рекомбинантная плазмидная днк pсl1, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи антитела человека против вируса эбола, рекомбинантная плазмидная днк рсн1, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи указанного антитела, и их применение

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCL1, кодирующая синтез в клетках млекопитающих полипептида со свойствами легкой цепи полноразмерного моноклонального человеческого антитела, взаимодействующего с вирусом Эбола, размером 6108 п.о. и молекулярной массой 4,03 Мда, включающая

NheI/XhoI - векторный фрагмент плазмиды pcDNA3.1(+) (Invitrogen) размером 5338 п.о., содержащий цитомегаловирусный (CMV) промотор и энхансер транскрипции, сайт полиаденилирования, участок терминации транскрипции BGH, ген -лактамазы (bla) и ген устойчивости к неомицину;

NheI/XhoI - фрагмент размером 770 п.о., содержащий искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен легкой цепи одноцепочечного антитела 4D1, полученного из комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека, соединен с константным доменом каппа-цепи IgG человека, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг.1;

генетические маркеры: ген -лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pCL1 клеток бактерий к ампициллину; ген устойчивости к неомицину для селекции трансфецированных плазмидой pCL1 клеток млекопитающих; уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: Bg1II - 12, NheI - 895, XmaJI - 1294, Xhol - 1665.

2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рСН1, кодирующая синтез в клетках млекопитающих полипептида со свойствами тяжелой цепи полноразмерного моноклонального человеческого антитела, взаимодействующего с вирусом Эбола, размером 6917 п.о. и молекулярной массой 4,57 Мда, включающая

NheI/XhoI - векторный фрагмент плазмиды pcDNA3.1(+) (Invitrogen) размером 5338 п.о., содержащий CMV промотор и энхансер транскрипции, сайт полиаденилирования, участок терминации транскрипции BGH, ген -лактамазы (bla) и ген устойчивости к неомицину;

NheI/XhoI - фрагмент размером 1579 п.о., содержащий искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен тяжелой цепи одноцепочечного антитела 4D1, полученного из комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека, соединен с константными С_H1-С_H2-С_H3-доменами IgG1 человека, имеющий нуклеотидную последовательность, приведенную на фиг.2;

генетические маркеры: ген -лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой рСН1 клеток бактерий к ампициллину; ген устойчивости к неомицину для селекции трансфецированных плазмидой рСН1 клеток млекопитающих; уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, имеющие следующие координаты: Bg1II - 12, NheI - 895, Apal - 1344, Xhol - 1326 и 2474.

3. Применение рекомбинантных плазмидных ДНК pCL1 и pCH1, охарактеризованных в пп.1 и 2, для получения рекомбинантного полноразмерного антитела человека класса IgG1, взаимодействующего с вирусом Эбола, путем совместной трансфекции указанными плазмидными ДНК клеток млекопитающих.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированные in vitro рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие полученные генно-инженерными методами искусственные гены легкой и тяжелой цепей полноразмерного человеческого антитела, созданные на основе вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей рекомбинантного антитела 4D1 из фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека, и константных генов IgG1 человека, цитомегаловирусного промотора и сайта полиаденилирования BGH, обусловливающих биосинтез в клетках млекопитающих рекомбинантных полноразмерных человеческих антител класса IgG1, взаимодействующих с вирусом Эбола.

Вирус Эбола (ВЭ), представитель семейства Filoviridae, является одним из самых патогенных среди известных человечеству вирусов. Сочетание высокой контагиозности, летальности, отсутствие средств профилактики и лечения однозначно определяет его в четвертую - самую опасную - группу по классификации Всемирной Организации Здравоохранения. Причины патофизиологических изменений, которые делают лихорадку Эбола такой опасной, до сих пор не понятны, не известен природный резервуар этого вируса. Механизмы, обеспечивающие выздоровление индивидуумов после болезни, вызываемой вирусом Эбола, изучены плохо [1].

В настоящее время отсутствуют действенные средства борьбы с филовирусными инфекциями: вакцины находятся в стадии разработки, нет эффективных средств терапии [2]. Вместе с тем иммуноглобулин, выделенный из гипериммунной сыворотки лошадей, показал наличие протективного эффекта на приматах, что доказывает антивирусную активность антител [3]. Однако гетерологичность таких иммуноглобулинов не позволяет использовать их для терапии филовирусных лихорадок. Именно поэтому получение рекомбинантных антител человека против ВЭ представляет большой интерес.

