дигидротиафенантренкарбонилгуанидины, их применение в качестве лекарственного средства

Формула изобретения

1. Дигидротиафенантренкарбонилгуанидины формулы I

в которой R(1) и R(3) обозначают независимо друг от друга водород, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами;

R(2) обозначает водород;

R(4) и R(5) обозначают водород;

R(6), R(7), R(8) и R(9) обозначают независимо друг от друга водород, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами; алкокси с 1, 2, 3 или 4 С-атомами, F, Cl, Br, I; или

R(8) и R(9) вместе с соединенным с ними фенильным кольцом образуют нафталиновый фрагмент;

А обозначает -SO₂-,

а также их фармацевтически переносимые соли.

2. Соединения формулы I по п.1, в которой

R(1) и R(3) обозначают независимо друг от друга водород, метил, этил;

R(6), R(7), R(8) и R(9) обозначают независимо друг от друга водород, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами; метокси, этокси, F, C1; или

R(8) и R(9) вместе с соединенным с ними фенильным кольцом образуют нафталиновый фрагмент;

а также их фармацевтически переносимые соли.

3. Соединения формулы I по п.1 или 2, в которой

R(1) обозначает водород, метил, этил;

R(6), R(7), R(8) и R(9) обозначают независимо друг от друга водород, метил, метокси, этокси, F, C1; или

R(8) и R(9) вместе с соединенным с ними фенильным кольцом образуют нафталиновый фрагмент;

а также их фармацевтически переносимые соли.

4. Соединения формулы I по п.1 или 2, в которой

R(1) обозначает водород, метил;

R(6), R(7), R(8) и R(9) обозначают независимо друг от друга водород, метил, метокси, этокси, F, C1; или

R(8) и R(9) вместе с соединенным с ними фенильным кольцом образуют нафталиновый фрагмент;

а также их фармацевтически переносимые соли.

5. Применение соединения I по п.1 для приготовления лекарственного средства, ингибирующего Na⁺ /H⁺-обмен.

6. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики вызываемых ишемическими состояниями заболеваний.

7. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики инфаркта миокарда и аритмий.

8. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики стенокардии.

9. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики ишемических состояний сердца.

10. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики ишемических состояний периферической и центральной нервной системы и апоплексического удара.

11. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики ишемических состояний периферических органов и конечностей.

12. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для лечения состояний шока.

13. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для применения при хирургических операциях и трансплантациях органов.

14. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для консервации и хранения трансплантатов для хирургических мероприятий.

15. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для лечения заболеваний, первичной или вторичной причиной которых является пролиферация клеток.

16. Применение по п.5 для приготовления лекарственного средства для лечения или профилактики нарушений липидного обмена.

17. Лекарственное средство, ингибирующее Na ⁺/Н⁺-обмен и содержащие эффективное количество соединения I по одному или нескольким из пп.1-4.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится к дигидротиафенантренкарбонилгуанидинам формулы I

в которой

R(1) и R(3) обозначают независимо друг от друга водород, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами, алкокси с 1, 2, 3 или 4 С-атомами, F, Cl, Br, I, CN, NR(10)R(11), -O _p-(CH₂)_n-(CF ₂)_х-CF₃ или -(SO_m)_р-(СН ₂)_n-(CF₂) _x-CF₃;

R(10) и R(11) обозначают независимо друг от друга водород, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами или -(CH₂)_n-(CF ₂)_x-CF₃;

m равно 0, 1 или 2;

n равно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

х и р независимо друг от друга равны 0 или 1;

R(2) обозначает водород, F, Cl, Br, I, CN, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами, метокси, циклоалкил с 3, 4, 5, 6, 7 или 8 С-атомами,

R(4) и R(5) обозначают независимо друг от друга водород, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами;

R(6), R(7), R(8) и R(9) обозначают независимо друг от друга водород, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами; алкокси с 1, 2, 3 или 4 С-атомами, F, Cl, Br, I, CN, NR(12)R(13), -O _q-(CH₂)_r-(CF ₂)_s-CF₃ или -(SO_w)_t-(CH ₂)_u-(CF₂) _v-CF₃;

R(12) и R(13) обозначают независимо друг от друга водород, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами;

w равно 0, 1 или 2;

r и u равны 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6;

q, s, t и v независимо друг от друга равны 0 или 1;

или

R(6) и R(7) или R(7) и R(8) или R(8) и R(9) вместе с соединенным с ними фенильным кольцом образуют нафталиновый фрагмент;

А обозначает -S-, -SO- или -SO ₂,

а также их фармацевтически переносимые соли.

