ортозамещенные производные бензойной кислоты, способ и промежуточные соединения для их получения, фармацевтическая композиция на их основе и применение

Формула изобретения

1. Соединение формулы I

где n представляет собой 0, 1 или 2;

R ¹ представляет собой галогено, С_1-4алкильную группу, которая возможно замещена одним или более чем одним атомом фтора, С_1-4алкоксильную группу, которая возможно замещена одним или более чем одним атомом фтора, причем, когда n представляет собой 2, заместители R¹ могут быть одинаковыми или разными;

R² представляет собой неразветвленную С_2-7алкильную группу;

R³ представляет собой Н или ОСН₃; и

W представляет собой O или S;

и его фармацевтически приемлемые соли.

2. Соединение по п.1, где W представляет собой О.

3. Соединение по п.1, где W представляет собой S.

4. Соединение, выбранное из следующего:

2-[2-(4-{2-[этил(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(2,4-дифторбензил)(гептил)-амино]-2-оксоэтокси}-3-метоксифенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(4-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этилтио]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(4-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[этил(4-трифторметилбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[этил(4-трифторметилбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этилтио]-бензойная кислота;

2-{2-[4-(2-{бутил[2-фтор-4-(трифторметил)-бензил]-амино}-2-оксоэтокси)-фенил]-этокси}-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(2,4-дифторбензил)(пропил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-{[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(4-трет-бутилбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[этил-(4-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-{[2-(4-{2-[этил-(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензойная кислота; или

2-{[2-(4-{2-[(2-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензойная кислота

и его фармацевтически приемлемые соли.

5. Фармацевтическая композиция для лечения гиперлипидемии, дислипидемии, диабета и ожирения, содержащая соединение по любому из пп.1-4 в смеси с фармацевтически приемлемыми адъювантами, разбавителями и/или носителями.

6. Применение соединения по любому из пп.1-4 в изготовлении лекарства для лечения резистентности к инсулину.

7. Способ получения соединения формулы I, при котором проводят взаимодействие соединения формулы II,

в которой R¹, R², R ³, W и n такие, как определено выше, и PG представляет собой защитную группу для карбоксильной группы гидрокси, с агентом снятия защиты.

8. Соединение формулы II

в которой R¹, R², R ³, W, n такие, как определно выше, и PG представляет собой защитную группу для карбоксильной группы гидрокси.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Данное изобретение относится к некоторым новым производным бензойной кислоты, способам получения таких соединений, их применению в лечении клинических состояний, ассоциированных с резистентностью к инсулину, способам их терапевтического применения и фармацевтическим композициям, которые их содержат.

Предшествующий уровень техники

Синдром резистентности к инсулину (СРИ), включающий в себя сахарный диабет типа 2, относится к кластеру проявлений, включающих в себя резистентность к инсулину с сопутствующей гиперинсулинемией, возможный сахарный диабет типа 2, артериальную гипертензию, центральное (висцеральное) ожирение, дислипидемию, наблюдаемую как ненормальные уровни липопротеинов, в типичных случаях характеризуемые повышенными ЛОНП (липопротеины очень низкой плотности), малыми плотными частицами ЛНП и сниженными концентрациями ЛВП (липопротеины высокой плотности) и сниженным фибринолизом.

Недавние эпидемиологические исследования документировали то, что индивиды с резистентностью к инсулину подвержены сильно увеличенному риску сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности, особенно страдая от инфаркта миокарда и инсульта. Состояния, имеющие отношение к атеросклерозу, при сахарном диабете типа 2 причиняют до 80% всех смертей.

В клинической медицине имеет место осознание необходимости увеличения чувствительности к инсулину у пациентов, страдающих от СРИ, и, таким образом, коррекции дислипидемии, которую считают обуславливающей ускоренное прогрессирование атеросклероза. Однако в настоящее время она не является заболеванием с универсальным четким определением.

S-Энантиомер соединения нижеприведенной формулы С

2-этокси-3-[4-(2-{4-метансульфонилоксифенил}-этокси)-фенил]-пропаноевой кислоты, раскрыт в публикации РСТ №WO 99/62872. Об этом соединении сообщают, что оно является модулятором рецепторов, активируемых пролифератором пероксисом (PPAR, обзор по PPAR см. в Т. М. Willson et al, J Med Chem 2000, Vol 43, 527) и имеет комбинированную агонистическую активность по отношению к PPAR /PPAR (Structure, 2001, Vol 9, 699, P.Cronet et al). Это соединение является эффективным в лечении состояний, ассоциированных с резистентностью к инсулину.

Неожиданно найдена серия соединений, которые являются селективными модуляторами PPAR .

Описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает соединение формулы I,

где n представляет собой 0, 1 или 2;

R ¹ представляет собой галогено, С_1-4алкильную группу, которая возможно замещена одним или более чем одним атомом фтора, С_1-4алкоксильную группу, которая возможно замещена одним или более чем одним атомом фтора, и причем, когда n представляет собой 2, заместители, представляющие собой R¹, могут быть одинаковыми или разными;

R² представляет собой неразветвленную С_2-7алкильную группу;

R³ представляет собой Н или ОСН₃; и

W представляет собой О или S,

и его фармацевтически приемлемые соли и пролекарства.

Далее следуют дополнительные определения значений R¹, R², R³ и W в соединении Формулы I. Надо понимать, что такие значения можно использовать с любым из определений, пунктов формулы изобретения или воплощений, определенных здесь выше или ниже.

В первом аспекте R¹ представляет собой галогено, С_1-4 алкильную группу или С_1-4алкоксильную группу и n представляет собой 0, 1 или 2. В частности, R¹ представляет собой фтор, хлор или трифторметил, когда n представляет собой 1. В частности, R¹ представляет собой фтор, когда n представляет собой 2.

Во втором аспекте R² представляет собой этил или гексил.

В третьем аспекте R³ представляет собой Н.

В четвертом аспекте R³ представляет собой ОМе.

В пятом аспекте W представляет собой О.

В шестом аспекте W представляет собой S.

Термин неразветвленный С_2-7алкил обозначает имеющий прямую цепь насыщенный алифатический углеводород, имеющий от 2 до 7 атомов углерода. Примеры вышеуказанного алкила включают в себя этил, н-пропил, н-бутил, н-пентил, н-гексил и н-гептил.

Специалисты должны понимать, что термин "прерванный", как он использован выше. означает, что атом кислорода находится в пределах алкильной цепи и не представляет собой терминальный атом. Термины "пролекарственная форма" или "пролекарство" при использовании в этом описании равнозначны и включают в себя производные группы карбоновой кислоты, которые в млекопитающем, в частности человеке, превращаются в группу карбоновой кислоты или ее соль или конъюгат. Следует понимать, что, при отсутствии теоретических ограничений, считают, что большая часть активности, ассоциированной с пролекарственными формами, возникает из активности соединения формулы I, в которое превращаются пролекарственные формы. Пролекарственные формы можно получать рутинными способами вполне в пределах способностей специалиста. В данной области известны различные пролекарственные формы карбокси. Примеры таких производных, представляющих собой пролекарственные формы, см. в:

a) Design of Prodrugs, edited by Н. Bundgaard, (Elsevier, 1985) и Methods in Enzymology. 42: 309-396, edited by K. Widder, et al. (Academic Press, 1985);

b) A Textbook of Prodrug Design and Development, edited by Krogsgaard-Larsen and H. Bundgaard, Chapter 5 "Design and Application of Prodrugs", by H. Bundgaard p.113-191 (1991);

c) H.Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:1-38 (1992);

d) H.Bundgaard, et al.. Journal of Pharmaceutical Sciences, 77:285 (1988); и

e) N.Kakeya, et al., Chem Pharm Bull, 32:692 (1984).

Вышеуказанные документы инкорпорированы сюда ссылкой.

Расщепляемые in vivo сложные эфиры представляют собой только один тип пролекарственной формы исходной молекулы.

Соединения формулы I имеют активность как медикаменты, в частности, соединения формулы I являются селективными агонистами PPAR , то есть, их EC₅₀ для PPAR по меньшей мере в четыре раза ниже и предпочтительно по меньшей мере в 10 или 50 раз ниже, чем их соответствующие EC ₅₀ для PPAR , причем EC₅₀ измеряют и рассчитывают как описано в анализах далее в этом документе. Соединения формулы I являются сильнодействующими и селективными.

Настоящее изобретение предлагает соединение, которое выбирают из следующих:

2-[2-(4-{2-[этил(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-1(2,4-дифторбензил)(гептил)-амино]-2-оксоэтокси}-3-метоксифенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-1(4-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этилтио]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(4-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[этил(4-трифторметилбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[этил(4-трифторметилбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этилтио]-бензойная кислота;

2-{2-[4-(2-{бутил[2-фтор-4-(трифторметил)-бензил]-амино}-2-оксоэтокси)-фенил]-этокси}-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(2,4-дифторбензил)(пропил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-{[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(4-трет-бутилбензил)(этил)-амино)-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[этил(4-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси)-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-{[2-(4-{2-[этил(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио)-бензойная кислота; или

2-{[2-(4-{2-[(2-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензойная кислота

и их фармацевтически приемлемые соли.

В частности, это соединение выбирают из следующих:

2-[2-(4-{2-[этил(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(4-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этилтио]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[(2,4-дифторбензил)(пропил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота;

2-[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота; или

2-[2-(4-{2-[этил-(4-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси)-фенил)-этокси]-бензойная кислота.

Также надо понимать, что определенные соединения по настоящему изобретению могут существовать в сольватированных, а также несольватированных формах. Надо понимать, что настоящее изобретение охватывает все такие сольватированные формы. Определенные соединения по настоящему изобретению могут существовать как таутомеры. Надо понимать, что настоящее изобретение охватывает все такие таутомеры.

По всему этому описанию, а также в прилагаемой формуле изобретения данная химическая формула или название должно охватывать все ее стереоизомеры и оптические изомеры и рацематы, а также смеси отдельных энантиомеров в разных пропорциях, когда существуют такие изомеры и энантиомеры, а также их фармацевтически приемлемые соли. Изомеры можно разделять при использовании общепринятых методик, например хроматографии или фракционной кристаллизации. Энантиомеры можно изолировать разделением рацематов, например, фракционной кристаллизацией, повторным растворением или ВЭЖХ. Диастереомеры можно изолировать разделением смесей изомеров, к примеру, фракционной кристаллизацией, ВЭЖХ или флэш-хроматографией. Или же стереоизомеры можно получать хиральным синтезом из хиральных исходных материалов в условиях, которые не должны вызывать рацемизацию или эпимеризацию, или дериватизацией хиральным реагентом. Все стереоизомеры включены в объем этого изобретения.

Способы получения

Соединения по этому изобретению можно получать как обрисовано ниже. Однако это изобретение не ограничено этими способами, эти соединения можно также получать как описано для структурно родственных соединений в уровне техники. Взаимодействия можно проводить в соответствии со стандартными процедурами или как описано в экспериментальной секции.

Соединения формулы 1 можно получать взаимодействием соединения формулы II,

в которой R¹, R², R ³, W и n такие, как определено выше, и PG представляет собой защитную группу для карбоксильной группа гидрокси, как описано в стандартном тексте "Protective Groups in Organic Synthesis, 2^nd Edition (1991) Green и Wuts, с агентом снятия защиты. Защитной группой также может быть смола, такая как смола Вонга (Wang), или смола, представляющая собой хлорид 2-хлортритила. Защитные группы можно удалять в соответствии с методиками, которые хорошо известны специалистам. Одна такая защитная группа является такой, где PG представляет собой группу C_1-6алкокси или группу арилалкокси, например бензил, так что COPG представляет собой сложный эфир. Такие сложный эфиры можно приводить во взаимодействие с гидролизующим агентом, например гидроксидом лития в присутствии растворителя, например смеси тетрагидрофурана и воды, или гидроксидом калия в C_1-3 спирте, например метаноле, при температуре в диапазоне 0-200°С или микроволновой радиацией с получением соединения формулы I.

Соединения формулы II можно получать взаимодействием соединения формулы III

или его соли, например соли, представляющей собой гидрохлорид, в котором R¹, R² и n такие, как определено выше, с соединением формулы IV

или его хлорангидридом, в котором R³ , W и PG такие, как определено выше, в инертном растворителе, например дихлорметане, возможно в присутствии сочетающего агента, например 4-диметиламинопиридина или гидрохлорида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида, при температуре в диапазоне от -25°С до 150°С.

Соединения формулы II можно также получать взаимодействием соединения формулы V,

в котором PG такой, как определено выше, с соединением формулы VI,

в котором R¹, R², R ³, W и n такие, как определено выше, и L представляет собой уходящую группу, например метилсульфонилокси или галогено, например бром, возможно в присутствии растворителя, например ацетонитрила, и возможно в присутствии основания, например карбоната калия, при температуре в диапазоне от 0 до 150°С.