Рекомбинантные антитела могут играть важную роль в лечении особо опасных инфекций и аутоиммунных заболеваний. По литературным данным в настоящее время на стадии прохождения клинических испытаний такие препараты находятся на втором месте после вакцин. В основном производятся химерные (мышь-человек) [4, 5] и гумманизированные антитела [6], однако использование таких антител может приводить к возникновению иммунного ответа на «мышиную» (не "человеческую") часть молекулы.

Более перспективным с точки зрения терапии представляется получение полностью человеческих полноразмерных антител. Одним из подходов к созданию таких препаратов может быть получение рекомбинантных полноразмерных человеческих антител на основе человеческих миниантител из комбинаторных фаговых библиотек. Впервые одноцепочечные последовательности, составленные из вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей антител, в составе гибридного белка оболочки фага были получены МакКафферти и сотр. [7]. В дальнейшем были сконструированы фаговые библиотеки, в которых комбинации вариабельных доменов легких и тяжелых цепей антител продуцировались в составе фагового белка в виде одноцепочечных антител, экспонированных на поверхности бактериофага [8, 9, 10]. Теоретически фрагменты ДНК из таких библиотек, кодирующие одноцепочечные антитела человека, могут служить источником антиген-связывающих вариабельных фрагментов для получения полноразмерных человеческих антител генно-инженерными методами путем их соединения с участками ДНК, кодирующими константные области иммуноглобулина класса G (IgG) человека. В литературе есть сведения о получении рекомбинантных полноразмерных человеческих антител на основе вариабельных фрагментов из фаговых библиотек [11, 12], однако данных, в том числе патентных, о конструировании рекомбинантных полноразмерных антител против вируса Эбола не имеется.

В настоящее время известен только способ получения одноцепочечных антител, специфичных к вирусу Эбола, из комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека с использованием методов фагового дисплея [13, прототип].

Технической задачей изобретения является получение двух полипептидов со свойствами полноразмерных легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина человека, образующих в клетках млекопитающих антитело класса IgG1, взаимодействующее с вирусом Эбола.

Поставленная задача решается путем конструирования двух рекомбинантных плазмидных ДНК, одна из которых, pCL1, кодирует синтез полипептида со свойствами легкой цепи полноразмерного моноклонального человеческого антитела, другая, рСH1, кодирует синтез полипептида со свойствами тяжелой цепи полноразмерного моноклонального человеческого антитела. Совместная трансфекция плазмидами pCL1 и рСН1 клеток человека линии 293Т обеспечивает синтез полипептида со свойствами полноразмерного человеческого антитела класса IgG1, взаимодействующего с вирусом Эбола.

Транзиентный биосинтез целевых полипептидов обеспечивается наличием в плазмидах pCL1 и рСH1 цитомегаловирусного промотора и сайта полиаденилирования BGH.

Исходным генетическим материалом для конструирования целевых плазмид служат следующие генно-инженерные исходные конструкции:

а) фагмида pHen4D1, содержащая ген одноцепочечного человеческого антитела, взаимодействующего с вирусом Эбола [13];

б) плазмиды pBVK14a2 и pBVK1-6, содержащие лидерные последовательности соответственно тяжелой и легкой цепей моноклональных мышиных антител (МКА) F10 [14];

в) плазмида pCIgG1, содержащая ген С_H1-С_H2-С_H 3-доменов тяжелой цепи IgG1 человека, клонированный между сайтами Ара I и XhoI [15];

г) плазмида pCkap, содержащая ген каппа-домена легкой цепи IgG человека [15].

Впервые была установлена первичная последовательность вариабельных участков одноцепочечного антитела в фагмиде pHen4D1. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в присутствии соответствующих олигонуклеотидных праймеров осуществлено объединение лидерной последовательности из легкой цепи МКАТ F10 и каппа-домена легкой цепи IgG человека с вариабельным фрагментом легкой цепи клона 4D1 и аналогичное объединение лидерной последовательности из тяжелой цепи МКАТ F10 и константных человеческих С_H1-С_H2-С_H3-доменов IgG1 с вариабельной областью тяжелой цепи одноцепочечного антитела 4D1.

Олигонуклеотидные праймеры для конструирования генов легкой и тяжелой цепи антитела человека против вируса Эбола (в направлении 5' -3').

1. CCTTCCCTAGGTCGGACTGTGGCTG

2. CTCATGGGTCTTCTGAGCTGACTC

3. CTCAGAAGACCCATGAGCACCAG

4. CTGTACTTGTCATCTATGG

5. GAGCCAGAGAATCGGTCTG

6. CCTTCGGGCCCTTGGTGGAGGCACTCGAGACGGTGACC

7. CCAAGCAGAGGTGCAGCTGGTGGAG

8. CTGCACCTCTGCTTGGGCACTTTG

9. GCTCCAGGGAAGGGGCTG

10. CTGGAGATGGTGAATCGGC

11. AAGCTGGCTAGCAGGCAAGG

12. CCATTCAGATCCTCTTCTGA

13. AAGCTGGCTAGCCACTTCTTAG

Сборка гена легкой цепи состоит из следующих этапов:

1. Объединение вариабельной области легкой цепи одноцепочечного антитела 4D1 с лидерной последовательностью легкой цепи мышиных антител F10.