Предпочтительными являются соединения формулы I, в которой:

R(1) и R(3) обозначают независимо друг от друга водород, метил, этил, метокси, этокси, F, Cl, Br, I, CN, NR(10)R(11), -O _p-(CH₂)_n-CF ₃ или -(SO_m)_p -(CH₂)_n-CF ₃;

R(10) и R(11) обозначают независимо друг от друга водород, метил, этил или -CH₂-CF ₃;

m равно 0, 1 или 2;

n равно 0, 1, 2 или 3;

р независимо друг от друга равны 0 или 1;

R(2) обозначает водород, F, Cl, CN, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами, метокси, циклоалкил с 3, 4, 5 или 6 С-атомами,

R(4) и R(5) обозначают независимо друг от друга водород, метил или этил;

R(6), R(7), R(8) и R(9) обозначают независимо друг от друга водород, алкил с 1, 2, 3 или 4 С-атомами; метокси, этокси, F, Cl, Br, I, CN, NR(12)R(13), -O_q-(CH ₂)_r-CF₃ или -(SO_w)_t-(CH ₂)_u-CF₃;

R(12) и R(13) обозначают независимо друг от друга водород, метил или этил;

w равно 0, 1 или 2;

r и u равны 0, 1, 2 или 3;

q и t независимо друг от друга равны 0 или 1;

или

R(6) и R(7) или R(7) и R(8) или R(8) и R(9) вместе с соединенным с ними фенильным кольцом образуют нафталиновый фрагмент;

А обозначает -S-, -SO- или -SO ₂,

а также их фармацевтически переносимые соли.

Особенно предпочтительными являются соединения формулы I, в которой:

R(1) обозначает водород, метил, этил, метокси, этокси, F, Cl, NR(10)R(11), -O_p-(CH ₂)_n-CF₃ или -(SO_m)_p-(CH ₂)_n-CF₃;

R(10) и R(11) обозначают независимо друг от друга водород, метил, этил или -CH₂-CF ₃;

m равно 0, 1 или 2;

n, р равны независимо друг от друга 0 или 1;

R(2) обозначает водород, F, Cl, метил, циклоалкил с 3, 4, 5 или 6 С-атомами,

R(3), R(4) и R(5) обозначают водород;

R(6), R(7), R(8) и R(9) обозначают независимо друг от друга водород, метил, метокси, этокси, F, Cl, NR(12)R(13), -O_q-(CH ₂)_r-CF₃ или -(SO_w)_t-(CH ₂)_u-CF₃;

R(12) и R(13) обозначают независимо друг от друга водород, метил или этил;

w равно 0, 1 или 2;

q, r, t и u равны независимо друг от друга 0 или 1;

или

R(6) и R(7) или R(7) и R(8) или R(8) и R(9) вместе с соединенным с ними фенильным кольцом образуют нафталиновый фрагмент;

А обозначает -S-, -SO- или -SO₂,

а также их фармацевтически переносимые соли.