Соединения формулы III, IV, V и VI можно получать способами, описанными в Примерах, или аналогичными способами, известными специалистам.

Соединения формулы II, III, IV и V являются полезными промежуточными соединениями в получении соединения формулы I. Некоторые соединения из их числа являются новыми. Новые соединения формулы II, или формулы III, или формулы IV, или формулы V заявлены здесь как дополнительный аспект данного изобретения.

Соединения по этому изобретению можно изолировать из их реакционных смесей при использовании общепринятых методик.

Специалисты должен понимать, что для получения соединений по этому изобретению альтернативным и, в некоторых случаях, более удобным образом, индивидуальные стадии способов, упомянутые здесь выше, можно осуществлять в разном порядке, и/или индивидуальные взаимодействия можно осуществлять на разных стадиях всего пути (т.е., химические превращения можно осуществлять при иных промежуточных соединениях, нежели на те, что ассоциированы здесь выше с конкретным взаимодействием).

В любом из предыдущих способах получения, если необходимо, гидрокси, амино или другие взаимодействующие группы можно защищать при использовании защитной группы, R^p как описано в стандартном тексте "Protective groups in Organic Synthesis", 2^nd Edition (1991) Greene и Wuts.

Защитной группой также может быть смола, такая как смола Вонга (Wang), или смола, представляющая собой хлорид 2-хлортритила. Защита функциональных групп и снятие защиты с них может иметь место до или после любой из стадий взаимодействия, описанных здесь выше. Защитные группы можно удалять в соответствии с методиками, которые хорошо известны специалистам.

Выражение "инертный растворитель" относится к растворителю, который не взаимодействует с исходными материалами, реагентами, промежуточными соединениями или продуктами таким образом, который нежелательно влияет на выход желаемого продукта.

Фармацевтические препараты

Соединения по этому изобретению в норме надо вводить пероральным, парентеральным, внутривенным, внутримышечным, подкожным или другими инъекционными путями, защечным, ректальным, вагинальным, чрезкожным и/или носовым путем и/или ингаляцией в форме фармацевтического препарата, содержащего активный ингредиент либо как свободную кислоту, либо как фармацевтически приемлемую соль в фармацевтически приемлемой лекарственной форме. В зависимости от нарушения и пациента, подлежащего лечению, и пути введения, эти композиции можно вводить в варьирующих дозах.

Подходящие суточные дозы соединений по этому изобретению в терапевтическом лечении людей составляют около 0,0001-100 мг/кг массы тела, предпочтительно 0,001-10 мг/кг массы тела.

Предпочтительными являются пероральные препараты, в особенности таблетки или капсулы, которые можно составлять способами, известными специалистам, для предоставления доз активного соединение в диапазоне от 0,5 мг до 500 мг, например 1 мг, 3 мг, 5 мг, 10 мг, 25 мг, 50 мг, 100 мг и 250 мг.

Таким образом, в соответствии с дополнительным аспектом этого изобретения, предложен фармацевтический препарат, включающий в себя любое из соединений по этому изобретению или его фармацевтически приемлемую соль в смеси с фармацевтически приемлемыми адъювантами, разбавителями и/или носителями.

Пример получения фармацевтической композиции и изготовления фармацевтического препарата в форме таблетки.

ПРИМЕР. Изготовление таблеток

Ингредиенты	мг/таблетку
1. Активное соединение	10,0
2. Целлюлоза микрокристаллическая	57,0
3. Гидрофосфат кальция	15,0
4. Натрия крахмала гликолят	5,0
5. Двуокись кремния, коллоидная	0,25
6. Магния стеарат	0,75

Активный ингредиент 1 смешивают с ингредиентами 2, 3, 4 и 5 в течение приблизительно 10 минут. Затем добавляют стеарат магния, полученную смесь перемешивают в течение приблизительно 2 минут и прессуют в форме таблетки, которую затем можно покрыть пленочной оболочкой.

Фармакологические свойства

Данные соединения формулы (I) полезны для профилактики и/или лечения клинических состояний, ассоциированных с врожденной или индуцированной сниженной чувствительностью к инсулину (резистентностью к инсулину) и ассоциированных метаболических нарушений (также известных как метаболический синдром). Эти клинические состояния включают в себя следующие без ограничения ими: общее ожирение, абдоминальное ожирение, артериальная гипертензия, гиперинсулинемия, гипергликемия, диабет типа 2 и дислипидемия, которая характерным образом появляется при резистентности к инсулину. Эта дислипидемия, также известная как атерогенный липопротеиновый профиль, характеризуется умеренно повышенными уровнями неэстерифицированных жирных кислот, повышенными уровнями богатых триглицеридами частиц, представляющих собой липопротеины очень низкой плотности (ЛОНП), и аполипопротеинов АроВ, низкими уровнями липопротеинов высокой плотности (ЛВП), ассоциированными с низкими уровнями частиц, представляющих собой аро AI, и с высокими уровнями Аро В, в присутствии мелких, плотных частиц, представляющих собой липопротеины низкой плотности (ЛНП) фенотипа В.

Ожидается, что соединения по данному изобретению полезны в лечении пациентов с комбинированными или смешанными гиперлипидемиями или различными степенями гипертриглицеридемий и послепищевой дислипидемии при наличии или отсутствии других проявлений метаболического синдрома.

Ожидается, что лечение данными соединениям из-за их антидислипидемических, а также противовоспалительных свойств снизит сердечно-сосудистую заболеваемость и смертность, ассоциированную с атеросклерозом. Состояния, представляющие собой сердечно-сосудистые заболевания, включают в себя макроангиопатии различных внутренних органов, вызывающие инфаркт миокарда, застойную сердечную недостаточность, заболевание церебральных сосудов и недостаточность периферических артерий нижних конечностей. По причине их действия, состоящего в сенсибилизации к инсулину, ожидается, что соединения формулы I предотвращают и замедляют развитие диабета типа 2 из метаболического синдрома и диабета беременных. Поэтому ожидается, что будет замедлено развитие долгосрочных осложнений, ассоциированных с хронической гипергликемией, таких как микроангиопатии, вызывающие заболевания почек, повреждение сетчатки и заболевания периферических сосудов нижних конечностей, при сахарном диабете. Более того, эти соединения могут быть полезными в лечении различных состояний вне сердечно-сосудистой системы, независимо от их связи с резистентностью к инсулину, таких как синдром поликистоза яичников, ожирение, рак и состояния, представляющие собой воспалительные заболевания, в том числе нейродегенеративные нарушения, такие как легкие умственные расстройства, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз.

Ожидается, что соединения по данному изобретению полезны в контролировании уровней глюкозы у пациентов, страдающих диабетом типа 2.

Настоящее изобретение предлагает способ лечения или предотвращения дислипидемии, синдрома резистентности к инсулину и/или метаболических нарушений (какие определены выше), при котором соединение формулы I вводят млекопитающему (в особенности, человеку), которое в этом нуждается.

Настоящее изобретение предлагает способ лечения или предотвращения диабета тип 2, при котором соединение формулы I вводят млекопитающему (в частности человеку), которое в этом нуждается.

В дополнительной аспекте настоящее изобретение предлагает применение соединения формулы I в качестве медикамента.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение предлагает применение соединения формулы I в изготовлении медикамента для лечения резистентности к инсулину и/или метаболических нарушений.

Комбинационная терапия

Соединения по этому изобретению можно комбинировать с другим терапевтическим агентом, который является полезным в лечении нарушений, ассоциированных с развитием и прогрессированием атеросклероза, таких как гипертензия, гиперлипидемии, дислипидемии, диабет и ожирение. Соединения по этому изобретению можно комбинировать с другим терапевтическим агентом, который снижает соотношение ЛНП:ЛВП, или агентом, который вызывает уменьшение уровней ЛНП-холестерина в крови. У пациентов с сахарным диабетом соединения по этому изобретению можно также комбинировать с терапевтическими агентами, применяемыми для лечения осложнений, имеющих отношение к микроангиопатиям.

Соединения по этому изобретению можно использовать наряду с другими способами терапии метаболического синдрома или диабета типа 2 и ассоциированных с ним осложнений, что включает в себя лекарственные средства, представляющие собой бигуаниды, например метформин, фенформин и буформин, инсулин (синтетические аналоги инсулина, амилин) и пероральные антигипергликемические средства (из разделяют на регуляторы глюкозы при приеме пищи и ингибиторы альфа-глюкозидазы). Примером ингибитора альфа-глюкозидазы является акарбоза или воглибоза или миглитол. Примером регулятора глюкозы при приеме пищи является репаглинид или натеглинид.

В другом аспекте этого изобретения соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму можно вводить в ассоциации с другим PPAR-модулирующим агентом. PPAR-модулирующие агенты включают в себя следующие без ограничения ими: агонист PPAR и/или PPAR и/или PPAR , или его фармацевтически приемлемый соли, сольваты, сольваты таких солей или пролекарственные формы. Подходящие агонисты PPAR и/или PPAR , их фармацевтически приемлемый соли, сольваты, сольваты таких солей или пролекарственные формы хорошо известны в данной области. Они включают в себя соединения, раскрытые в WO 01/12187, WO 01/12612, WO 99/62870, WO 99/62872, WO 99/62871, WO 98/57941, WO 01/40170, J Med Chem, 1996, 39, 665, Expert Opinion on Therapeutic Patents, 10 (5), 623-634 (в частности, соединения, раскрытые в заявках на патент, перечисленных на стр.634) и в J Med Chem, 2000, 43, 527, которые все инкорпорированы сюда ссылкой на них. В частности агонист PPAR и/или PPAR относится к BMS 298585, клофибрату, фенофибрату, безафибрату, гемфиброзилу и ципрофибрату; GW 9578, пиоглитазону, розиглитазону, ривоглитазону, балаглитазону, KRP-297, JTT-501, SB 213068, GW 1929, GW 7845. GW 0207, L-796449, L-165041 и GW 2433. В частности агонист PPAR и/или PPAR относится к (S)-2-этокси-3-[4-(2-{4-метансульфонилокси-фенил)-этокси)-фенил]-пропаноевой кислоте и ее фармацевтически приемлемым солям.

Кроме того, комбинацию по этому изобретению можно использовать в сочетании с сульфонилмочевиной например: глимепиридом, глибенкламидом (глибуридом), гиклазидом, глипизидом, гликвидоном, хлорпропамидом, толбутамидом, ацетогексамидом, гликопирамидом, карбутамидом, глибонуридом, глизоксепидом, глибатиазолом, глибузолом, глигексамидом, глимидином, глипинамидом, фенбутамидом, толцинамидом и толазамидом. Предпочтительно сульфонилмочевина представляет собой глимепирид или глибенкламид (глибурид). Более предпочтительно сульфонилмочевина представляет собой глимепирид. Поэтому данное изобретение включает в себя введение соединения по данному изобретению в сочетании с одним, двумя или более чем двумя из существующих терапевтических средств, описанных в этом параграфе. Дозы других существующих терапевтических средств лечения диабета типа 2 и ассоциированных с ним осложнений должны быть теми, которые известны в данной области и одобрены для применения регулятивными органами, например FDA, и их можно найти в Orange Book, публикуемую FDA. Или же можно использовать меньшие дозы в результате пользы от этой комбинации. Настоящее изобретение также включает в себя соединение по настоящему изобретению в комбинации с агентом понижения холестерина. Агенты понижения холестерина, оговоренные в этой заявке, включают в себя без ограничения ими ингибиторы редуктазы ГМГ-КоА (редуктаза 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзима А).

Подходящим образом ингибитор редуктазы ГМГ-КоА представляет собой статин, который выбирают из группы, состоящей из аторвастатина, бервастатина, церивастатина, далвастатина, флувастатина, итавастатина, ловастатина, мевастатина, никостатина, нивастатин, правастатина и симвастатина или его фармацевтически приемлемой соли, в особенности натриевой или кальциевой, или сольвата или сольвата такой соли. Конкретным статином является аторвастатин или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственная форма. Более конкретным статином является кальциевая соль аторвастатина. Особенно предпочтительным статином является, однако, соединение с химическим названием (Е)-7-[4-(4-фторфенил)-6-изопропил-2-[метил(метилсульфонил)-амино]-пиримидин-5-ил]-(3R,5S)-3,5-дигидроксигепт-6-еноевая кислота [также известное как (Е)-7-[4-(4-фторфенил)-6-изопропил-2-[N-метил-N-(метилсульфонил)-амино]-пиримидин-5-ил]-(3R,5S)-3,5-дигидроксигепт-6-еноевая кислота] или ее фармацевтически приемлемая соль или сольват или сольват такой соли. Соединение (Е)-7-[4-(4-фторфенил)-6-изопропил-2-[метил-(метилсульфонил)-амино]-пиримидин-5-ил]-(3R,5S)-3,5-дигидроксигепт-6-еноевая кислота и его кальциевая и натриевая соли раскрыты в Заявке на европейский патент, Публикация №ЕР-А-0521471, и в Bioorganic and Medicinal Chemistry, (1997), 5(2), 437-444. Этот последний статин сейчас известен под названием розувастатин (название дженерика).

