использоваться различные неорганические соли, необходимые для роста микроорганизмов, включающие, например, сульфаты, хлориды, фосфаты и ацетаты кальция, калия, натрия, магния, марганца, железа, меди, цинка и т.д., аминокислоты, витамины и подобные вещества. Аминокислоты, которые могут быть использованы, включают в дополнение к уже упомянутой глутаминовой кислоте аспарагиновую кислоту, аланин, лейцин, фенилаланин, гистидин и т.д. В качестве витаминов могут быть использованы биотин, тиамин.

Более того, в качестве материалов для твердых сред могут быть использованы, например, вареные соевые бобы, ячмень, пшеница, гречка, кукуруза или их смесь или, предпочтительно, любой этот материал, дополнительно содержащий глутаминовую кислоту или ее соль.

Для выращивания микроорганизма, принадлежащего к роду Bacillus, вышеуказанную питательную среду стерилизуют стандартным способом, например нагреванием до 110-140°С в течение 8-15 минут, а затем в нее добавляют микроорганизм. В случае жидкой культуры выращивание проводят, предпочтительно, в аэробных условиях, таких как встряска, аэрирование, перемешивание и подобных им. Температура для выращивания такой культуры составляет 25-50°С, предпочтительно 37-42°С.

Далее, рН среды поддерживают предпочтительным образом с помощью гидроксида натрия, гидроксида калия, аммиака, водного раствора аммония или подобным соединением, а выращивание осуществляют предпочтительно при рН 5-9, более предпочтительно при рН 6-8.

Далее, время выращивания обычно составляет от 2 до 4 дней. Также в случае твердой культуры выращивание проводят при температуре 25-50°С, предпочтительно 37-42°С, и рН 5-9, предпочтительно 6-8, подобно выращиванию в жидкой среде. Если микроорганизм выращивается, как описано выше, то поли- -глутаминовая кислота секретируется из клетки и накапливается в культуральной жидкости.

Для выделения поли- -глутаминовой кислоты из культуральной жидкости могут быть использованы известные методы, например (1) метод экстракции и выделения поли- -глутаминовой кислоты из твердой культуры с использованием салина при концентрации 20% или ниже (выложенный патент Японии 3-30648), (2) метод осаждения с использованием сульфата меди (B.C.Throne, C.C.Gomez, N.E.Noues and R.D.Housevright, J.Bacteriol., 68, 307, 1954), (3) метод осаждения спиртом (R.M.Yard, R.F.Anderson and F.K.Dean, Biotechnology and Bioengineering, 5, 41, 1963; S.Sawa, Т.Murakawa, S.Murao, S.Omata, Noka (Journal of Japan Society for Bioscience, Biotechnology and Agrochemistry), 47, 159-165, 1973; H.Fujii, Noka, 37, 407-412, 1963 etc.), (4) хроматографический метод с использованием продукта, содержащего порошок поперечно-связанного хитозана, в качестве адсорбента (выложенный патент Японии 3-244392), (5) метод молекулярной фильтрации с использованием молекулярного сита (мембраны для ультрафильтрации), (6) способ, состоящий из подходящей комбинации указанных методов (1)-(5) и так далее. Поли- -глутаминовая кислота, выделенная и собранная, как описано выше, может быть приготовлена в виде раствора или порошка, в зависимости от потребности, с использованием известных методов, таких как концентрирование, высушивание горячим воздухом и лиофилизация.

Примеры

Настоящее изобретение будет более подробно разъяснено со ссылкой на следующие примеры. Однако настоящее изобретение не ограничено рамками приведенных примеров.

Пример 1: Выявление штаммов, полученных из штамма Bacillus subtilis NBRC 16449, устойчивых к различным ингибиторам системы транспорта электронов.

Штамм Bacillus subtilis NBRC 16449, обладающий способностью к продукции поли- -глутаминовой кислоты, инокулировали в 50 мл питательной среды LB (10 г/л триптона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л Nad, pH 7.0) в 500-мл колбах Сакагучи (Sakaguchi flask) и выращивали в течение ночи при 30°С со встряской, потом собирали полученные клетки.

Эти клетки отмывали 0.1 М в калий-фосфатном буфере (pH 7.0), затем ресуспендировали в калий-фосфатном буфере (pH 7.0), содержащем 500 мг/л N-метил-N'-нитро-К-нитрозогуанидина (NTG), и оставляли при 30°С на 12 минут. Клетки, обработанные NTG, отмывали четыре раза калий-фосфатным буфером (pH 7.0), часть полученных клеток собирали, переносили на агаризованную LB-среду, содержащую 1.5% агара и 0.61 мг/л капсаицина, и выращивали при 30°С от 1 до 3 дней. Появившиеся колонии рассеивали штрихом до отдельных колоний на агаризованную LB-среду, содержащую капсаицин в концентрации, указанной выше, и выращивали при 30°С.