Еще более предпочтительными являются соединения формулы I, в которой:

R(1) обозначает водород, метил, метокси, этокси, Cl, NR(10)R(11), -O-CH ₂-CF₃ или -(SO_m )_p-(CH₂) _n-CF₃;

R(10) и R(11) обозначают независимо друг от друга водород, метил, этил или -CH ₂-CF₃;

m равно 0, 1 или 2;

р равно 0 или 1;

R(2) обозначает водород, F, Cl или метил,

R(3), R(4) и R(5) обозначают водород;

R(6), R(7), R(8) и R(9) обозначают независимо друг от друга водород, метил, метокси, этокси, F, Cl, -O-CH₂-CF ₃ или -(SO_w)_t -(CH₂)_u-CF ₃;

w равно 0, 1 или 2;

t и u равны независимо друг от друга 0 или 1;

или

R(6) и R(7) или R(7) и R(8) или R(8) и R(9) вместе с соединенным с ними фенильным кольцом образуют нафталиновый фрагмент;

А обозначает -SO ₂,

а также их фармацевтически переносимые соли.

Соединения формулы I могут при соответствующем замещении находиться в стереоизомерных формах. Если соединения формулы I содержат один или несколько асимметричных центров, то они могут обнаруживать независимо друг от друга S-конфигурацию или R-конфигурацию. К данному изобретению относятся также все возможные стереоизомеры, например энантиомеры или диастереомеры, и смеси двух или более стереоизомерных форм, например энантиомеров и/или диастереомеров, в любых соотношениях. Энантиомеры в энантиомерно чистой форме, как лево-, так и правовращающие антиподы, а также в форме смесей обоих энантиомеров в различных соотношениях или в форме рацематов также относятся к данному изобретению. Получение отдельных стереоизомеров может проводиться, если желательно, разделением смеси обычными способами или, например, с использованием стереоселективного синтеза. При наличии подвижных атомов данное изобретение включает в себя также все таутомерные формы соединений формулы I.

Указанные алкильные остатки могут иметь прямую цепь или быть разветвленными.

Данное изобретение относится также к способу получения соединения I, отличающемуся тем, что соединение формулы II

в которой R(1)-R(9), а также А имеют указанное выше значение, а L обозначает легко нуклеофильно замещаемую уходящую группу, подвергают взаимодействию с гуанидином.

Активированные кислотные производные формулы II, в которых L обозначает алкокси-, предпочтительно метоксигруппу, феноксигруппу, фенилтио-, метилтио-, 2-пиридилтиогруппу, содержащий азот гетероцикл, предпочтительно 1-имидазол, получают известным образом из составляющих их основу хлорангидридов карбоновых кислот (формула II, L=Cl), которые, в свою очередь, могут быть получены известным образом из карбоновых кислот (формула II, L=ОН), например, с тионилхлоридом.

Наряду с хлорангидридами карбоновых кислот формулы II (L=Cl) дополнительные активированные кислотные производные формулы II могут быть также получены известным образом непосредственно из составляющих их основу производных бензойной кислоты (формула II, L=ОН), таких как метиловые эфиры формулы II с L=OCH ₃, обработкой газообразным HCl в метаноле, имидазолиды формулы II обработкой карбонилдиимидазолом [L=1-имидазолил, Staab, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1, 351-367 (1962)], смешанные ангидриды II с Cl-COOC₂H₅ или тозилхлоридом в присутствии триэтиламина в инертном растворителе, а также активированием бензойных кислот дициклогексилкарбодиимидом (DCC) или О-[(циано(этоксикарбонил)метилен)амино]-1,1,3,3-тетраметилуронийтетрафторборатом ("TOTU") [Proceedings of the 21. European Peptide Symposium, Peptides 1990, Editors E. Giralt and D. Andreu, Escom, Leiden, 1991]. Ряд подходящих способов получения активированных производных формулы II приведены среди данных в J. March, Advanced Organic Chemistry, Third Edition (John Wiley & Sons, 1985), S.350.

Взаимодействие производных карбоновых кислот формулы II с гуанидином происходит известным образом в протонном или апротонном полярном, но инертном органическом растворителе. При этом при взаимодействии метилового эфира бензойной кислоты (II, L=OMe) с гуанидином метанол, изопропанол или ТГФ поддерживают при температуре от 20°С до точки кипения этих растворителей. В большинстве случаев взаимодействие соединений II со свободным от солей гуанидином осуществляют преимущественно в апротонных инертных растворителях, таких как ТГФ, диметоксиэтан, диоксан. Но может быть использована также вода при применении основания, такого как, например, NaOH, в качестве растворителя при преобразовании соединения II гуанидином. Если L обозначает Cl, используют преимущественно добавление акцептора кислоты, например, в форме избыточного гуанидина для улавливания галогеноводородной кислоты.