В данной заявке термин "агент понижения холестерина" также включает в себя химические модификации ингибиторов редуктазы ГМГ-КоА, такие как сложные эфиры, пролекарственные формы и метаболиты, как активные, так и неактивные.

Настоящее изобретение также включает в себя соединение по настоящему изобретению в комбинации с агентом связывания желчных кислот, например колестиполом или холестирамином или холестагелем.

Настоящее изобретение также включает в себя соединение по настоящему изобретению в комбинации с ингибитором системы транспорта желчных кислот в тонком кишечнике (IBAT-ингибитором).

Были раскрыты подходящие соединения, имеющие активность IBAT-ингибитора, см. к примеру соединения, раскрытые в WO 93/16055, WO 94/18183, WO 94/18184, WO 94/24087, WO 96/05188, WO 96/08484, WO 96/16051, WO 97/33882, W098/07749, WO 98/38182, WO 98/40375, WO 98/56757, WO 99/32478, WO 99/35135, WO 99/64409, WO 99/64410, WO 00/01687, WO 00/20392, WO 00/20393, WO 00/20410, WO 00/20437, WO 01/34570, WO 00/35889, WO 00/47568, WO 00/61568, WO 01/68637, WO 01/68096, WO 02/08211, WO 00/38725, WO 00/38726, WO 00/38727, WO 00/38728, WO 00/38729, DB 19825804, JP 10072371, US 5070103, BP 251315, ЕР 417725, ЕР 489423, ЕР 549967, ЕР 573848, ЕР 624593, ЕР 624594, ЕР 624595, ЕР 869121, ЕР 864582 и ЕР 1070703, и содержание этих заявок на патенты, в частности соединения, раскрытые в п.1 формулы, и поименованные примеры инкорпорированы сюда ссылкой на них.

Конкретные классы IBAT-ингибиторов, подходящие для применения в настоящем изобретении, представляют собой бензотиепины, и соединения, описанные в формуле изобретения, в особенности в п.1, в WO 00/01687, WO 96/08484 и WO 97/33882 инкорпорированы сюда ссылкой на них. Другие подходящие классы IBAT-ингибиторов представляют собой 1,2-бензотиазепины, 1,4-бензотиазепины и 1,5-бензотиазепины. Дополнительный подходящие класс IBAT-ингибиторов представляет собой 1,2,5-бензотиадиазепины.

Одним конкретным подходящим соединением, имеющим активность IBAT-ингибитора, является (3R,5R)-3-бутил-3-этил-1,1-диоксидо-5-фенил-2,3,4,5-тетрагидро-1,4-бензотиазепин-8-ил- -D-глюкопиранозидуроновая кислота (ЕР 864 582). Другие подходящие IBAT-ингибиторы включают в себя одно из следующего:

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)-1'-фенил-1'-[N'-(карбоксиметил)-карбамоил]-метил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -(N'-(карбоксиметил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)-1'-фенил-1'-[N'-(2-сульфоэтил)-карбамоил]-метил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3-бутил-3-этил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)-1'-фенил-1'-[N'-(2-сульфоэтил)-карбамоил]-метил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N'-(2-сульфоэтил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3-бутил-3-этил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)-( -[N'-(2-сульфоэтил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3-бутил-3-этил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N'-(2-карбоксиэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N'-(2-карбоксиэтил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензтиазепин;

1,1 -диоксо-3-бутил-3-этил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N'-(5-карбоксипентил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)-( -N'-(2-карбоксиэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{ -N'-(2-сульфоэтил)-карбамоил]-2-фторбензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3-бутил-3-этил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N'-(R)-(2-гидрокси-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензтиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N'-(R)-(2-гидрокси-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-{N-[(R)- -(N'-{(R)-1-[N'-(R)-(2-гидрокси-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-2-гидроксиэтил}-карбамоил)-бензил]-карбамоилметокси}-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{ -[N'-(2-сульфоэтил)-карбамоил]-2-фторбензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3-бутил-3-этил-5-фенил-7-метилтио-8-(N{(R)- -[N'-(R)-(2-гидрокси-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензтиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N{(R)- -[N'-(R)-(2-гидрокси-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-{N-[(R)- -(N'-{(R)-1-[N''-(R)-(2-гидрокси-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-2-гидроксиэтил}-карбамоил)-бензил]-карбамоилметокси}-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3-бутил-3-этил-5-фенил-7-метиллтио-8-(N-{ -[N'-(карбоксиметил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3-бутил-3-этил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{ -[N'-((этокси)(метил)фосфорил-метил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-4,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3-бутил-3-этил-5-фенил-7-метилтио-8-{N-[(R)- -(N'-{2-[(гидрокси)(метил)фосфорил]-этил}-карбамоил)-бензил]-карбамоилметокси}-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N'-(2-метилтио-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-{N-[(R)- -(N'-{2-[(метил)(этил)фосфорил]-этил)-карбамоил)-4-гидроксибензил]-карбамоилметокси}-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-{N-[(R)- -(N'-{2-[(метил)(гидрокси)-фосфорил]-этил}-карбамоил)-4-гидроксибензил]-карбамоилметокси}-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[(R)-N'-(2-метилсульфинил-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метокси-8-[N-{(R)- -[N'-(2-сульфоэтил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси]-2,3,4,5-тетрагидро-1,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-((R)-1-карбокси-2-метилтио-этил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-((S)-1-карбокси-2-(R)-гидроксипропил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-((S)-1-карбокси-2-метилпропил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фен ил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-((S)-1-карбоксибутил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-((S)-1-карбоксипропил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-((S)-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-((S)-1-карбокси-2-(R)-гидроксипропил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-(2-сульфоэтил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-((S)-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-4-гидроксибензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-{(R)-1-карбокси-2-метилтиоэтил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-{(S)-1-[N((S)-2-гидрокси-1-карбоксиэтил)-карбамоил]-пропил}-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

1,1-диоксо-3,3-дибутил-5-фенил-7-метилтио-8-(N-{(R)- -[N-((S)-1-карбокси-2-метилпропил)-карбамоил]-бензил}-карбамоилметокси)-2,3,4,5-тетрагидро-1,2,5-бензотиадиазепин;

или его фармацевтически приемлемая соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом данного изобретения предложено комбинационное лечение, при котором вводят эффективное количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы, возможно вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, при одновременном, последовательном или отдельном введении одного или более чем одного из нижеследующих агентов, выбранных из следующего:

ингибитор СЕТР (белка переноса эфиров холестерина), например те, что упомянуты и раскрыты в WO 00/38725, стр.7, строка 22 - стр.10, строка 17, которые инкорпорированы сюда ссылкой на них;

антагонист всасывания холестерина, например азетидиноны, такие как SCH 58235 и те, что описаны в US 5767115, которые инкорпорированы сюда ссылкой на них;

ингибитор МТР (белка микросомального переноса), например те, что в описаны в Science, 282, 751-54,1998, которые инкорпорированы сюда ссылкой на них;

производное никотиновой кислоты, что включает в себя продукты для медленного высвобождения и комбинационные, например никотиновая кислота (ниацин), аципимокс и ницеритрол;

соединение, представляющее собой фитостерол, например станолы;

пробукол;

соединение против ожирения, например орлистат (ЕР 129748) и сибутрамин (GB2184122 и US 4929629);

3-жирная кислота, например Omacor ;

антигипертензивное соединение, например ингибитор ангиотензинконвертирующего энзима (АСЕ), антагонист рецептора ангиотензина II, адренергический блокатор, -адренергический блокатор, -адренергический блокатор, например метопролол, смешанный / -адренергический блокатор, адренергический стимулятор, блокатор каналов для кальция, блокатор АТ-1, салуретическое средство, диуретическое средство или сосудорасширяющее средство;

антагонист или обратный агонист СВ1, например, какой описан в WO 01/70700 и ЕР 65635;

аспирин;

антагонист меланин-концентрирующего гормона (МСН);

ингибитор PDK; или

модуляторы нуклеарных рецепторов, например LXR, FXR, RXR, и ROR ;

или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы, возможно вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, теплокровному животному, такому как человек, нуждающемуся в таком терапевтическом лечении.

Конкретные ингибиторы АСЕ или их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, сольваты таких солей или пролекарственные формы, в том числе активные метаболиты, который можно использовать в комбинации с соединением формулы I, включают в себя нижеследующие соединения без ограничения ими: алацеприл, алатриоприл, кальциевая соль алтиоприла, анковенин, беназеприл, беназеприла гидрохлорид, беназеприлат, бензоилкаптоприл, каптоприл, каптоприл-цистеин, каптоприл-глутатион, церанаприл, цераноприл, церонаприл, цилазаприл, цилазаприлат, делаприл, делаприл-дикислота, эналаприл, эналаприлат, энаприл, эпикаптоприл, фороксимитин, фостеноприл, фосеноприл, натриевая соль фосеноприла, фосиноприл, натриевая соль фосиноприла, фосиноприлат, фосиноприловая кислота, гликоприл, геморфин-4, идраприл, имидаприл, индолаприл, индолаприлат, либензаприл, лизиноприл, лициумин А, лициумин В, миксанприл, моэксиприл, моэксиприлат, мовелтиприл, мурацеин А, мурацеин В, мурацеин С, пентоприл, периндоприл, периндоприлат, пивалоприл, пивоприл, квинаприл, квинаприла гидрохлорид, квинаприлат, рамиприл, рамиприлат, спираприл, спираприла гидрохлорид, спираприлат, спироприл, спироприла гидрохлорид, темокаприл, темокаприла гидрохлорид, тепротил, трандолаприл, трандолаприлат, утибаприл, забициприл, забициприлат, зофеноприл и зофеноприлат. Предпочтительными ингибиторами АСЕ для применения в настоящем изобретении являются рамиприл, рамиприлат, лизиноприл, эналаприл и эналаприлат.Более предпочтительными ингибиторами АСЕ для применения в настоящем изобретении являются рамиприл и рамиприлат.

Предпочтительные антагонисты ангиотензина II, их фармацевтически приемлемые соли, сольваты, сольваты таких солей или пролекарственные формы для применения в комбинации с соединением формулы I включают в себя, но без ограничения ими, соединения: кандесартан, кандесартана цилексетил, лозартан, валсартан, ирбесартан, тасосартан, телмисартан и эпросартан. Особенно предпочтительными антагонистами ангиотензина II или их фармацевтически приемлемыми производными для применения в настоящем изобретении являются кандесартан и кандесартана цилексетил.

Поэтому в дополнительном отличии этого изобретения предложен способ лечения диабета типа 2 и ассоциированных с ним осложнений у теплокровного животного, такого как человек, нуждающегося в таком лечении, при котором вышеуказанному животному вводят эффективное количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы одновременным, последовательным или раздельным введением с эффективным количеством одного из других соединений, описанных в этой секции о комбинациях, или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы.

Поэтому в дополнительном аспекте этого изобретения предложен способ лечения гиперлипидемических состояний у теплокровного животного, такого как человек, нуждающегося в таком лечении, при котором вышеуказанному животному вводят эффективное количество соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы одновременным, последовательным или раздельным введением с эффективным количеством одного из других соединений, описанных в этой секции о комбинациях, или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы.

В соответствии с дополнительным аспектом этого изобретения предложена фармацевтическая композиция, которая содержит соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму и одно из других соединений, описанных в этой секции о комбинациях, или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму в ассоциации с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем.

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения предложен набор, содержащий соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму и одно из других соединений, описанных в этой секции о комбинациях, или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму.

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения предложен набор, содержащий:

a) соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму в первой единичной стандартной лекарственной форме;

b) одно из других соединений, описанных в этой секции о комбинациях, или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму во второй единичной стандартной лекарственной форме; и

c) контейнерное средство для вмещения вышеуказанных первой и второй лекарственных форм.

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения предложен набор содержащий:

а) соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем в первой единичной стандартной лекарственной форме;

b) одно из других соединений, описанных в этой секции о комбинациях, или его фармацевтически приемлемую соль, сольват, сольват такой соли или пролекарственную форму во второй единичной стандартной лекарственной форме; и

c) контейнерное средство для вмещения вышеуказанных первой и второй лекарственных форм.

В соответствии с другим отличием этого изобретения предложено применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы и одного из других соединений, описанных в этой секции о комбинациях, или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы в изготовлении медикамента для применения в лечении метаболического синдрома или диабета типа 2 и ассоциированных осложнений у теплокровного животного, такого как человек.

В соответствии с другим отличием этого изобретения предложено применение соединения формулы 1 или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы и одного из других соединений, описанных в этой секции о комбинациях, или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы в изготовлении медикамента для применения в лечении гиперлипидемических состояний у теплокровного животного, такого как человек.