Для этого в первой ступени ПЦР амплифицируют лидерную последовательность, используя в качестве матрицы pBVK1-6 [14] в присутствии праймеров 3 и 11, а также вариабельную область легкой цепи одноцепочечного антитела 4D1, кодируемую плазмидой pHen4D1, в присутствии праймеров 2 и 12. Продукты амплификации после выделения на агарозе объединяют и используют в качестве матрицы для второй струпени ПЦР в присутствии праймеров 11 и 12. Полученный фрагмент, содержащий вариабельную область с лидерной последовательностью, обрабатывают рестриктазой XmaJI.

2. Клонирование гена каппа-домена легкой цепи IgG человека в плазмиду pSK(+) с одновременным введением сайта XmaJI в 5-конец гена.

Ген каппа-домена, клонированный в плазмиду pcDNAS.l, содержит сайт XhoI на 3'-конце. Для его объединения с вариабельной областью гена легкой цепи, встроенного в фагмиду pHen4D1, необходимо ввести сайт XmaJI в 5'-конец, так как этим уникальным сайтом заканчивается вариабельная область. Амплификацию проводят в присутствии праймеров 1 и BGH (Invitrogen), продукты амплификации обрабатывают рестриктазой XhoI и клонируют в pSK(+) по сайтам EcoRV и XhoI. В результате получают плазмиду pSKC1.

3. Сборка полноразмерного гена легкой цепи.

Плазмиду pSKC1 обрабатывают рестриктазами SmaI и XmaJI и лигируют с фрагментом, полученным в этапе 1. Скрининг клонов проводят рестриктным анализом. Клоны, содержащие полноразмерный ген легкой цепи, анализируют секвенированием в присутствии праймеров 4 и 5. Далее из полученной таким образом промежуточной плазмиды pSK1 ген выщепляют рестриктазами NheI и XhoI и клонируют в экспрессионную плазмиду pcDNA3.1(+)(Invitrogen), обработанную этими же рестриктазами. Полученная в результате целевая рекомбинантная плазмида pCL1 была проанализирована гидролизом эндонуклеазами HaeIII, NheI, XmaJI и XhoI. Структура гена, кодирующего гибридный белок, подтверждена секвенированием, которое проводили по методике и с использованием набора Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit (Fermentas, Литва) [17]. Нуклеотидная последовательность гена легкой цепи и кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида приведены на Фиг.1.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pCL1, кодирующая синтез в клетках млекопитающих полипептида со свойствами легкой цепи полноразмерного моноклонального человеческого антитела, взаимодействующего с вирусом Эбола, характеризуется следующими признаками:

- имеет молекулярную массу 4,03 МДа и размер 6108 п.о.;

- кодирует гибридный белок, в котором вариабельный домен легкой цепи одноцепочечного антитела клона 4D1 из фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека соединен с константным доменом каппа-цепи IgG человека;

- состоит из следующих элементов:

a)NheI/XhoI - векторного фрагмента плазмиды pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) размером 5338 п.о., содержащего промотор-энхансер CMV, сайт полиаденилирования и участок терминации транскрипции BGH, ген -лактамазы (bla), ген устойчивости к неомицину;

б) NheI/XhoI - фрагмента промежуточной плазмиды pSK1 размером 770 п.о., включающего искусственный ген, кодирующий синтез полипептида со свойствами легкой цепи полноразмерного моноклонального человеческого антитела, взаимодействующего с вирусом Эбола;

- содержит:

а) цитомегаловирусный (CMV) промотор и энхансер транскрипции;

б) искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен легкой цепи одноцепочечного антитела 4D1 из комбинаторной библиотеки фаговых антител соединен с константным доменом каппа-цепи IgG человека;

в) в качестве генетических маркеров ген -лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой pCL1 клеток бактерий к ампициллину и ген устойчивости к неомицину для селекции трансфецированных плазмидой pCL1 клеток млекопитающих;

г) уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющие следующие координаты: Bg1II - 12, NheI - 895, XmaJI - 1294, XhoI - 1665.