Для синтеза основного фрагмента дигидротиафенантренкарбоновой кислоты исходят предпочтительно из соответствующим образом замещенных бензилсульфаниленов, фенилметансульфиниленов или фенилметансульфониленов. Они подвергаются внутримолекулярному арил-арил-связыванию, которое в принципе является известным (см. Chem. Rev. 95(7), 2457 (1995) или "Metal-catalyzed Cross-coupling Reactions", Diedrich, Francois; Stang, Peter J.; Editors Germany (1988) Publisher: (Wiley-VCH, Weinheim, Germany), 517) или Tetrahedron (1998), 54(3/4), 263). Предпочтительным является связывание бороновой кислоты с подходящим арилгалогенидом, таким как арилхлорид, арилбромид, арилиодид, или подходящим сложным ариловым эфиром, таким как арилмезилат или арилтрифторметансульфонат. При этом группа бороновой кислоты может быть введена с реагентом, содержащим бензильную группу, или с бензойной кислотой. Особенно предпочтительным является применение бис(пинаколато)дибора, как описано в Tetrahedron Lett. (1997), 38(22), 3841-3844. В формуле III описано такое исходное соединение, где R(1)-R(9), а также А и L имеют указанное значение, а Х и Y в каждом случае обозначают галоген или -О-SO₂CH₃ или -О-SO₂CF₃. Предпочтительным металлическим катализатором является палладий, особенно предпочтительно в виде его комплекса Pd(dppf)₂. Реакцию проводят в диполярном апротонном растворителе, предпочтительными являются ДМФ или ДМА, при температуре между 0°С и точкой кипения растворителя, предпочтительными являются температуры между 40°С и 120°С.

Производные общей формулы III получают предпочтительно из производных 3-меркаптобензойной кислоты или из производных 3-сульфинобензойной кислоты общей формулы IV с активированными бензилпроизводными общей формулы V:

В случае Z речь идет при этом о легко нуклеофильно замещаемой уходящей группе, такой как, например, хлор, бром, иод, мезилат, тозилат или трифторметансульфонат. Производные IV и V подвергают взаимодействию в подходящем растворителе, таком как ДМФ, ТГФ или ацетонитрил, при использовании вспомогательного основания, такого как триэтиламин или DIPEA, при температуре между -20°С и точкой кипения растворителя, предпочтительно при температуре между 0°С и 40°С.

Ароилгуанидины I являются обычно слабыми основаниями и могут связывать кислоту с образованием солей. В качестве кислотно-аддитивных солей рассматриваются соли всех фармакологически переносимых кислот, например галогениды, в частности гидрохлориды, лактаты, сульфаты, цитраты, тартраты, ацетаты, фосфаты, метилсульфонаты, пара-толуолсульфонаты.

Соединения I являются замещенными ацилгуанидинами.

В противоположность известным соединениям соединения данного изобретения отличаются исключительно высокой эффективностью в ингибировании Na⁺/H⁺-обмена.