В соответствии с дополнительным аспектом данного изобретения предложено комбинационное лечение, при котором вводят эффективное количество соединения формулы 1 или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы, возможно вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, при одновременном, последовательном или раздельном введении эффективного количества одного из других соединений, описанных в этой секции о комбинациях, или его фармацевтически приемлемой соли, сольвата, сольвата такой соли или пролекарственной формы, возможно вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем или носителем, теплокровному животному, такому как человек, нуждающемуся в таком терапевтическом лечении.

Рабочие примеры

Осуществляли измерения ¹H-ЯМР и ¹³С-ЯМР на спектрометрах Varian Mercury 300 или Varian UNITY plus 400, 500 или 600, работающих для ¹H на частотах 300, 400, 500 и 600 мГц, соответственно, и для ¹³С на частотах 75, 100, 125 и 150 мГц, соответственно. Делали измерения по дельта-шкале (5).

Если не указано иначе, химические сдвиги даны в м.д. с растворителем в качестве внутреннего стандарта.

Сокращения
СРИ	синдром резистентности к инсулину
Тех	тонкослойная хроматография
ГОБТ	1-гидроксибензотриазола гидрат
ДИБАГ	диизобутилалюминия гидрид
ДМСО	диметилсульфоксид
EtOAc	этилацетат
ДМФ	N,N-диметилформамид
ТГФ	тетрагидрофуран
ВЭЖХ	высокоэффективная жидкостная хроматография
MeCN	ацетонитрил
ТФУ	трифторуксусная кислота
Pd/C	палладий на углероде
ГАТУ	гексафторфосфат O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония
ДХМ	Дихлорметан
ТБТУ	тетрафторборатО-(бензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония
ДИПЭА	N,N-диизопропилэтиламин
ДМАП	4-диметиламинопиридин
Трисамин	Трис(гидроксиметил)аминометан

ISOLUTE® FLASH Si представляет собой колонку с кремнеземом, подходящую для хроматографии.

Боргидрид на полимерной подложке представляет собой боргидрид на Амберлите IRA-400 от Aldrich.

Жх-мс	жидкостная хроматография/масс-спеюгрометрия
кг	комнатная температура
t	триплет
s	синглет
d	дублет
q	квартет
quint	квинтет
m	мультиплет
br	широкий
Bs dm	широкий синглет дублет мультиплетов
bt	широкий триплет
dd	дублет дублетов

Пример 1

a) трет-Бутил-[4-(2-гидроксиэтил)-фенокси]-ацетат

Смесь 4-(2-гидроксиэтил)-фенола (3,8 мл, 25,834 ммоль), растворенного в ацетонитриле (25 мл), карбоната калия (7,085 г, 51,267 ммоль) и трет-бутилбромацетата (5,000 г, 25,834 ммоль) кипятили при дефлегмации 16 часов. Растворитель выпаривали под пониженным давлением. Остаток растворяли в EtOAc и промывали рассолом и водой, сушили сульфатом магния и упаривали под пониженным давлением с получением желаемого продукта (6,00 г, выход 92,8%).

¹H-ЯМР (400 мГц, CDCl₃): 1.52 (s, 9Н), 2.98 (t, 2H), 3.46 (t, 2H), 4.92 (s, 2H), 6.89-6.97 (m, 4H).

b) трет-Бутил-(4-{2-[(метилсульфонил)окси]этил}фенокси)-ацетат

Трет-бутил-[4-(2-гидроксиэтил)фенокси]-ацетат (6,000 г, 23,781 ммоль) и триэтиламин (9,9 мл, 71,341 ммоль) растворяли в ДХМ. Эту смесь охлаждали до -10°С и к этой смеси добавляли каплями метансульфонилхлорид (2,8 мл, 35,671 ммоль). Этой реакционной смеси давали достичь комнатной температуры и перемешивали 16 часов. Эту смесь разбавляли дихлорметилом. Органический слой промывали водой, рассолом и 0,3 М гидросульфатом калия, сушили сульфатом магния и упаривали под пониженным давлением. Получали 7,5 г светло-желтых кристаллов (выход 95,5%).

¹ H-ЯМР (400 мГц, CDCl₃): 1.52 (s, 9Н), 2.98 (t, 2H), 3.10 (s, 3H), 3.46 (t, 2H), 4.92 (s, 2H), 6.89-6.97 (m, 4H).

c) Метил-2-{2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этокси}-бензоат

Растворяли метилсалицилат (2,7 мл, 21,187 ммоль) в ацетонитриле и добавляли карбонат калия (5,856 г, 42,373 ммоль). Эту смесь охлаждали до -10°С, затем добавляли к ней трет-бутил-(4-{2-[(метилсульфонил)-окси]-этил}-фенокси)-ацетат. Эту смесь кипятили при дефлегмации 16 часов и затем растворитель выпаривали под пониженным давлением. Остаток растворяли в EtOAc, промывали водой и рассолом, затем органический слой сушили сульфатом магния и растворитель удаляли упариванием. Неочищенный материал очищали флэш-хроматографией (силикагель 60; 0,004-0,063 мм) при использовании смеси EtOAc:толуол 50:50 в качестве элюанта. Фракции, который содержали желаемый продукт, объединяли в пул, растворитель упаривали. Это давало 5,0 г чистого продукта (выход 61,1%).

¹H-ЯМР (400 мГц, CDCl₃); 1.48 (s, 9Н), 3.08 (s, 3H), 3.87 (t, 2H), 4.18 (t, 2H), 4.49 (s, 2H), 6.84 (d, 2H), 6.90-6.98 (m, 2H), 7.20-7.26 (m, 2H), 7.38-7.43 (m.1H), 7.7 (dd,1H).

d) (4-{2-[2-(метоксикарбонил)-фенокси]-этил}-фенокси)-уксусная кислота

Растворяли метил-2-{2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этокси}-бензоат (0,400 г, 1,0351 ммоль) в ДХМ и добавляли трифторуксусную кислоту (0,8 мл, 8,281 ммоль). Эту смесь перемешивали при комнатной температуре 3 часа. Растворитель выпаривали с получением 325 мг белого порошка.

¹H-ЯМР (600 мГц, CDCl₃); 3.08 (t, 2H), 3.86 (s. 3H), 4.18 (t, 2H), 4.64 (s, 2H), 6.84-6.96 (m, 4H), 7.23 (d, 2H), 7.37-7.42 (m, 1H), 7.75 (dd, 1H).

e) Метил-2-[2-(4-[2-[этил(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензоат

(4-{2-[2-(Метоксикарбонил)-фенокси]-этил}-фенокси)-уксусную кислоту (0,200 мг, 0,605 ммоль) растворяли в диметилформамиде и охлаждали на ледяной бане. Добавляли N-(2-фторбензил)-этанамин (0,102 г, 0,666 ммоль), ТБТУ (0,214 г, 0,666 ммоль) и ДИПЭА (0,22 мл, 1,271 ммоль). Эту реакционную смесь перемешивали 16 часов при комнатной температуре. Добавляли EtOAc и промывали органическую фазу двумя порциями по 20 мл Na₂СОз (насыщенный). Сушили органический слой сульфатом магния и удаляли растворитель упариванием. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (начинали со смеси ацетонитрил/буфер 60/40 и затем повышали концентрацию ацетонитрила до 100% ацетонитрила за 25 минут; буфер представлял собой смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 М); колонки KR-100-7-C8, 50*500; скорость тока 80 мл/мин). После сублимационной сушки получали 145 мг желаемого продукта (выход 71,1%).

¹H-ЯМР (400 мГц, CD₃СО) (ротамеры); 1.08, 1.17 (t, t, 3H), 2.96 (s, 3H), 3.07 (m, 2H), 3.31, 3.36 (m. 2H), 4.21 (m, 2H), 4.85 (s, 2H), 4.56-4.82 (m, 2H), 6.18 (d, 1H), 6.88-7.06 (m, 3H), 7.18 -7.35 (m, 6H), 7.42 (m, 1H), 7.70 (d, 1H).

f) 2-[2-(4-{2-[этил(2-фторбензил)-амино1-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота

Растворяли метил-2-[2-(4-{2-[этил-(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензоат (0,200 г, 0,115 ммоль) в 3 мл тетрагидрофурана в виале синтезатора Смита и затем добавляли к виале 1,5 мл воды и гидроксид лития (0,032 г, 1,335 ммоль). Виалу закрывали колпачком и помещали в микроволновую печь (синтезатор Смита). Затем нагревали реакционную смесь до 150°С в течение 6 минут. В соответствии с ЖХ-МС, реакция была завершена. Растворитель выпаривали. Остаток растворяли в диэтиловом эфире (30 мл) и промывали гидрокарбонатом натрия (насыщенный) (2°20 мл). Щелочной водный слой подкисляли до рН 1 двухмолярной HCl. Водный слой экстрагировали тремя порциями по 20 мл ДХМ, которые объединяли, сушили и упаривали с получением 160 мг чистого желаемого продукта.

¹H-ЯМР (400 мГц, CD₃СО) (ротамеры); 1.07, 1.15 (t, t, 3H), 3.10 (m, 2H), 3.30, 3.36 (m, m, 2H), 4.21 (m, 2H), 4.55-4.67 (m, 2H), 4.90 (s, 2H), 6.20 (d, 1H), 6.87-7.06 (m, 3H), 7.18-7.35 (m, 6H), 7.40 (m, 1H), 7.70 (d, 1H).

Пример 2

а)2-Бром-N-(2,4-дисрторбензил)-N-гептилацетамид

N-(2,4-дифторбензил)-N-гептиламин (2,004 г, 8,304 ммоль) растворяли в ДХМ (30 мл). Затем охлаждали это в ледяной бане. Добавляли триэтиламин (1,092 г, 10,796 ммоль) и затем добавляли каплями бромацетилхлорид (1,438 г, 9,135 ммоль). Эту смесь перемешивали 2 часа (ледяная баня). Затем ее промывали водой (с дополнительной 1%-ой соляной кислотой, рН˜3), водой и рассолом и сушили (сульфат магния) и упаривали. Неочищенный продукт в виде масла растворяли в ДХМ, затем наносили на колонку (ISOLUTE®SI 5 г/25 мл) и элюировали дополнительным ДХМ. Получали продукт в виде масла: 2,412 г, выход 80%.

¹H-ЯМР (ротамер. 500 мГц, CDCl₃): 0.88-0.93 (m, 3Н), 1.27-1.34 (m, 8H), 1.52-1.68 (m, 2H), 3.28-3.35 (m. 2H), 3.90-4.15 (m, 2H), 4.61, 4.63 (s, s, 2H), 6.81-6.94 (m, 2H), 7.15-7.20, 7.34-7.39 (m, 1H).

b) N-(2,4-дифторбензил)-N-гептил-2-[4-(2-гидроксиэтил)-2-метоксиФенокси]-ацетамид

Смешивали 2-бром-N-(2,4-дифторбензил)-N-гептилацетамид (135 мг, 0,373 ммоль), гомованиллиловый спирт (63 мг, 0,373 ммоль) и безводный карбонат калия (77 мг, 0,559 ммоль) в ацетонитриле (10 мл). Эту смесь нагревали с дефлегмацией 4 часа и затем упаривали досуха. Остаток (с дополнительным ДХМ, 1 млх2) наносили на колонку (ISOLUTE® SI, 1 г/6 мл). Его элюировали дихлорметилом и затем смесью МеОН/ДХМ (0,5:99,5, затем 1:99). Фракции продукта объединяли и упаривали. Получали продукт в виде масла: 132 мг, выход 79%.