Сборку гена тяжелой цепи проводят следующим образом:

1. На первом этапе амплифицируют лидерную последовательность тяжелой цепи МКА F10 на матрице pBVK14a2 в присутствии праймеров 8 и 13, а также вариабельную область тяжелой цепи антитела 4D1, используя в качестве матрицы pHen4D1 в присутствии праймеров 6 и 7 с одновременным введением сайта ApaI, который имеется на 5'-конце константой области IgG1. Продукты амплификации после выделения на агарозе объединяют и используют в качестве матрицы для второй струпени ПЦР в присутствии праймеров 6 и 13. Полученный фрагмент, содержащий вариабельную область с лидерной последовательностью, обрабатывают рестриктазами NheI и ApaI и после выделения на агарозе используют для лигирования.

2. Полноразмерный ген тяжелой цепи получают трехкомпонентным лигированием фрагмента, полученного на предыдущем этапе с ApaI - XhoI-фрагментом плазмиды pCIgG1, содержащим ген С_H 1-С_H2-С_H3-доменов IgG1 человека, клонированным между сайтами Ара I и Xhol, с векторной частью плазмиды pcDNA3.1/ NheI+XhoI.

В результате была получена целевая рекомбинантная плазмида рСН1, структуру которой анализировали гидролизом эндонуклеазами рестрикции HaeIII, NheI, ApaI и XhoI. Структура гена, кодирующего гибридный белок, подтверждена секвенированием, которое проводили по методике и с использованием набора Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit (Fermentas, Литва). Нуклеотидная последовательность гена тяжелой цепи и кодируемая ею аминокислотная последовательность рекомбинантного полипептида приведены на Фиг.2.

Рекомбинантная плазмидная ДНК рСH1, кодирующая синтез в клетках млекопитающих полипептида со свойствами тяжелой цепи полноразмерного моноклонального человеческого антитела, взаимодействующего с вирусом Эбола, характеризуется следующими признаками:

- имеет молекулярную массу 4,57 МДа и размер 6917 п.о.;

- кодирует гибридный белок, в котором вариабельный домен тяжелой цепи одноцепочечного антитела клона 4D1 из фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека соединен с константным доменом тяжелой цепи IgG человека;

- состоит из следующих элементов:

а) NheI/XhoI - векторного фрагмента плазмиды pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) размером 5338 п.о., содержащего промотор-энхансер CMV, сайт полиаденилирования и участок терминации транскрипции BGH, ген -лактамазы (bla), ген устойчивости к неомицину;

б) ApaI/XhoI - фрагмента промежуточной плазмиды pCIgG1 размером 1126 п.о., включающего ген С_H1-С_H2-С _H3-доменов IgG1 человека;

в) NheI/ApaI - фрагмента размером 453 п.о., полученного в результате амплификации и кодирующего лидерную последовательность тяжелой цепи антитела F10 и вариабельную область тяжелой цепи антитела 4D1;

- содержит:

а) цитомегаловирусный (CMV) промотор и энхансер транскрипции;

б) искусственный ген, кодирующий гибридный белок, в котором вариабельный домен тяжелой цепи одноцепочечного антитела 4D1 из комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека соединен с константным доменом IgG1 человека;

- в качестве генетических маркеров ген -лактамазы (bla), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой рСН1 клеток бактерий к ампициллину и ген устойчивости к неомицину для селекции трансфецированных плазмидой рСН1 клеток млекопитающих;

- уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: Bg1II - 12, NheI - 895, ApaI - 1344, XhoI - 1326 и 2474.

Сущность изобретения заключается в следующем

Генно-инженерными методами получены плазмиды pCL1 и рСН1, кодирующие искусственные гены легкой и тяжелой цепей полноразмерного человеческого антитела, созданные на основе вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей рекомбинантного антитела 4D1 фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека, константных генов IgG1 человека, цитомегаловирусного промотора и сайта полиаденилирования BGH4.

Сконструированные гены обусловливают биосинтез в клетках млекопитающих полипептидов со свойствами легкой и тяжелой цепей антитела человека, которые объединяются в антитело класса IgG1, направленное против вируса Эбола.

Для получения рекомбинантных полипептидов со свойствами полноразмерных легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина человека, образующих антитело класса IgG1, взаимодействующее с вирусом Эбола, плазмидами pCL1 и рСН1 трансфецируют клетки человека (293Т или СНО) с последующим выделением методом аффинной хроматографии на колонке с носителем Protein G Sepharose (Amersham) целевого белка. Способность полученного антитела взаимодействовать с антигеном вируса Эбола продемонстрирована в ИФА с использованием лизированного вируса (см. пример 5). Специфичность полученного полноразмерного антитела человека была продемонстрирована в иммуноблот анализе (см. пример 6).

Изобретение иллюстрируется следующими фигурами.