Эти соединения так же, как и известные соединения, не имеют нежелательных салидиуретических свойств и недостатков, но имеют очень хорошие антиаритмические свойства, которые, например, являются важными при лечении заболеваний, возникающих при симптомах кислородной недостаточности. Эти соединения вследствие их фармакологических свойств являются удивительным образом пригодными в качестве антиаритмических лекарственных средств с кардиопротективными компонентами для профилактики инфаркта и лечения инфаркта, а также для лечения стенокардии, причем они также превентивно ингибируют или сильно уменьшают патофизиологические процессы при возникновении индуцируемых ишемией повреждений, в частности, при провоцировании ишемически индуцируемых сердечных аритмий. Благодаря их защитным действиям против патологических гипоксических и ишемических ситуаций соединения формулы I, вследствие ингибирования клеточного механизма Na ⁺/H⁺-обмена, могут использоваться в качестве лекарственных средств для лечения всех острых или хронических провоцируемых ишемией повреждений или посредством этого первично или вторично индуцируемых заболеваний. Это касается их применения в качестве лекарственных средств для операционных вмешательств, например, при трансплантациях органов, причем соединения могут быть использованы как для защиты органов в доноре и во время их извлечения, для защиты извлеченных органов, например, при манипулировании с ними или при их хранении в физиологических жидкостях, так и при пересадке в организм реципиента. Соединения являются также ценными, протективно действующими лекарственными средствами при проведении ангиопластических хирургических вмешательств, например, на сердце, а также на периферических сосудах. В соответствии с их защитным действием в отношении вызываемых ишемией повреждений соединения пригодны также в качестве лекарственных средств для лечения ишемий нервной системы, в частности ЦНС, причем они пригодны, например, для лечения апоплексического удара или отека головного мозга. Кроме того, соединения формулы I данного изобретения пригодны также для лечения таких форм шока, как, например, аллергический, кардиогенный, гиповолемический и бактериальный шок.

Кроме того, соединения формулы I данного изобретения отличаются сильным ингибирующим действием на пролиферацию клеток, например, клеточную пролиферацию фибробластов и пролиферацию клеток гладких мышц сосудов. Поэтому соединения формулы I рассматриваются в качестве ценных терапевтических средств при заболеваниях, в случае которых пролиферация клеток является первичной или вторичной причиной, и поэтому могут быть использованы в качестве антиатеросклеротических средств, средств против диабетических поздних осложнений, раковых заболеваний, фибротических заболеваний, таких как фиброз легких, фиброз печени или фиброз почки, гипертрофий и гиперплазий органов, в частности гиперплазии предстательной железы или гипертрофии предстательной железы.

Соединения данного изобретения являются эффективными ингибиторами клеточного натрий-протонного антипортера (Na⁺/H⁺-обмена), который повышается при многих заболеваниях (эссенциальной гипертонии, атеросклерозе, диабете и т.д.) также в таких клетках, которые легко доступны для измерений, таких как, например, эритроциты, тромбоциты или лейкоциты. Соединения данного изобретения пригодны поэтому в качестве превосходных и простых экспериментальных средств, например, при их применении в качестве диагностикумов для определения и различения определенных форм гипертонии, а также атеросклероза, диабета, пролиферативных заболеваний и т.д. Кроме того, соединения формулы I пригодны для превентивной терапии для предотвращения генеза высокого кровяного давления, например, эссенциальной гипертонии.

Кроме того, было обнаружено, что соединения формулы I проявляют благоприятное влияние на сывороточные липопротеины. Общепризнано, что для возникновения артериосклеротических изменений сосудов, в частности, ишемической болезни сердца, слишком высокий уровень жира в крови, так называемые гиперлипемии представляют существенный фактор риска. Для профилактики и регресса атеросклеротических изменений исключительное значение придается поэтому снижению повышенного уровня сывороточных липопротеинов. Наряду с уменьшением общего холестерина сыворотки, особенное значение придается снижению доли специфических атерогенных липидных фракций этого общего холестерина, в частности липопротеинов низкой плотности (LDL) и липопротеинов очень низкой плотности (VLDL), так как эти липидные фракции представляют собой атерогенный фактор риска. В противоположность этому, липопротеинам высокой плотности приписывают защитную функцию против ишемической болезни сердца. В соответствии с этим, гиполипидемические средства должны быть способными снижать не только общий холестерин, но, в особенности, фракции сывороточного холестерина VLDL и LDL. Было обнаружено, что соединения формулы I демонстрируют терапевтически полезные свойства в отношении влияния на уровень липидов сыворотки. Так, например, они понижают значительно повышенную концентрацию LDL и VLDL в сыворотке, которые, например, наблюдаются вследствие повышенного приема обогащенной холестерином и липидами пищи или при патологических изменениях обмена веществ, например при генетически обусловленных гиперлипидемиях. Поэтому они могут привлекаться для профилактики и для регресса атеросклеротических изменений, посредством исключения ими каузального фактора риска. К тому же речь идет не только о первичных гиперлипидемиях, но также об определенных вторичных гиперлипидемиях, которые встречаются, например, при диабете. Кроме того, соединения формулы I приводят к явному уменьшению инфарктов, индуцируемых аномалиями обмена веществ, и, в частности, к значительному уменьшению индуцируемых размеров инфарктов и их степени тяжести. Кроме того, соединения формулы I приводят к эффективной защите эндотелиальных повреждений в отношении индуцируемых аномалиями обмена веществ. Благодаря этой защите сосудов против синдрома эндотелиальной дисфункции соединения формулы I являются ценными лекарственными средствами для предупреждения и лечения спазмов коронарных сосудов, атерогенеза и атеросклероза, гипертрофии левого желудочка и билатеральной кардиомиопатии и тромботических заболеваний.