¹H-ЯМР (ротамер, 400 мГц, CDCl ₃): 0.82-0.87 (m, 3Н), 1.17-1.28 (m, 8H), 1.43-1.68 (m, 2H), 2.75-2.80 (m, 2H), 3.24-3.32 (m, 2H), 3.73-3.84 (m, 5H), 4.58, 4.66 (s, s, 2H), 4.74, 4.76 (s, s, 2H), 6.67-6.86 (m, 5H), 7.08-7.14, 7.23-7.29 (m, 1H).

c) 2-(4-{2-[(2,4-Дифторбензил)(гептил)-амино-2-оксоэтокси)-3-метоксифенил)-этил1-метансульфонат

N-(2,4-дифторбензил)-N-гептил-2-[4-(2-гидроксиэтил)-2-метоксифенокси]-ацетамид (А) (132 мг, 0,294 ммоль) растворяли в ДХМ (10 мл). Охлаждали это на ледяной бане. Добавляли триэтиламин (0,05 мл, 0,352 ммоль) и затем каплями добавляли метансульфонилхлорид (37 мг, 0,323 ммоль). Охладительную баню удаляли через 30 минут. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. ЖХ-МС показала, что примерно 50% А не провзаимодействовали. Охлаждали смесь на ледяной бане и добавляли 0,05 мл триэтиламина и далее 0,025 мл метансульфонилхлорида. После добавления охладительную баню удаляли и смесь перемешивали еще 5 часов. Затем ее промывали водой (х2) и рассолом, сушили (сульфат магния) и упаривали. Оставляли продукт в виде масла (138 мг) и использовали его в следующей стадии без дополнительной очистки.

d) Метил-2-[2-(4-{2-[(2,4-дифторбензил)(гептил)-амино]-2-оксоэтокси]-3-метоксифенил)-этокси1-бензоат

2-(4-{2-[(2,4-Дифторбензил)(гептил)-амино]-2-оксоэтокси}-3-метоксифенил)-этил]-метансульфонат (138 мг, 0,262 ммоль) растворяли в ацетонитриле (10 мл). Добавляли метиловый эфир 2-гидроксибензойной кислоты (40 мг, 0,262 ммоль) и затем безводный карбонат калия (54 мг, 0,392 ммоль). Эту смесь нагревали с дефлегмацией в течение ночи и затем упаривали досуха. Добавляли воду (10 мл) и этилацетат (10 мл) и разделяли две фазы. Органическую фазу промывали водой и рассолом, сушили (магний сульфат) и упаривали. Хроматография остатка на колонке (ISOLUTE® SI, 2 г/6 мл) при использовании ДХМ, МеОН/ДХМ (1:99) в качестве элюанта давала 78 мг желаемого продукта, выход 45% (две стадии).

¹H-ЯМР (ротамер, 500 мГц, CDCl₂): 0.87-0.91 (m, 3H), 1.22-1.32 (m, 8H), 1.48-1.63 (m, 2H), 3.09-3.14 (m, 2H), 3.28-3.35 (m, 2H), 3.80, 3.89 (s, s, 3H), 3.89 (s, 3H), 4.21-4.25 (m, 2H), 4.62, 4.71 (s, s, 2H), 4.79, 4.81 (s, s, 2H), 6.77-7.01 (m, 7H), 7.28-7.33 (m, 1H), 7.13-7.18, 7.28-7.33 (m, m, 1H), 7.45 (t, 1H), 7.81 (d, 1H).

e) 2-[2-(4-(2-[(2,4-Дифторбензил)(гептил)-амино]-2-оксоэтокси}-3-метоксифенил)-этокси1-бензойная кислота

Метил-2-[2-(4-{2-[(2,4-дифторбензил)(гептил)-амино]-2-оксоэтокси}-3-метоксифенил)-этокси]-бензоат (74 мг, 0,127 ммоль), растворенный в ТГФ (2 мл), смешивали с гидроксидом лития (6,1 мг, 0,254 ммоль), растворенным в воде (1 мл). Эту смесь облучали в микроволновой печи (синтезатор Смита) при 150°С в течение 8 минут. ЖХ-МС показала, что взаимодействие было неполным. Его продолжали в печи дополнительно 10 минут. ЖХ-МС показала почти отсутствие изменений. Добавляли еще 3 мг гидроксида лития и после этого держали в печи при 150°С в течение 8 минут. ЖХ-МС показала, что все было как и прежде. Добавляли еще 3 мг гидроксида лития и 1 мл воды. Получившаяся смесь была в печи при 150°С 10 минут, и ЖХ-МС показала, что взаимодействие было полным. Реакционную смесь упаривали для удаления тетрагидрофурана. Остаток подкисляли 1%-ой соляной кислотой, рН˜5, и экстрагировали этилацетатом (10 мл). Экстракты сушили (сульфат магния) и упаривали. Хроматография остатка на колонке (ISOLUTE® Sl, 1 г/6 мл) при использовании ДХМ и затем МеОН/ДХМ (1:99) в качестве элюанта дала 60 мг желаемого продукта, выход 83%.

¹ H-ЯМР (ротамер, 400 мГц, CDCl₃ ): 0.82-0.87 (m, 3H), 1.18-1.28 (m, 8H), 1.43-1.61 (m, 2H), 3.10-3.15 (m, 2H), 3.24-3.31 (m, 2H), 3.77, 3.85 (s, s, 3H), 4.39-4.44 (m, 2H), 4.59, 4.66 (s. s, 2H), 4.77, 4.78 (s, s, 2H), 6.72-6.91 (m, 5H), 7.01 (d, 1H), 7.09 (t, 1H), 7.10-7.17, 7.26-7.32 (m, m, 1H), 7.51 (t, 1H), 8.13 (d, 1H).

¹³С-ЯМР (ротамеры, 75 мГц, CDCl₃): 5 14.07, 22.55, 26.79, 27.02, 28.57, 28.93, 31.70, 35.18, 41.30, 41.34, 44.02, 45.89, 46.99, 55.71, 55.82, 68.19, 68.94, 70.66, 103.38(t), 103.88(t), 111.35(d), 111.39(d), 112.32, 112.41, 112.46, 114.76. 117.64, 119.60(dd), 120.07(dd), 120.53, 122.06, 129.50(dd), 130.54, 130.59, 131.55(dd), 133.60, 134.78, 146.26, 146.39, 149.67, 157.10, 161.60(dd), 160.68(dd), 161.97(dd), 162.24(dd), 165.12, 167.75, 167.93.

Пример 3

а) N-(4-хлорбензил)-ацетамид

Растворяли уксусную кислоту (1,321 г, 22,000 ммоль) в диметилформамиде (10 мл), добавляли 1-(4-хлорфенил)-метанамин (2,804 г, 19,800 ммоль) и охлаждали эту смесь до 0°С. Добавляли тетрафторборат N-[(1H-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (7,770 г, 24,200 ммоль) и N-этил-N,N-диизопропиламин (5,971 г, 46,200 ммоль). Этот раствор перемешивали два часа при комнатной температуре. Добавляли EtOAc (20 мл) и промывали органическую фазу карбонатом натрия (3 × 20 мл, водный) и соляной кислотой (0,5 M, 2×, 10 мл). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием. Остаток очищали препаративной ВЭЖХ (исходная подвижная фаза представляла собой изократическую смесь ацетонитрил/буфер 60/40, затем концентрацию ацетонитрила увеличивали до 100%, буфер представлял собой смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 M); колонки KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм; скорость тока 40 мл/мин). Продукт-содержащие фракции объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием. Добавляли EtOAc (10 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола и сушили (сульфат магния) и удаляли растворитель упариванием, что давало 2,337 г N-(4-хлорбензил)-ацетамида (выход 57,8%).

¹H-ЯМР (500 мГц, CDCl₃): 1.96 (s, 3H), 4.31 (d, 2H), 6.46 (bs, 1H), 7.16 (d, 2H), 7.25 (d, 2H).

b) N-(4-хлорбензил)-N-этиламин

N-(4-хлорбензил)-ацетамид (2,337 г, 12,726 ммоль) растворяли в ТГФ (100 мл) и охлаждали до нуля градусов под атмосферой аргона. Добавляли комплекс (метилтио)-метана с бораном (1:1) (2,417 г, 31,815 ммоль) и нагревали эту смесь при дефлегмации в течение ночи при КТ. Осторожно добавляли HCI (15 мл, 10%) и перемешивали в течение ночи. Растворитель удаляли упариванием. Добавляли диэтиловый эфир (20 мл) и экстрагировали продукт в водную фазу карбонатом калия (3×15 мл). Водную фазу подкисляли соляной кислотой (10 мл, 10%) и продукт экстрагировали в органическую фазу этилацетатом (3×15 мл). Органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,938 г N-(4-хлорбензил)-N-этиламина (выход 43,4%).

¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃): 1.11 (t, 3H), 2.65 (q, 2H), 3.74 (s, 2H), 7.23-7.28 (m, 4H).

c) Метил-2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоат

Растворяли трет-бутил-(4-{2-[(метилсульфонил)-окси]-этил}-фенокси)-ацетат (5,454 г, 17,347 ммоль) в ацетонитриле (100 мл), добавляли 2-меркаптобензоат (3,502 г, 20,816 ммоль) и карбонат калия (4,795 г, 34,694 ммоль). Раствор перемешивали 10 часов при 60°С. Добавляли EtOAc (40 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола (2×40 мл, водный). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 6,931 г метил-2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоата. Этот материал использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

d) [4-(2-{[2-(Метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусная кислота

Метил-2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоат (4,630 г, 11,502 ммоль) собирали в ДХМ (50 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (44,40 г, 389,405 ммоль) при КТ в течение 4 часов. Эту смесь упаривали и азеотропировали с толуолом. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (исходной подвижной фазой была изократическая смесь ацетонитрил/буфер 60/40, затем концентрацию ацетонитрила увеличивали до 100%; буфером была смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 M); колонка KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм, скорость тока 40 мл/мин). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием.

Добавляли EtOAc (10 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола и сушили (сульфат магния). Растворитель удаляли упариванием с получением 3,825 г [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусной кислоты (выход в двух стадиях 63,9% в сумме).

¹ H-ЯМР (500 мГц, CDCl₃): 2.93-2.98 (m, 2H), 3.12-3.17 (m, 2H), 3.92 (s, 3H), 4.67 (s, 2H), 6.88 (d, 2H), 7.13-7.21 (m, 3H), 7.33 (d, 1H), 7.41-7.46 (m, 1H), 7.96 (dd, 1H).

е) Метил-2-{[2-4-(2-К4-хлорбензил)(этил)-амино1-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензоат

Растворяли [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусную кислоту (0,200 г, 0,577 ммоль) в диметилформамиде (10 мл), добавляли N-(4-хлорбензил)-N-этиламин (0,108 г, 0,635 ммоль) и охлаждали эту смесь до 0°С. Добавляли тетрафторборат N-[(1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (0,204 г, 0,635 ммоль) и N-этил-N,N-диизопропиламин (0,157 г., 1,212 ммоль). Этот раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли воду (100 мл) и экстрагировали водную фазу диэтиловым эфиром (3×20 мл). Органическую фазу промывали карбонатом натрия (3×20 мл, водный) и соляной кислотой (0,5 M, 2×, 10 мл). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием. Остаток очищали флэш-хроматографией (начинали с изократической смеси гептан/EtOAc 30/70 и затем увеличивали концентрацию EtOAc до 100%; силикагель 60; 0,004-0,063 мм). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, растворитель удаляли упариванием с получением 0,085 г метил-2-{[2-(4-{2-[(4-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензоата (выход 29,6%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 300 мГц, COCl ₃): 1.09-1.21 (m, 3H), 2.91-2.99 (m, 2H), 3.11-3.18 (m, 2H), 3.32-3.43 (m, 2H), 3.92 (s, 3H), 4.57-4.75 (m, 4H), 6.78, 6.92 (d, d, 2H), 7.12-7.46 (m, 9H), 7.96 (d, 1H).

f) 2-{[2-(4-{2-[(4-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил]-этил]-тио}-бензойная кислота

Растворяли метил-2-{[2-(4-{2-[(4-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензоат (0,085 г, 0,170 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода (1/1, 4 мл) и добавляли гидроксид лития (0,008 г, 0,341 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (5 мин, 150 градусов). Растворитель удаляли упариванием и затем добавляли соляную кислоту (2 мл, 1 М). Водную фазу экстрагировали двумя порциями этилацетата (20 мл). Объединенные органические фазы сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием, что давало 0,073 г 2-{[2-(4-{2-[(4-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил]-этил]-тио}-бензойной кислоты (выход 88,4%) в виде масла, которое затвердевало при охлаждении и стоянии.

¹H-ЯМР (ротамеры, 400 мГц, CDCl₃): 1.09-1.20 (m, 3H), 2.91-2.98 (m, 2H), 3.11-3.17(m, 2H), 3.33-3.42 (m, 2H), 4.58-4.77 (m, 4H), 6.79, 6.92 (d, d, 2H), 7.11-7.49 (m, 9H), 8.10 (d, 1H).

¹³С-ЯМР (ротамеры, 100 мГц, CDCl₃): 12.23, 13.77, 33.70, 33.82, 41.09, 41.30, 47.42, 49.64, 67.37, 67.91, 114.69, 114.81, 123.97-135.58 (комплексный мультиплет), 142.22, 156.45, 156.57, 168.20, 170.63.

Таким же образом получали два следующих Примера.

Пример 4

2-[2-(4-{2-[(4-Хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота.

¹H ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl ₃) d 1.09 и 1 18 (t, H), 3.12-3.17 (m, 2H), 3.32-3.41 (m, 2H), 4.40-4.44 (m, 2H), 4.56 и 4.57 (s, 2H), 4.66 и 4.74 (s, 2H), 6.81 и 6.94 (d, 2H), 7.01 (t, 1H), 7.10-7.20 (m, 5H), 7.24 (d, 2H), 7.30 (d, 1H), 7.53 (t, 1H), 8.15 (d, H).