Фиг.1. Нуклеотидная последовательность и кодируемая ею аминокислотная последовательность NheI/XhoI-фрагмента плазмиды pCL1, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи антитела человека против вируса Эбола. Подчеркнуты сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, инициирующий и терминирующий кодоны выделены жирным шрифтом.

Фиг.2. Нуклеотидная последовательность и кодируемая ею аминокислотная последовательность NheI/XhoI-фрагмента плазмиды рСН1, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи антитела человека против вируса Эбола. Подчеркнуты сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, инициирующий и терминирующий кодоны выделены жирным шрифтом.

Фиг.3. Физическая карта плазмиды pCL1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Pcmv - цитомегаловирусный промотор; S - сигнальная последовательность; V1, k - вариабельный и константный участки гена легкой цепи рекомбинантного антитела; BGHpA - сайт полиаденилирования бычьего гормона роста.

Фиг.4. Физическая карта плазмиды рСH1. Указаны сайты эндонуклеаз рестрикции. Pcmv - цитомегаловирусный промотор; S - сигнальная последовательность; Vh, const. - вариабельный и константный участки гена тяжелой цепи рекомбинантного антитела; BGHpA - сайт полиаденилирования бычьего гормона роста.

Фиг.5. Электрофореграмма очищенного целевого белка в денатурирующем 13% ПААГ. Дорожки: 1 - маркер молекулярных масс, 2 - целевой белок, обработанный 2-меркаптоэтанолом, 3 - целевой белок, не обработанный 2-меркаптоэтанолом.

Фиг.6. Иммуноферментный анализ взаимодействия полученного рекомбинантного антитела с лизированным вирусом Эбола (ряд 1), с лизированным вирусом Марбург (ряд 2) и с бычьим сывороточным альбумином (ряд 3). На твердую фазу сорбирован вирус Эбола или вирус Марбург в концентрации 80 нг/лунку. Рекомбинантное антитело человека нанесено в последовательных разведениях, исходная концентрация 0,25 мг/мл, и проявлено антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы в разведении 1/10000.

Фиг.7. Иммуноблот-анализ белков вируса Эбола и вируса Марбург с использованием полученного рекомбинантного антитела. Дорожки: 1 - белки вируса Эбола, 2 - белки вируса Марбург, проявленные полученным рекомбинантным антителом.

Для лучшего понимания сущности изобретения ниже следуют примеры его конкретного выполнения.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pCL1.

а) Объединение вариабельной области легкой цепи антитела 4D 1 с лидерной последовательностью легкой цепи мышиных МКА F10.

Амплификацию лидерной последовательности проводят в объеме 100 мкл. Реакционная смесь содержит 100 нг pBVK1-6, по 50 пмолей праймеров 3 и 11, смесь dNTP (по 0.2 mM каждого), 10 mM Трис-HCl, рН 8.8, 10 mM KCl, 2.5 mM MgSO ₄, 2.5 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы (фирмы Stratagene) и 1 ед.акт.Taq ДНК-полимеразы (фирмы Fermentas). Проводят 25 циклов по схеме: 95°С/40 сек, 42°С/40 сек, 72°С/1 мин. Продукты реакции анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле; полосу длиной около 96 п.о. вырезают, ДНК экстрагируют из геля. Амплификацию вариабельной области легкой цепи проводят в объеме 100 мкл в присутствии 100 нг pHen4D1, 50 пмолей праймеров 2 и 12, смеси dNTP (по 0.2 mM каждого), 10 mM Трис-HCl, рН 8.8, 10 mM KCl, 2.5 mM MgSO₄, 2.5 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы (фирмы Stratagene) и 1 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы (фирмы Fermentas). Проводят 25 циклов по схеме: 95°С/40 сек, 42°С/40 сек, 72°С/1 мин.

Продукты реакции анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле; полосу длиной около 360 п.о. вырезают, ДНК экстрагируют из геля, объединяют с полученным ранее фрагментом и используют в качестве матрицы во второй ступени ПЦР, которую проводят в тех же условиях в присутствии праймеров 11 и 12. Продукт амплификации длиной около 450 п.о. обрабатывают рестриктазой XmaJI в соответствии с методикой, описанной в работе [16], и выделяют из агарозного геля.

б) Клонирование гена каппа-домена легкой цепи IgG человека в плазмиду pSK(+) с одновременным введением сайта XmaJI в 5'-конец гена.