Поэтому вышеуказанные соединения находят применение для приготовления лекарственных средств для лечения гиперхолестеринемии; для приготовления лекарственного средства для предупреждения атерогенеза; для приготовления лекарственного средства для предупреждения и лечения атеросклероза, для приготовления лекарственного средства для предупреждения и лечения заболеваний, которые провоцируются повышенным уровнем холестерина, для приготовления лекарственного средства для предупреждения и лечения заболеваний, которые провоцируются эндотелиальной дисфункцией, для приготовления лекарственного средства для предупреждения и лечения индуцируемой атеросклерозом гипертонии, для приготовления лекарственного средства для предупреждения и лечения индуцируемых атеросклерозом тромбозов, для приготовления лекарственного средства для предупреждения и лечения индуцируемых гиперхолестеринемией и эндотелиальной дисфункцией ишемических повреждений и постишемических реперфузионных повреждений, для приготовления лекарственного средства для предупреждения и лечения индуцируемых гиперхолестеринемией и эндотелиальной дисфункцией гипертрофий сердца, кардиомиопатий и застойной сердечной недостаточности (CHF), для приготовления лекарственного средства для предупреждения и лечения индуцируемых гиперхолестеринемией и эндотелиальной дисфункцией спазмов коронарных сосудов и инфарктов миокарда, для приготовления лекарственного средства для лечения вышеназванных болезней в комбинациях с понижающими кровяное давление средствами, предпочтительно с ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента (АСЕ), комбинациями Na⁺/Н ⁺-ингибиторов формулы I с понижающим уровень жира в крови активным веществом, предпочтительно с ингибитором HMG-CoA-редуктазы (например, ловастатином или правастатином), причем последний обладает гиполипидемическим действием и благодаря этому повышает гиполипидемические свойства Na⁺/Н ⁺-ингибитора формулы I, является благоприятной комбинацией с усиленным действием и уменьшенным использованием активного ингредиента.

Заявляется также использование ингибиторов натрий-протонного обмена формулы I в качестве новых лекарственных средств для снижения повышенных уровней липидов в крови, а также комбинации ингибиторов натрий-протонного обмена с понижающими кровяное давление и/или гиполипидемически действующими лекарственными средствами.

Кроме того, заявляется использование ингибиторов натрий-протонного обмена формулы I, а также комбинации ингибиторов натрий-протонного обмена с понижающими кровяное давление лекарственными средствами, в частности, с АСЕ-ингибиторами (например, рамиприлом), а также с антагонистами рецепторов ангиотензина (например, лозартаном) в качестве новых лекарственных средств для лечения CHF.

Лекарственные средства, которые содержат соединение I, могут при этом вводиться перорально, парентерально, внутривенно, ректально или путем ингаляции, причем предпочтительное введение зависит от картины проявления заболевания. Соединения I могут быть использованы отдельно или вместе с галеновыми добавками (вспомогательными веществами), как в ветеринарии, так и в медицине.

Специалисту в данной области известно, какие вспомогательные вещества пригодны для желаемых препаративных форм лекарственного средства. Наряду с растворителями, гелеобразующими агентами, основами для суппозиториев, добавками для таблеток и другими носителями активных ингредиентов могут использоваться, например, антиоксиданты, диспергирующие агенты, эмульгаторы, пеногасители, улучшающие вкус агенты, консерванты, солюбилизирующие агенты или красители.