Пример 5

2-[2-(4-{2-[Этил(4-трифторметилбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойная кислота.

¹H ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl ₃) d 1.11 и 1.20 (t, 3H), 3.13 и 3.16 (t, 2H), 3.36-3.43 (m, 2H), 4.41 и 4.43 (t, 2H) 4.65 и 4.67 (s, 2H), 4.68 и 4 77 (s, 2H), 6.78 и 6.95 (d, 2H), 7.01 (t, 1H), 7.10-7.21 (m, 3H), 7.30-7.33 (m, 2H), 7.53 (d, 2H), 7.57 (t, 1H), 8.15 (d,1H).

Пример 6

а) Растворяли уксусную кислоту (1,321 г, 22,000 ммоль) в ДМФ (10 мл), добавляли 1-[4-(трифторметил)-фенил]-метанамин (3,468 г, 19,800 ммоль) и охлаждали эту смесь до 0°С. Добавляли тетрафторборат N-[(1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (7,770 г, 24,200 ммоль) и N-этил-N-диизопропиламин (5,971 г, 46,200 ммоль). Этот раствор перемешивали два часа при комнатной температуре. Добавляли EtOAc (20 мл) и промывали органическую фазу карбонатом натрия (3 × 20 мл, водный) и соляной кислотой (0,5 М, 2×, 10 мл). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (начинали с изократической смеси ацетонитрил/буфер 60/40 и затем увеличивали концентрацию ацетонитрила до 100%; буфером была смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 М); колонка KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм; скорость тока 40 мл/мин). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием. Добавляли EtOAc (10 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола и сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием, что давало 3,085 г N-[4-(трифторметил)-бензил]-ацетамида (выход 64,6%).

¹H-ЯМР (500 МГц, CDCl₃ ): 2.0 (s, 3Н), 4.42 (d, 2H), 6.58 (bs, 1H), 7.35 (d, 2H), 7.55 (d.2H).

b) N-[4-(трифторметил)-бензил]-ацетамид (3,085 г, 14,204 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (100 мл) и охлаждали до нуля градусов под атмосферой аргона. Добавляли комплекс (метилтио)метана с бораном (1:1) (2,698 г, 35,511 ммоль) и держали эту смесь при дефлегмации в течение ночи при КТ. Осторожно добавляли HCI (15 мл, 10%) и перемешивали в течение ночи. Растворитель удаляли упариванием. Добавляли диэтиловый эфир (20 мл) и экстрагировали продукт в водную фазу карбонатом калия (3×15 мл), водную фазу подкисляли соляной кислотой (10 мл, 10%) и продукт экстрагировали в органическую фазу этилацетатом (3×15 мл). Органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,809 г N-[4-(трифторметил)-бензил]-этанамина (выход 28%).

¹H-ЯМР (500 мГц, CDCl₃): 1,05 (t, 3Н), 1,3 (s, 1H), 2,62 (q, 2H), 3,78 (s, 2H), 7,38 (d, 2H), 7,3 (d, 2H)

c) Растворяли трет-бутил-(4-{2-[(метилсульфонил)-окси]-этил)-фенокси)-ацетат (5,454 г, 17,347 ммоль) в ацетонитриле (100 мл), добавляли метил-2-меркаптобензоат (3,502 г, 20,816 ммоль) и карбонат калия (4,795 г, 34,694 ммоль). Этот раствор перемешивали 10 часов при 60°С. Добавляли EtOAc (40 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола (2×40 мл, водный).

Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 6,931 г неочищенного метил-2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоата. Неочищенный продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

d) Брали метил 2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоат (4,630 г, 11,502 ммоль) в ДХМ (50 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (44,40 г, 389,405 ммоль) при КТ в течение 4 часов. Эту смесь выпаривали и азеотропировали с толуолом. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (начинали с изократической смеси ацетонитрил/буфер 60/40 и затем увеличивали концентрацию ацетонитрила до 100%; буфером была смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 М); колонка KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм; скорость тока 40 мл/мин). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием. Добавляли EtOAc (10 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола и сушили (сульфат магния). Растворитель удаляли упариванием с получением 3,825 г [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусной кислоты (выход в двух стадиях 63,9% в сумме).

¹ H-ЯМР (500 мГц, CDCl₃): 2.82 (t, 2H), 3.15 (t, 2H), 3.82 (s, 3H), 4.35 (s, 2H), 6.78 (d, 2H), 7.18 (d, 2H), 7,23 (t, 1H), 7.51 (d, 1H), 7.55 (t, 1H), 7.85 (d, 1H).

e) Растворяли [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусную кислоту (0,200 г, 0,577 ммоль) в ДМФ (10 мл), добавляли N-[4-(трифторметил)-бензил]-этанамин (0,129 г, 0,635 ммоль) и охлаждали эту смесь до 0°С. Добавляли тетрафторборат N-[(1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (0,204 г, 0,635 ммоль) и N-этил-N,N-диизопропиламин (0,157 г, 1,212 ммоль). Этот раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли воду (100 мл) и экстрагировали водную фазу диэтиловым эфиром (3×20 мл). Органическую фазу промывали карбонатом натрия (3×20 мл, водный) и соляной кислотой (0,5 М, 2×, 10 мл). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией (начинали с изократической смеси гептан/Еt0Ас 30/70 и затем увеличивали концентрацию EtOAc до 100% (силикагель 60; 0,004-0,063 мм). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул и растворитель удаляли упариванием с получением 0,085 г метил-2-({2-[4-(2-{этил-[4-(трифторметил)-бензил]-амино}-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоата (выход 27,7%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl ₃): 1.1-1.23 (bm, 3H), 2.95 (q, 2H), 3.15 (q, 2H), 3.42 (m, 2H), 3.9 (s, 3H), 4.7-4.82 (bm, 4H), 6.75-6.95 (m, 2H), 7.1-7.5 (m, 9H), 7.97 (d,1H).

f) Растворяли метил-2-({2-[4-(2-{этил-[4-(трифторметил)-бензил]-амино}-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоат (0,085 г, 0,160 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода (1/1, 4 мл), затем добавляли гидроксид лития (0,008 г, 0,320 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (5 мин, 150 градусов). Проводили обработку удалением растворителя упариванием и добавлением HCl (2 мл, 1 M). Водную фазу экстрагировали двумя порциями EtOAc (20 мл), органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием, что давало 0,07773 г (2-({2-[4-(2-{этил[4-(трифторметил)-бензил]-амино}-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензойной кислоты (выход 93,0%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 400 мГц, CDCl₃): 1.02-1.25 (bm, 3H), 2.95 (q, 2H), 3.15 (q, 2H), 3.38 (m, 2H), 4.60-4.82 (bin, 4H), 6.75-6.95 (m, 2H), 7.1-7.5 (m, 9H), 7.97 (d, 1H).

Пример 7

Растворяли метил-2-{2-[4-(2-{бутил-[2-фтор-4-(трифторметил)-бензил]-амино}-2-оксоэтокси)-фенил]-этокси}-бензоат (0,230 г, 0,410 ммоль) в смеси тетрагидрофуран/вода (1/1, 4 мл). Добавляли гидроксид лития (0,015 г, 0,617 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (14 мин, 150 градусов). Проводили обработку удалением растворителя упариванием и добавлением HCl (2 мл, 1 M). Водную фазу экстрагировали двумя порциями EtOAc (20 мл). Органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,212 г (2-{2-[4-(2-{бутил-[2-фтор-4-(трифторметил)-бензил]-амино}-2-оксоэтокси)-фенил]-этокси}-бензойной кислоты (выход 94,5%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl₃): 0.82-1.0 (bm, 3H). 1.2-1.4 (bm, 2H), 1.65-1.7 (bm, 2H), 3.13 (m, 2H), 3.32 (m, 2H), 4.4 (m, 2H), 4.63-4.8 (M, 4H), 6.7-7.6 (bm, 10H),8.1(d.1H).

Пример 8

a) Растворяли (4-{2-[2-(метоксикарбонил)-фенокси]-этил}-фенокси)-уксусную кислоту (0,150 г, 0,454 ммоль) в диметилформамиде (10 мл), добавляли N-(2,4-дифторбензил)-N-пропиламин (0,084 г, 0,454 ммоль) и охлаждали эту смесь до 0°С. Добавляли тетрафторборат N-[(1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (0,160 г, 0,499 ммоль) и N-этил-N,N-диизопропиламин (0,123 г, 0,954 ммоль). Этот раствор перемешивали два часа при комнатной температуре. Добавляли EtOAc (20 мл) и промывали органическую фазу карбонатом натрия (3×20 мл, водный) и соляной кислотой (0,5 М, 2×, 10 мл). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,220 г метил-2-[2-(4-{2-[(2,4-дифторбензил)(пропил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензоата (выход 97,4%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl ₃): 0.8-1.0 (bm, 3H), 1.45-1.7 (bm, 2H) 3.1 (m, 2H), 3.28 (bm, 2H), 3.9 (s, 3H), 4.2 (q, 2H), 4.6-4.75 (М, 4Н), 6.7-7.0 (bm, 6H), 7.1-7.3 (bm, 3H), 7.4 (m.1H), 7.78 (d.1H).

b) Растворяли метил-2-[2-(4-{2-[(2,4-дифторбензил)(пропил)-амино]-2-оксоэтокси)-фенил)-этокси]-бензоат (0,22 г, 0,442 ммоль) в смеси тетрагидрофуран/вода (1/1, 4 мл). Добавляли гидроксид лития (0,021 г, 0,884 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (14 минут, 150 градусов). Проводили обработку удалением растворителя упариванием и добавлением HCl (2 мл, 1 М). Водную фазу экстрагировали двумя порциями EtOAc (20 мл), органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,180 г 2-[2-(4-{2-[(2,4-дифторбензил)(пропил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойной кислоты (выход 84,2%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, COCl₃): 0.8-1.0 (bm. 3H), 1.45-1.7 (bm, 2H), 3.14 (m, 2H), 3.28 (bm, 2H), 4.4 (q, 2H), 4.62 (s, 2H), 4.75 (s, 2H), 6.7-7.35 (bm, 9H), 7.52 (t,1H), 8.12 (d.1H).

Пример 9

а) Растворяли (4-{2-[2-(метоксикарбонил)-фенокси]-этил}-фенокси)-уксусную кислоту (0,150 г, 0,454 ммоль) в ДМФ (10 мл), добавляли N-бензил-N-этиламин (0,061 г, 0,454 ммоль) и охлаждали эту смесь до 0°С. Добавляли тетрафторборат N-[(1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)-(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (0,160 г, 0,499 ммоль) и N-этил-N,N-диизопропиламин (0,123 г, 0,954 ммоль). Этот раствор перемешивали два часа при комнатной температуре. Добавляли EtOAc (20 мл) и промывали органическую фазу карбонатом натрия (3×20 мл, водный) и соляной кислотой (0,5 М, 2×, 10 мл). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,138 г метил-2-[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензоата (выход 67,9%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl ₃): 1.07-1.22 (bm, 3H), 3.1 (m, 2H). 3.20 (bm, 2H), 3.9 (s, 3H), 4.2 (q, 2H), 4.6-4.8 (M, 4H), 6.8-7.02 (bm, 4H), 6.18-7.5 (bm, 11H),7.78(d,1H).

b) Растворяли метил-2-[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензоат (0,138 г, 0,308 ммоль) в смеси тетрагидрофуран/вода (1/1, 4 мл). Добавляли гидроксид лития (0,015 г, 0,617 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (14 минут, 150 градусов). Проводили обработку удалением растворителя упариванием и добавлением HCl (2 мл, 1 М). Водную фазу экстрагировали двумя порциями EtOAc (20 мл), органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,146 г 2-[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойной кислоты.

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl ₃): 1.02-1.22 (bm, 3H), 3.1 (m, 2H), 3.25-3.5 (bm, 2H), 4.2 (q, 2H), 4.55-4.8 (M, 4H), 6.8-7.4 (bm, 11H), 7.5 (m, 1H), 8.1 (d, 1H).

Пример 10

а) Растворяли трет-бутил-(4-{2-[(метилсульфонил)-окси]-этил}-фенокси)-ацетат (5,454 г, 17,347 ммоль) в ацетонитриле (100 мл), добавляли метил 2-меркаптобензоат (3,502 г, 20,816 ммоль) и карбонат калия (4,795 г, 34,694 ммоль). Этот раствор перемешивали 10 часов при 60°С. Добавляли EtOAc (40 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола (2×, 40 мл, водный). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 6,931 г неочищенного метил-2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоата. Неочищенный продукт использовали в следующей стадия без дополнительной очистки.

b) Метил 2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоат (4,630 г, 11,502 ммоль) брали в ДХМ (50 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (44,40 г, 389,405 ммоль) при КТ в течение 4 часов. Эту смесь упаривали и азеотропировали с толуолом. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (начинали с изократической смеси ацетонитрил/буфер 60/40 и затем увеличивали концентрацию ацетонитрила до 100%; буфером была смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 М); колонка KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм; скорость тока 40 мл/мин). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием. Добавляли EtOAc (10 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола и сушили (сульфат магния). Растворитель удаляли упариванием с получением 3,825 г [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусной кислоты (выход в двух стадиях 63,9% в сумме).