Ген каппа-домена амплифицируют в 100 мкл реакционной смеси в присутствии 100 нг pCkap, по 50 пмолей праймеров 1 и BGH, смеси dNTP (по 0.2 mM каждого), 10 mM Трис-HCl, рН 8.8, 10 mM KCl, 2.5 mM MgSO₄, 2.5 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы (фирмы Stratagene) и 1 ед.акт.Taq ДНК-полимеразы (фирмы Fermentas). Проводят 25 циклов по схеме: 95°С/40 сек, 43°С/40 сек, 72°С/1 мин. Продукты реакции анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле; полосу длиной около 440 п.о. вырезают, ДНК экстрагируют из геля и обрабатывают XhoI. 5 мкг плазмидной ДНК pSK(+) (Stratagene, США) обрабатывают рестриктазами EcoRV и XhoI и XhoI плазмидную ДНК выделяют из 0,8% агарозного геля. Полученный в результате ПЦР фрагмент длиной 440 п.о. и векторную часть плазмиды pSK(+) лигируют в 20 мкл реакционной смеси в стандартных условиях [16]. 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг.мл ампициллина. В процессе рассева клеток на поверхность агара добавляют 100 мкл. 0,1 М раствора ИПТГ и 20 мкл 4%-ного раствора X-Gal. Из выросших белых клонов выделяют плазмидную ДНК, проводят анализ эндонуклеазами рестрикции EcoRV, XmaJI и Xhol, структуру клонированного фрагмента в отобранных клонах подтверждают определением нуклеотидной последовательности с использованием набора Cycle ReaderTM DNA Sequencing Kit (Fermentas, Литва), как описано в руководстве [17]. В результате получают промежуточную плазмиду pSKC1.

в) Сборка полноразмерного гена легкой цепи.

5 мкг плазмиды pSKC1 обрабатывают рестриктазами SmaI и XmaJI, линеаризированную векторную часть выделяют из агарозного геля и лигируют с 1 мкг фрагмента, полученного на этапе а) в 15 мкл реакционной смеси по стандартной методике [16]. 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Скрининг клонов проводят рестриктным анализом XmaJI, NheI и XhoI. Клоны, содержащие полноразмерный ген легкой цепи, анализируют секвенированием, как описано выше. 10 мкг полученной таким образом промежуточной плазмиды pSK1 обрабатывают рестриктазами NheI и XhoI, фрагмент длиной около 775 п.о. выделяют из агарозного геля и лигируют с 1 мкг векторного фрагмента экспрессионной плазмиды pcDNA3.1(+) (Invitrogen), обработанной этими же рестриктазами. Трансформацию и анализ клонов проводят, как описано выше. Полученную в результате рекомбинантную плазмиду pCL1 (фиг.3) анализируют гидролизом эндонуклеазами HaeIII, NheI, XmaJI и XhoI. Структура гена, кодирующего гибридный белок, подтверждают секвенированием (фиг.1).

Пример 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рСН1.

а) Объединение вариабельной области тяжелой цепи антитела 4D1 с лидерной последовательностью тяжелой цепи мышиных МКА F10. Амплификацию лидерной последовательности проводят в объеме 100 мкл. Реакционная смесь содержит 100 нг pBVK14a2, по 50 пмолей праймеров 8 и 13, смесь dNTP (по 0.2 mM каждого), 10 mM Трис-HCl, рН 8.8, 10 mM KCl, 2.5 mM MgSO₄, 2.5 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы (фирмы Stratagene) и 1 ед.акт.Taq ДНК-полимеразы (фирмы Fermentas). Проводят 25 циклов по схеме: 95°С/40 сек, 42°С/40 сек, 72°С/1 мин. Продукты реакции анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле; полосу длиной около 93 п.о. вырезают, ДНК экстрагируют из геля. Амплификацию вариабельной области тяжелой цепи проводят в объеме 100 мкл в присутствии 100 нг pHen 1, 50 пмолей праймеров 6 и 7, смеси dNTP (по 0.2 mM каждого), 10 mM Трис-HCl, рН 8.8, 10 mM KCl, 2.5 mM MgSO₄, 2.5 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы (фирмы Stratagene) и 1 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы (фирмы Fermentas). Проводят 25 циклов по схеме: 95°С/40 сек, 42°С/40 сек, 72°С/1 мин. Продукты реакции анализируют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле; полосу длиной около 389 п.о. вырезают, ДНК экстрагируют из геля, объединяют с полученным ранее фрагментом и используют в качестве матрицы во второй ступени ПЦР, которую проводят в тех же условиях в присутствии праймеров 6 и 13. Продукт амплификации длиной около 465 п.о. обрабатывают рестриктазами NheI и Ара I и выделяют из агарозного геля.