Для пероральной формы применения активные соединения смешивают с подходящими добавками, такими как носители, стабилизаторы или инертные разбавители, и при помощи обычных способов готовят в виде удобных форм применения, таких как таблетки, драже, разъемные капсулы, водные, спиртовые или масляные растворы. В качестве инертных носителей могут быть использованы, например, аравийская камедь, магнезия, карбонат магния, фосфат калия, молочный сахар, глюкоза или крахмал, в особенности кукурузный крахмал. При этом форма приготовления может использовать как сухой, так и увлажненный гранулят. В качестве масляных носителей или в качестве растворителей рассматриваются, например, растительные или животные масла, такие как подсолнечное масло или рыбий жир.

Для подкожного или внутривенного введения активные соединения, если желательно, с обычными для этого веществами, такими как солюбилизирующие агенты, эмульгаторы или дополнительные добавки, готовят в виде раствора, суспензии или эмульсии. В качестве растворителя рассматриваются, например, вода, физиологический раствор хлорида натрия или спирты, например этанол, пропанол, глицерин, наряду с ними, также растворы сахаров, такие как растворы глюкозы или маннита, или также смесь из различных указанных растворителей.

В качестве фармацевтической препаративной формы для введения в виде аэрозолей или спреев пригодны, например, растворы, суспензии или эмульсии активного ингредиента формулы I в фармацевтически приемлемом растворителе, таком как этанол или вода, или смеси таких растворителей. Готовая препаративная форма может также содержать, по мере необходимости, и другие фармацевтические вспомогательные вещества, такие как поверхностно-активные вещества, эмульгаторы и стабилизаторы, такие как газ-носитель. Такая препаративная форма содержит обычно активное вещество в концентрации приблизительно 0,1-10, в частности, приблизительно 0,3-3 масс.%.

Дозы вводимого активного ингредиента формулы I и частота введения зависят от силы действия и продолжительности применяемых соединений; кроме того, также от типа и тяжести подлежащей лечению болезни, а также от пола, возраста, массы и индивидуальной реакции подлежащих лечению млекопитающих.

В среднем суточная доза соединения формулы I в случае пациента с массой приблизительно 75 кг составляет по меньшей мере минимально 0,001мг/кг, предпочтительно 0,01мг/кг и максимально до 10 мг/кг, предпочтительно максимально до 1 мг/кг массы тела. При острых вспышках заболевания, хотя бы сразу же после наступления сердечного инфаркта, могут быть необходимыми также еще более высокие и, прежде всего, более частые введения доз, хотя бы до 4 отдельных доз в сутки, в особенности при внутривенном введении, например, в случае пациента с инфарктом в отделении интенсивной терапии могут быть необходимыми дозы до 200 мг в сутки на кг массы тела.

Перечни сокращений:

DIPEA	диизопропилэтиламин
ДМА	N,N-диметилацетамид
ДМЭ	1,2-диметоксиэтан
ДМФ	N,N-диметилформамид
ЭА	этилацетат (EtOAC)
экв.	эквивалент
МеОН	метанол
Pd(dppf)2	комплекс (1:1) [1,1'-бис(дифенилфосфино)ферроцен]палладий (II)-метиленхлорид
Smp (т.пл.)	точка плавления
ТГФ	тетрагидрофуран

Экспериментальная часть

Общая методика синтеза дигидротиафенантренкарбонилгуанидинов

Стадия 1) Метиловый эфир 4-бром-5-хлорсульфонил-2-метилбензойной кислоты 12г 4-бром-5-хлорсульфонил-2-метилбензойной кислоты (J. Med. Chem. 1997, 40, 2017) кипятили с 20 мл тионилхлорида в течение 8часов с обратным холодильником. Избыточный тионилхлорид удаляли в вакууме на роторном испарителе, остаток помещали в приблизительно 50 мл сухого толуола и еще раз упаривали. Неочищенный хлорангидрид кислоты растворяли в 25 мл безводного толуола, добавляли 1,7 мл МеОН и перемешивали в течение 2 часов при 50°С. Затем добавляли дополнительное количество 1,7 мл МеОН и перемешивали еще в течение 4 часов при 50°С. Реакционную смесь разбавляли 200 мл ЭА и промывали 100 мл насыщенного водного раствора NaHCO ₃. Сушили над Na₂SO ₄ и растворители удаляли в вакууме. Получали 11,0 г бледно-желтого масла, которое использовали без дополнительной очистки.