¹ H-ЯМР (500 мГц, CDCl₃): 2.82 (t, 2H), 3.15 (t, 2H), 3.82 (s, 3H), 4.35 (s, 2H), 6.78 (d, 2H), 7.18 (d, 2H), 7.23 (t, 1H), 7.51 (d, 1H), 7.55 (t, 1H), 7.85 (d. 1H).

c) Растворяли [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусную кислоту (0,200 г, 0,577 ммоль) в диметилформамиде (10 мл), добавляли N-бензил-N-этиламин (0,086 г, 0,635 ммоль) и охлаждали эту смесь до 0°С. Добавляли тетрафторборат N-[(1H-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (0,204 г, 0,635 ммоль) и N-этил-N,N-диизопропиламин (0,157 г, 1,212 ммоль). Этот раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли воду (100 мл) и экстрагировали водную фазу диэтиловым эфиром (3×20 мл). Органическую фазу промывали карбонатом натрия (3×20 мл, водный) и соляной кислотой (0,5 М, 2х, 10 мл). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией (начинали с изократической смеси гептан/EtOAc 30/70 и затем увеличивали концентрацию EtOAc до 100%; (силикагель 60; 0,004-0,063 мм). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, растворитель удаляли упариванием с получением 0,137 г метил-2-{[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензоата (выход 51,2%).

d) Растворяли метил-2-{[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензоат (0,137 г, 0,296 ммоль) в смеси ацетонитрил/вода (1/1, 4 мл), добавляли гидроксид лития (0,014 г, 0,591 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (5 минут, 150 градусов). Проводили обработку удалением растворителя упариванием и добавлением соляной кислоты (2 мл, 1 М). Водную фазу экстрагировали двумя порциями EtOAc (20 мл), органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием, что давало 0,111 г 2-{[2-(4-{2-[бензил(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензойной кислоты (выход 83,5%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 400 мГц, CDCl₃): 1.02-1.30 (bm, 3Н), 2.95 (q, 2H), 3.15 (q, 2H), 3.40 (m, 2H), 4.58 (s, 2H), 4.63-4.92 (bm, 4H), 6.85-7.0 (bm, 2H), 7.0-7.53 (m, 10Н), 7.97 (d, 1H).

Пример 11

a) Растворяли N-(4-трет-бутилбензил)-N-этиламин (0,143 г, 0,746 ммоль) в сухом ацетонитриле под N₂ и добавляли N-этил-N,N-диизопропиламин (0,371 г, 2,867 ммоль). Перемешивали эту смесь в течение 30 минут и добавляли метил-2-{2-[4-(2-хлор-2-оксоэтокси)-фенил]-этокси}-бензоат (0,200 г, 0,573 ммоль). Этот раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией (начинали с изократической смеси гептан/EtOAc 50/50 и затем концентрацию EtOAc увеличивали до 100%; силикагель 60, 0,004-0,063 мм). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, EtOAc удаляли упариванием с получением 0,229 г метил-2-[2-(4-{2-[(4-трет-бутилбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензоата (выход 79,3%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl ₃): 1.07-1.23 (bm, 3Н), 2.23 (m, 9H), 3.08 (m, 2H), 3,30-3.5 (bm, 2H), 3.87 (s, 3Н), 4.18 (m, 2H), 4.58 (d, 2H), 4.63-4.8 (m, 2H) 6.77-7.43 (m, 11H). 7.78 (d, 1H).

b) Растворяли метил-2-[2-(4-{2-[(4-трет-бутилбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензоат (0,2290 г, 0,455 ммоль) в смеси ТГФ (свежеперегнанный)/вода (2/1, 3 мл), добавляли гидроксид лития (0,218 г, 0,909 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (5 минут, 150 градусов). Удаляли ТГФ упариванием, добавляли воду (10 мл) и промывали щелочную водную фазу диэтиловым эфиром (2×10 мл). Добавляли HCl (2 мл, 1 М, рН 1). Водную фазу экстрагировали двумя порциями ДХМ (20 мл), органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,163 г 2-[2-(4-{2-[(4-трет-бутилбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойной кислоты (выход 73,2%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl₃): 5 1.07-1.21 (bm, 3H), 2.28 (m, 9H), 3.12 (m, 2H), 3.28-3.5 (bm, 2H), 4.4 (m, 2H), 4.58 (d. 2H), 4.63-4.78 (m, 2H) 6.80-7.55 (m, 11H),8.1 (d.1H).

Пример 12

a) Растворяли уксусную кислоту (1,321 г, 22,000 ммоль) в ДМФ (10 мл), добавляли 1-(4-фторфенил)-метанамин (2,478 г, 19,800 ммоль) и охлаждали эту смесь до 0°С. Добавляли тетрафторборат N-[(1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (7,770 г, 24,200 ммоль) и N-этил-N,N-диизопропиламин (5,971 г, 46,200 ммоль). Этот раствор перемешивали два часа при комнатной температуре. Добавляли EtOAc (20 мл) и промывали органическую фазу карбонатом натрия (3×20 мл, водный) и соляной кислотой (0,5 M, 2×, 10 мл). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (начинали с изократической смеси ацетонитрил/буфер 60/40 и затем концентрацию ацетонитрила увеличивали до 100%; буфером была смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 M); колонка KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм; скорость тока 40 мл/мин). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием. Добавляли EtOAc (10 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола и сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием, что давало 1,344 г N-(4-фторбензил)-ацетамида (выход 36,5%).

¹H-ЯМР (500 мГц, CDCl₃ ): 1.98 (s, 3H), 4.35 (d, 2H), 6.25 (bs, 1H), 6.95-7.25 (bm, 4H)

b) Растворяли N-(4-фторбензил)-ацетамид (1,344 г, 8,039 ммоль) в тетрагидрофуране (100 мл) и охлаждали до нуля градусов под атмосферой аргона. Добавляли комплекс (метилтио)-метана с бораном (1:1) (1,527 г, 20,098 ммоль) и держали эту смесь при дефлегмации в течение ночи при КТ. Осторожно добавляли соляную кислоту (15 мл, 10%) и перемешивали в течение ночи. Растворитель удаляли упариванием. Добавляли диэтиловый эфир (20 мл) и экстрагировали продукт в водную фазу карбонатом калия (3×15 мл). Водную фазу подкисляли соляной кислотой (10 мл, 10%) и продукт экстрагировали в органическую фазу этилацетатом (3×15 мл). Органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,309 г N-(4-фторбензил)-этанамина (выход 25,1%).

¹H-ЯМР (400 мГц, CDCl₃): 1.05 (t, 3Н), 1.1 (s, 1H), 2.58 (q, 2H), 3.64 (s, 2H), 6.9 (t, 2H), 7.2 (t, 2H).

c) Растворяли N-(4-фторбензил)-этанамин (0,114 г, 0,745 ммоль) в сухом ацетонитриле под N₂ и добавляли N-этил-N,N-диизопропиламин (0,371 г, 2,867 ммоль). Перемешивали эту смесь в течение 30 минут и добавляли метил-2-{2-[4-(2-хлор-2-оксоэтокси)-фенил]-этокси]-бензоат (0,200 г, 0,573 ммоль). Этот раствор перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией (начинали с изократической смеси гептан/EtOAc 50/50 и затем увеличивали концентрацию EtOAc до 100%; силикагель 60, 0,004-0,063 мм). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, EtOAc удаляли упариванием с получением 0,223 г метил-2-[2-(4-{2-[этил-(4-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензоата (выход 83,5%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl ₃): 1.07-1.23 (bm, 3Н), 3.08 (m, 2H), 3.30-3.45 (bm, 2H), 3.87 (s, 3Н), 4.18 (m, 2H), 4.58 (s, 2H), 4.63-4.8 (m, 2H), 6.77-7.45 (m, 11H), 7.78 (d, 1H).

d) Растворяли метил-2-[2-(4-{2-[этил(4-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензоат (0,223 г, 0,479 ммоль) в смеси тетрагидрофуран (свежеперегнанный)/вода (2/1, 3 мл), добавляли гидроксид лития (0,229 г, 0,958 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (5 минут, 150 градусов). Удаляли тетрагидрофуран упариванием, добавляли воду (10 мл) и промывали щелочную водную фазу диэтиловым эфиром (2 × 10 мл). Добавляли HCl (2 мл, 1 M, рН 1). Водную фазу экстрагировали двумя порциями ДХМ (20 мл), органическую фазу сушили (сульфатом магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,196 г 2-[2-(4-{2-[этил-(4-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этокси]-бензойной кислоты (выход 90,6%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl₃): 1.03-1.21 (bm, 3Н), 3.1 (m, 2H), 3.23-3.4 (bm, 2H), 4.38 (m, 2H), 4.55 (s, 2H), 4.63-4.78 (m, 2H), 6.75-7.22 (m, 10H), 7.47 (t, 1H), 8.07 (d, 1H).

Пример 13

a) Растворяли трет-бутил-(4-{2-[(метилсульфонил)-окси]-этил)-фенокси)-ацетат (5,454 г, 17,347 ммоль) в ацетонитриле (100 мл), добавляли метил 2-меркаптобензоат (3,502 г, 20,816 ммоль) и бикарбонат калия (4,795 г, 34,694 ммоль). Этот раствор перемешивали 10 часов при 60°С. Добавляли EtOAc (40 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола (2 ж 40 мл, водный). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 6,931 г неочищенного метил-2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоата. Неочищенный продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

b) Метил-2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоат (4,630 г, 11,502 ммоль) брали в ДХМ (50 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (44,40 г, 389,405 ммоль) при КТ в течение 4 часов. Эту смесь выпаривали и азеотропировали с толуолом. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (начинали с изократической смеси ацетонитрил/буфер 60/40 и затем концентрацию ацетонитрила увеличивали до 100%; буфером была смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 М); колонка KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм; скорость тока 40 мл/мин). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием. Добавляли EtOAc (10 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола и сушили (сульфат магния). Растворитель удаляли упариванием с получением 3,825 г [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусной кислоты (выход в двух стадиях 63,9% в сумме).

¹ H-ЯМР (500 мГц, CDCl₃): 2.82 (t, 2H), 3.15 (t, 2H), 3.82 (s, 3H), 4.35 (s, 2H), 6.78 (d, 2H), 7.18 (d, 2H), 7.23 (t, 1H), 7.51 (d. 1H), 7.55 (t, 1H), 7.85 (d, 1H).

c) Растворяли [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусную кислоту (0,250 г, 0,722 ммоль) в ДХМ (10 мл), добавляли N-(2-фторбензил)-этанамин (0,105 г, 0,686 ммоль). Добавляли тетрафторборат N-[(1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (0,255 г, 0,794 ммоль) и N-трет-N,N-диизопропиламин (0,187 г, 1,443 ммоль). Этот раствор перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией (начинали с изократического ДХМ 100% и затем концентрацию МеОН увеличивали от 0,5% до 20%; силикагель 60, 0,004-0,063 мм). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, EtOAc удаляли упариванием. Субстанцию надо было очистить еще раз, и ее очищали препаративной ВЭЖХ (начинали с изократической смеси ацетонитрил/буфер 60/40 и затем концентрацию ацетонитрила увеличивали до 100%; буфером была смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 М); колонка KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм; скорость тока 40 мл/мин). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием. Ацетат аммония удаляли сублимационной сушкой продукта в течение ночи с получением 0,1 г метил-2-{[2-(4-{2-[этил-(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензоата (выход 29,1%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц, CDCl ₃): 1.03-1.23 (bm, 3H), 2.95 (q, 2H), 3.15 (q, 2H), 3.40 (m, 2H), 3.9 (s, 3H), 4.6-4.8 (bm, 4H), 6.75-6.95 (m, 2H), 6.97-7.5 (m, 9H), 7.97 (d,1H).

d) Растворяли метил-2-{[2-(4-{2-[этил(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензоат в смеси ТГФ (свежеперегнанный)/вода (2/1, 3 мл), добавляли гидроксид лития (0,015 г, 0,629 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (5 минут, 150 градусов). Удаляли тетрагидрофуран упариванием, добавляли воду (10 мл) и промывали щелочную водную фазу диэтиловым эфиром (2х10 мл). Добавляли соляную кислоту (2 мл, 1 М, рН 1). Водную фазу экстрагировали двумя порциями ДХМ (20 мл), органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,095 г 2-{[2-(4-{2-[этил(2-фторбензил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензойной кислоты (выход 96,9%)

¹H-ЯМР (ротамеры, 400 мГц, CDCl₃): 1.02-1.25 (bm, 3H), 2.95 (q. 2H), 3.15 (q, 2H), 3.42 (m, 2H), 4.60-4.80 (bm, 4H), 6.75-6.95 (m, 2H), 6.95-7.5 (m, 9H), 8.1 (d, 1H).