б) Сборка полноразмерного гена тяжелой цепи. 10 мкг плазмиды pCIgGI обрабатывают рестриктазами Ара I и Xhol, фрагмент длиной около 1130 п.о., содержащий ген С_H1-С_H2-С_H3-доменов IgG1 человека, выделяют из агарозного геля. 5 мкг плазмиды pcDNA3.1(+)(Invitrogen) обрабатывают рестриктазами NheI и XhoI и линеаризированную векторную часть выделяют из агарозного геля. Далее 1 мгк ApaI-XhoI - фрагмента, 1 мкг линеаризированной векторной части и 0,5 мкг ПЦР-фрагмента, полученного на этапе а) лигируют 20 мкл реакционной смеси по стандартной методике [11]. 5 мкл реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток XL-1 Blue (Stratagene, США). Трансформанты высевают на LB-агар, содержащий 100 мкг/мл ампициллина. Скрининг клонов проводят рестриктным анализом ApaI, NheI и XhoI. Полученную в результате рекомбинантную плазмиду рСН1 (фиг.4) анализируют HaeIII, NheI и XhoI. Клоны, содержащие полноразмерный ген тяжелой цепи, анализируют секвенированием, как описано выше (фиг.2).

Пример 3. Экспрессия полноразмерных человеческих антител в клеточных линиях млекопитающих.

Транзиентную экспрессию полноразмерных человеческих антител против вируса Эбола осуществляют в результате трансфекции клеток человека линии 293Т полученными экспрессионными плазмидами, содержащими гены легкой и тяжелой цепей антител. Для этого перед проведением трансфекции клетки 293Т культивируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в среде DMEM (Gibco BRL), содержащей 10% бычьей фетальной сыворотки. Клетки высевают на 60 мм чашки и выращивают до плотности 90-95%, после чего проводят трансфекцию.

Трансфекцию осуществляют следующим образом. Десять микрограмм плазмидной ДНК (5 мкг ДНК плазмиды pCLl и 5 мкг ДНК плазмиды pCHl) разводят в 500 мкл среды DMEM. Одновременно смешивают 25 мкл раствора LipofectAmine 2000 Reagent (Gibco BRL) с 500 мкл DMEM. Оба полученных раствора объединяют и инкубируют 20 мин при комнатной температуре. После инкубации раствор ДНК-LipofectAmine вносят в среду DMEM и полученную смесь используют в качестве культуральной среды для клеток 293 Т.

После трансфекции клетки выращивают 72 ч без замены культуральной среды. По завершении инкубации культуральную среду собирают и центрифугируют 5 мин при 1,500 rpm. Супернатант отделяют и используют в дальнейшем для выделения антител.

Пример 4. Выделение рекомбинантных антител с помощью аффинной хроматографии.

150 мл культуральной жидкости наносят на колонку, содержащую 1 мл носителя Protein G Sepharose (Amersham), уравновешенную буфером PBS. Колонку промывают 10 мл этого же буфера и рекомбинантный белок элюируют 0,1 М глицин-HCl, рН 2,7, собирая фракции по 0,5 мл. В каждую фракцию немедленно добавляют по 50 мкл. 2М Tris- HCl, рН 8,0 для нейтрализации. Фракции, содержащие рекомбинантный белок, анализируют с помощью электрофореза в ПААГ, объединяют и диализуют против буфера PBS. Очищенные рекомбинантные антитела характеризуют фракционированием в 12% ПААГ с SDS, приготавливая образцы для нанесения на гель в присутствии и отсутствии 2-меркаптоэтанола (фиг.5).

Пример 5. Взаимодействие полученного рекомбинантного антитела с лизированными вирусами Эбола и Марбург в ИФА.

Способность полученного антитела взаимодействовать с вирусным антигеном продемонстрирована в ИФА с использованием лизированного вируса Эбола. На твердую фазу сорбируют инактивированный вирусный препарат в концентрации 80 нг/лунку и после блокировки мест неспецифического связывания раствором 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА, "Sigma", США), инкубируют с полученным рекомбинантным антителом в последовательных разведениях. Иммунный комплекс выявляют добавлением антивидового конъюгата щелочной фосфатазы ("Sigma", США) в разведении 1:10000. В качестве хромогена используют пара-нитофенилфосфат ("ICN", США). Для проверки специфичности в параллельных экспериментах используют связывание полученного рекомбинантного антитела с лизированным вирусом Марбург и БСА. Результаты экспериментов показывают способность полученного рекомбинантного антитела связывать инактивированный вирус Эбола и отсутствие взаимодействия между полученным антителом и вирусом Марбург и БСА (фиг.6).