Затем каждую из появившихся колоний переносили в пробирку с 3 мл среды для продукции поли- -глутаминовой кислоты (6% глюкозы, 6% сульфата аммония, 0.4% КН₂PO₄, 0.03% сульфата магния, 0.001% сульфата железа, 0.005% сульфата марганца, 32 мл/л солянокислого гидролизата соевых бобов с общим содержанием азота - 3.5%, 4.5% глутамата натрия, рН 7.0, доведенный гидроксидом натрия), содержащей 0.15 г карбоната кальция, и выращивали при 37°С в течение 3 дней со встряхиванием. Затем в культуральной жидкости оценивали количество полученной поли- -глутаминовой кислоты. Количество поли-у-глутаминовой кислоты определяли методом ВЭЖХ в следующих условиях.

Колонка: Asahipak GF7M HQ (7.6×300 мм)+Asahipak GS-1G (7.6×50 мм).

Производитель - Shodex.

Подвижная фаза: 10 мМ буфера Tris-HCl (рН 8.6), 10 г/л NaCl.

Скорость потока: 0.9 мл/мин.

Детекция: UV 220 нм.

Температура: 50°С.

Объем пробы: 30 мкл.

Количество поли- -глутаминовой кислоты рассчитывали по соотношению площадей пиков с использованием в качестве стандарта поли- -глутаминовой кислоты со средним молекулярным весом 30 kDa (производитель - Ajinomoto).

Способность штаммов к продукции поли- -глутаминовой кислоты была оценена для 50 штаммов бактерий, устойчивых к капсаицину. Три штамма, которые секретирвали поли- -глутаминовую кислоту в количестве, большем чем родительский штамм Bacillus subtilis NBRC 16449, были выбраны и обозначены С10, С20 и С32 соответстввенно.

Затем вышеуказанные штаммы, обработанные NTG, переносили на агаризованную среду LB, содержащую 1.5% агара и 1 мМ теноилтрифторацетона (TTFA), и выделяли TTFA-устойчивые штаммы. Способность штаммов к продукции поли- -глутаминовой кислоты была оценена для 50 штаммов, устойчивых к TTFA, способом, описанным выше. Три штамма, которые секретировапи поли- -глутаминовую кислоту в количестве, большем чем родительский штамм Bacillus subtilis NBRC 16449, были выбраны и обозначены ТЗ, Т28 и Т25 соответственно.

Далее, вышеуказанные клетки, обработанные NTG, переносили на агаризованную среду LB, содержащую 1.5% агара и 2.5 мМ азида натрия, и выделяли штаммы, устойчивые к азиду натрия. Способность штаммов к продукции поли- -глутаминовой кислоты была оценена для 50 штаммов, устойчивых к азиду натрия, способом, описанным выше, и три штамма, которые секретировали поли- -глутаминовую кислоту в количестве, большем чем родительский штамм Bacillus subtilis NBRC 16449, были выбраны и обозначены N20, N28 и N38 соответственно.

Штаммы, устойчивые к различным ингибиторам системы транспорта электронов, С10, С20, С32, Т3, Т28, Т25, N20, N28 и N38 были названы AJ110393, АJ110394, АJ110395, АJ110396, АJ110397, АJ110398, АJ110399, АJ110400 и АJ110401 соответственно. Они были депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Россия, 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, 1) 10 марта 2005 г под инвентарными номерами В-9007, В-9006, В-9005, В-9004, В-9003, В-9002, В-9001, В-9000, В-8999 соответственно. Затем депонированные штаммы были переведены на международное депонирование в соответствии с Будапештским договором 10 мая 2005 г под теми же инвентарными номерами.

Пример 2: Продукция поли- -глутаминовой кислоты штаммами, устойчивыми к ингибиторам системы транспорта электронов.

Девять вышеописанных штаммов, полученных в Примере 1 (С10, С20, С32, Т3, Т28, Т25, N20, N28 и N38), а также родительский штамм Bacillus subtilis NBRC 16449 переносили в 3 мл предкультивационной среды (2% глюкозы, 0.4% сульфата аммония, 0.4% КН₂РО ₄, 0.03% сульфата магния, 0.001% сульфата железа, 0.002% сульфата марганца, 27 мл/л солянокислого гидролизата соевых бобов с общим содержанием азота 3.5%, рН 7.0 доведенный гидроксидом калия) и выращивали при 37°С в течение 16 часов.

2 мл полученной среды переносили в 60 мл вышеуказанной среды, содержащей 3 г карбоната кальция, в 500-мл колбы Сакагучи (Sakaguchi flask), и выращивали при 37°С со встряхиванием. Пробы культуральной жидкости отбирались после 24 часов и 48 часов, количество произведенной поли- -глутаминовой кислоты определяли с помощью ВЭЖХ методом, описанным в Примере 1.

Количество произведенной поли- -глутаминовой кислоты показано в Таблице 1. Каждый из штаммов, устойчивых к ингибитору системы транспорта электронов, демонстрировал секрецию поли- -глутаминовой кислоты в количестве, большем чем родительский штамм. Таким образом было показано, что продукция поли- -глутаминовой кислоты повышается при придании устойчивости к ингибитору системы транспорта электронов.

Таблица 1
Количество произведенной поли- -глутаминовой кислоты (g/L)
Штамм	Время
	24 часа	48 часов
NBRC-12757	6.68	12.2
C10	7.08	14.1
С20	10.3	17.1
С32	7.96	14.3
Т3	7.95	15.7
Т28	7.73	14.3
Т25	7.21	14.2
N20	7.23	13.6
N28	10.3	17.0
N38	7.92	14.4