Пример 14

а) Растворяли трет-бутил-(4-{2-[(метилсульфонил)-окси]-этил}-фенокси)-ацетат (5,454 г, 17,347 ммоль) в ацетонитриле (100 мл), добавляли метил-2-меркаптобензоат (3,502 г, 20,816 ммоль) и карбонат калия (4,795 г, 34,694 ммоль). Этот раствор перемешивали 10 часов при 60°С. Добавляли EtOAc (40 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола (2 × 40 мл, водный). Органический слой сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 6,931 г неочищенного метил-2-({2-[4-(2-трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоата. Неочищенный продукт использовали в следующей стадии без дополнительной очистки.

b) Метил-2-({2-[4-(трет-бутокси-2-оксоэтокси)-фенил]-этил}-тио)-бензоат (4,630 г, 11,502 ммоль) брали в ДХМ (50 мл) и обрабатывали трифторуксусной кислотой (44,40 г, 389,405 ммоль) при КТ в течение 4 часов. Эту смесь выпаривали и азеотропировали с толуолом. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (начинали с изократической смеси ацетонитрил/буфер 60/40 и затем концентрацию ацетонитрила увеличивали до 100%; буфером была смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 М); колонка KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм; скорость тока 40 мл/мин). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием. Добавляли EtOAc (10 мл) и промывали органическую фазу двумя порциями рассола и сушили (сульфат магния). Растворитель удаляли упариванием с получением 3,825 г [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусной кислоты (выход в двух стадиях 63,9% в сумме).

¹ H-ЯМР (500 мГц, CDCl₃): 2.82 (t, 2Н), 3.15 (t, 2Н), 3.82 (s, 3H), 4.35 (s. 2H), 6.78 (d, 2Н), 7.18 (d, 2Н), 7.23 (t, 1H), 7.51 (d, 1H), 7.55 (t, 1H), 7.85 (d, 1H).

c) Растворяли [4-(2-{[2-(метоксикарбонил)-фенил]-тио}-этил)-фенокси]-уксусную кислоту (0,250 г, 0,722 ммоль) в ДХМ (10 мл) и добавляли N-(2-хлорбензил)-N-этиламин (0,116 г, 0,686 ммоль). Добавляли тетрафторборат N-[(1Н-1,2,3-бензотриазол-1-илокси)(диметиламино)-метилен]-N-метилметанаминия (0,255 г, 0,794 ммоль) и N-этил-N,N-диизопропиламин (0,187 г, 1,443 ммоль). Этот раствор перемешивали 2 часа при комнатной температуре. Неочищенный продукт очищали флэш-хроматографией (начинали с изократического ДХМ 100% и затем увеличивали концентрацию МеОН от 0,5% до 20%; силикагель 60, 0,004-0,063 мм). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, EtOAc удаляли упариванием. Субстанцию надо было очистить еще раз, и ее очищали препаративной ВЭЖХ (начинали с изократической смеси ацетонитрил/буфер 60/40 и затем концентрацию ацетонитрила увеличивали до 100%; буфером была смесь ацетонитрил/вода 10/90 с ацетатом аммония (0,1 М); колонка KR-100-7-C8, 50 мм × 250 мм; скорость тока 40 мл/мин). Фракции, содержащие продукт, объединяли в пул, ацетонитрил удаляли упариванием. Ацетат аммония удаляли сублимационной сушкой продукта в течение ночи с получением 0,111 г метил-2-{[2-(4-{2-[(2-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензоата (выход 30,9%).

¹H-ЯМР (ротамеры, 500 мГц. CDCl ₃): 1.10-1.25 (bm, 3Н), 2.95 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 3.40 (m, 2H), 3.9 (s, 3Н), 4.6-4.8 (bm, 4H), 6.75-6.95 (m, 2H), 7.02-7.5 (m, 9H), 7.95 (d, 1H).

d) Растворяли метил-2-{[2-(4-{2-[(2-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензоат в смеси тетрагидрофурана (свежеперегнанный)/вода (2/1, 3 мл), добавляли гидроксид лития (0,015 г, 0,629 ммоль). Взаимодействие осуществляли в одноузловой микроволновой печи (5 минут, 150 градусов). Удаляли тетрагидрофуран упариванием, добавляли воду (10 мл) и промывали щелочную водную фазу диэтиловым эфиром (2×10 мл). Добавляли соляную кислоту (2 мл, 1 M, pH 1). Водную фазу экстрагировали двумя порциями ДХМ (20 мл). Органическую фазу сушили (сульфат магния) и растворитель удаляли упариванием с получением 0,103 г 2-{[2-(4-{2-[(2-хлорбензил)(этил)-амино]-2-оксоэтокси}-фенил)-этил]-тио}-бензойной кислоты (выход 95,5%)

¹H-ЯМР (ротамеры, 400 мГц, CDCl₃): 1.07-1.25 (bm, 3Н), 2.95 (m, 2H), 3.15 (m, 2H), 3.42 (m, 2H), 4.62-4.85 (bm, 4H), 6.75-6.95 (m, 2H), 7.02-7.5 (m, 9H), 8.1 (d, 1H).

Биологическая активность

Препараты

Растворяли соединения в ДМСО с получением 16 мМ сток-растворов. Перед анализами дополнительно разбавляли сток-растворы диметилсульфоксидом и культуральной средой.

ОБЩИЕ ХИМИКАТЫ И РЕАГЕНТЫ

Реагент для определения люциферазы приобретали у Packard, USA. Рестрикционные энзимы были от Boehringer, a Vent-полимераза от New England Biolabs.

КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ И УСЛОВИЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК

U2-OS (клетки остеогенной саркомы человека) получали в АТСС, США. Размножали и снова замораживали клетки партиями с пересева номер шесть. Культивировали клетки в среде Игла при модификации по Дульбекко (DMEM) с 25 мМ глюкозой, 2 мМ глутамином или 4 мМ L-аланил-L-глутамином, 10%-ой фетальной телячьей сывороткой при 5% CO₂. Использовали забуференный фосфатами физраствор (PBS) без добавления кальция или магния. Все реагенты для клеточных культур были от Gibco (USA), 96-луночные планшеты для клеточных культур были приобретены у Wallach.

ПЛАЗМИДНЫЕ КОНСТРУКТЫ ДЛЯ ГЕТЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ЭКСПРЕССИИ

Применяли стандартные методики работы с рекомбинантной ДНК как описано у Ausubel (7). Люциферазный репортерный вектор pGL5UAS (клон состоит из пяти копий ДНК связывающей последовательности GAL4, 5'-CGACGGAGTACTGTCCTCCGAGCT-3') клонировали в Sacl/Xhol-сайты pGL3-промотора (Рготеда). Sacl/Xhol-фрагмент, несущий UAS-сайты, конструировали при использовании отжига перекрывающихся олигонуклеотидов.

Использованные экспрессионные векторы основаны на pSG5 (Stratagene). Все векторы содержат EcoRI/Nhel-фрагмент, кодирующий ДНК-связывающий домен GAL4 (позиции кодирующих аминокислот 1-145 в базе данных под номером доступа Р04386), с последующим слиянием в рамке считывания с фрагментом, кодирующим последовательность локализации в ядре, из Т-антигена вируса полиомы. Последовательность локализации в ядре конструировали при использовании отожженных перекрывающихся олигонуклеотидов, что создает липкие NheI/KpnI-концы (5'-CTAGCGCTCCTAGAAGAAACGCAAGGTTGGTAC-3'). Лиганд-связывающие домены PPAR человека и мыши и PPAR человека и мыши амплифицировали в ПЦР как KpnI/BamIII-фрагменты и клонировали в рамке в ДНК-связывающий домен GAL4 и последовательность локализации в ядре. Последовательность всех использованных плазмидных конструктов подтверждали секвенированием. Для кратковременной трансфекции использовали нижеследующие экспрессионные векторы:

вектор	кодируемый подтип PPAR	ссылка на последовательность 1
pSGGALhPPa	PPAR человека	S74349, nt 625-1530
pSGGALmPPa	PPAR мыши	X57638, nt 668-1573
pSGGALhPPg	PPAR человека	U63415, nt 613-1518
pSGGALmPPg	PPAR мыши	U09138, nt 652-1577

¹относится к позициям нуклеотидов записи в базе данных, использованной для экспрессии лиганд-связывающего домена

КРАТКОВРЕМЕННЫЕ ТРАНСФИЦИРОВАНИЯ

Размораживали замороженные запасы клеток из пересева номер шесть и перед трансфецированием размножали до пересева номер восемь. Трипсинизировали конфлюэнтные клетки, промывали их и осаждали центифугированием при 270 g в течение 2 минут. Осадок клеток снова суспендировали в холодном PBS до концентрации клеток около 18х10⁶ клеток/мл. После добавления ДНК инкубировали клеточные суспензии на льду приблизительно 5 минут до электропорации при 230 В, 960 микрофарад в Biorad's Gen Pulser партиями по 0,5 мл. В сумме в каждую партию по 0,5 мл клеток добавляли по 50 мкг ДНК, включающей в себя 2,5 мкг экспрессионного вектора, 25 мкг репортерного вектора и 22,5 мкг неспецифической ДНК (pBluescript, Stratagene).

После электропорации разбавляли клетки до концентрации 320000 клеток/мл в DMEM без фенола красного и высевали приблизительно 25000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты. Для того, чтобы перед добавлением тестируемого соединения дать клеткам оправиться, инкубировали засеянные планшеты при 37°С в течение 3-4 часов. В анализах на PPAR среду клеток дополняли обедненной на смоле с активированным углем фетальной телячьей сывороткой (FCS) для того, чтобы избежать фоновой активации жирнокислотными компонентами FCS. Обедненную на смоле с активированным углем FCS получали следующим образом: к 500 мл инактивированной нагреванием FCS добавляли 10 г активированного угля и 25 г анионообменной смолы Bio-Rad для анализа с зернистостью 200-400 меш и держали этот раствор на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение ночи. На следующий день FCS центрифугировали и процедуру обеднения повторяли в течение 4-6 часов. После второй обработки FCS центрифугировали и стерилизовали фильтрацией для удаления остатков активированного угля и смолы.

ПРОЦЕДУРА АНАЛИЗА

Разбавляли в ДМСО сток-растворы соединений до надлежащих диапазонов концентраций в главных планшетах. Из главных планшетов разбавляли соединения в культуральной среде с целью получения растворов тестируемых соединений для конечных доз.

После доведения количества среды клеток в каждой лунке до 75 мкл добавляли 50 мкл раствора тестируемого соединения. Кратковременно трансфицированные клетки экспонировали соединениям в течение около 24 часов перед определением люциферазы. Для определения люциферазы добавляли вручную к каждой лунке 100 мкл реагента для анализ и оставляли планшеты приблизительно на 20 минут для того, чтобы создать возможность для лизиса клеток. После лизиса измеряли активность люциферазы в счетчике 1420 Multiwell Victor от Wallach.

Референтные соединения

Пиоглитазон TZD использовали в качестве референтной субстанции для активации как человеческих, так и мышиных PPAR . 5,8,11,14-Эйкозатетраеновую кислоту (ETYA) использовали как референтную субстанцию для человеческих PPAR .

Вычисления и анализ

Для вычисления величин EC₅₀ строили кривую концентрация-эффект. Использованные величины производили из средних по двум или трем независимым измерениям (после вычитания средней величины фона) и выражали как проценты от максимальной активации, полученной с референтным соединением. Величины наносили против логарифма концентрации тестируемого соединения. Оценивали величины ЕС₅₀ по линейной интеркаляции между точками, которые соответствуют данным, вычислением концентрации, требуемой для достижения 50% максимальной активации, полученной с референтным соединением.

Соединения формулы I имеют EC₅₀ меньше чем 50 мкмоль/л для PPAR и предпочтительные соединения имеют ЕС₅₀ меньше чем 5 мкмоль/л. Например, ЕС₅₀ некоторых из Примеров для PPAR человека составляют:

Пример 3: 0,499 мкмоль/л и

Пример 5; 0,048 мкмоль/л.

Данные, полученные в in vivo тестах на мышах линии ob/ob показывают, что агонисты PPAR эффективно понижают уровни глюкозы, инсулина, триглицеридов в организме, а также предотвращают увеличение массы тела. Следовательно, можно сделать вывод о том, что агонисты PPAR можно использовать для лечения гипергликемии, гиперинсулинемии, дислипидемии, диабета, ожирения и резистентности к инсулину.