Пример 6. Специфичность полученного рекомбинантного антитела показана с помощью иммуноблот-анализа белков вируса Эбола и вируса Марбург (фиг.7). Белки вирусов Эбола и Марбург разделяют электрофоретически в 12% полиакриламидном геле с SDS, переносят на нитроцеллюлозный фильтр 0,45 мкм ("Millipore", США), который после блокирования сайтов неспецифического связывания раствором 3% БСА ("Sigma", США) инкубируют с исследуемым антителом. Связавшиеся антитела выявляют добавлением конъюгата щелочной фосфатазы ("Sigma", США) в разведении 1:10000. Визуализацию иммунного комплекса проводят, добавляя 5-бромо-3-индоло фосфат ("Carl Roth GmbH", Германия) и нитро-тетразолевый синий ("Sigma", США). Результаты показывают специфичность связывания полноразмерных антител с нуклеопротеином NP вируса Эбола, но не с белками вируса Марбург (фиг.7).

Таким образом, впервые сконструированы плазмиды, содержащие искусственные гены легкой и тяжелой цепей полноразмерного человеческого антитела, созданные на основе вариабельных фрагментов легких и тяжелых цепей рекомбинантного антитела 4D1 из комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека, константных генов IgG1 человека, цитомегаловирусного промотора и сайта полиаденилирования BGH4. Транзиентная трансформация эукариотических клеток линии 293 Т обусловливает биосинтез полипептидов со свойствами легкой и тяжелой цепей антитела человека, которые объединяются в антитело класса IgG1, специфически взаимодействующее с нуклеопротеином вируса Эбола. Полученные полноразмерные рекомбинантные антитела против вируса Эбола могут служить основой для создания препаратов для диагностики и лечения опасного заболевания, вызываемого этим инфекционным агентом.

Источники информации

1. Peters C.J., Sanchez A., Rollin P.E., Nichol S., Ksiazek T.G., Murphy F.A. Filoviridae: Marburg and Ebola viruses. In: Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M., Eds. Fields virology. 3^rd ed. Vol 1. New York: Raven Press, 1996. P.1161-1176.

2. Beer В., Kurth R., Bukreyev A. Characteristics of Filoviridae: Marburg and Ebola viruses // Naturwissenschaften. 1999. V.86. P.8-17.

3. Михайлов В.В., Борисевич И.В., Черникова Н.К., Потрываева Н.В., Краснянский В.П. // Вопр. вирусол. 1994. V.39. Р.215-240.

4. Патент США 4816567, кл. С 07 К 15/14, опубл. 28.03.1989 г.

5. Патент США 4975369, кл. С 12 N 15/10, опубл. 04.12.1990 г.

6. Патент РФ 2207878, кл. А 61 К 39/395, опубл. 10.07.2003 г.

7. McCafferty J., Griffiths A.D., Winter G., Chiswell D.J. // Nature. 1990. V.348. P.552-554.

8. Hoogenboom H.R., Griffiths A.D., Johnson S., Chiswell D.J., Hudson P., Winter G. // Nucl. Acids. Res. 1991. V.19. P.4133-4137.

9. Международная заявка WO 92/01047, кл. С 07 К 13/00, опубл. 23.01.1992.

10. Международная заявка WO 92/09690, кл. С 12 N 15/00, опубл. 11.06.1992.

11. Miescher S., Zahn-Zabal M., De Jesus M., Moudry R., Fisch I., Vogel M., Kobr M., Imboden M.A., Kragten E., Bichler J., Mermod N., Stadler B.M., Amstutz H., Wurm F.//Br.J.Haematol., 2000, v.111 (1), p.157-166.

12. Tong Y.G, Xu J., Liu G.Q, Zhang Y.G., Cheng W.R., Liu S.L., Wang H.T. // Sheng Wu Hua Yu Sheng Wu Wu Li XueBao (Shanghai), 2000, v.32 (4), р.392-396.

13. Тикунова Н.В., Колокольцов А.А., Чепурнов А.А. // ДАН. 2001, т.378, №4. С.551-554.

14. B.V.Radko, V.E.Boitchenko, S.A.Nedospasov and V.G.Korobko. // Russian Journal of Immunology, 2002, v.7(4), p.371-374.

15. T.K.Aliev, А.А.Panina, L.E.Petrovskaya, L.N.Shingarova, B.V.Radko, S.A.Nedospasov, V.G.Korobko, G.A.Zavyalova, V.P.Zavyalov. // Clinical Immunology, 2002, v.103 (3), part 2, p.S90.

16. Sambrook J., Fritsch E., Maniatis Т. // Molecular Cloning. A Laboratory manual. 2^nd ed. Cold Spring Harbor, NY, 1989.

17. CycleReader DNA Sequencing Kit#K1711, Fermentas. Sequencing Protocol.