Стадия 2) 2-бром-5-метоксикарбонил-4-метилбензолсульфиновая кислота

550 мг Na₂SO₃ растворяли в 2 мл воды и при 70°С добавляли по каплям раствор 337 мг метилового эфира 4-бром-5-хлорсульфонил-2-метилбензойной кислоты в 2 мл ДМЭ. Во время прикапывания раствор становился слабокислым (рН 5). Раствор перемешивали в течение 2,5 часов при 70°С, оставляли охлаждаться и доводили водным раствором HCl до рН 1,2. Раствор разбавляли 50 мл ЭА и промывали 50 мл насыщенного водного раствора NaCl. Сушили над Na ₂SO₄ и растворители удаляли в вакууме. Получали 228 мг бледно-желтого масла, которое использовали без дополнительной очистки.

Стадия 3) Метиловый эфир 4-бром-5-(2-бромфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты

150мг (0,51ммоль) 2-бром-5-метоксикарбонил-4-метилбензолсульфиновой кислоты (стадия 2) растворяли в 1,5 мл ДМФ. К раствору добавляли 128мг (0,51ммоль) 2-бромбензилбромида в 0,5 мл ДМФ и 0,1 мл (0,56 ммоль) DIPEA и оставляли при комнатной температуре на 16 часов при удалении влаги. Реакционный раствор фильтровали, разбавляли 20 мл ЭА, промывали 20 мл 1н соляной кислоты и затем 20мл 5%-ного раствора хлорида натрия. Органическую фазу прессовали через сушильный картридж (безводный сульфат натрия), картридж промывали 5мл ЭА. Фильтрат упаривали. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ.

Согласно общему уравнению реакции

получали аналогично следующие продукты:

№	Бензилбромид	Продукт
2	1-бром-2-(бромметил)нафталин	метиловый эфир 4-бром-5-(1-бромнафталин-2-илметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты
3	2-бром-4-метилбензилбромид	метиловый эфир 4-бром-5-(2-бром-4-метилфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты
4	1-бром-2-бромметил-4-хлорбензол	метиловый эфир 4-бром-5-(2-бром-5-хлорфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты
5	2-бром-1-бромметил-4-фторбензол	метиловый эфир 4-бром-5-(2-бром-4-фторфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты
6	1-бром-2-бромметил-3-фторбензол	метиловый эфир 4-бром-5-(2-бром-6-фторфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты
7	2-бром-1-бромметил-4-хлорбензол	метиловый эфир 4-бром-5-(2-бром-4-хлорфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты
8	1-бром-2-бромметил-4-метоксибензол	метиловый эфир 4-бром-5-(2-бром-5-метоксифенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты
9	1-бром-2-бромметил-3-хлорбензол	метиловый эфир 4-бром-5-(2-бром-6-хлорфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты
10	2-бром-1-бромметил-3-метилбензол	метиловый эфир 4-бром-5-(2-бром-3-метилфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты
11	1-бром-2-бромметил-4-метилбензол	метиловый эфир 4-бром-5-(2-бром-5-метилфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты

Применяемые бензилбромиды, поскольку они не являются коммерчески доступными, получали либо из соответствующих метилароматических соединений радикальным бромированием посредством N-бромсукцинимида либо из бензиловых спиртов путем взаимодействия с водным HBr или смесью хлорангидрид метансульфоновой кислоты/триэтиламин с последующим добавлением тетрабутиламмонийбромида.

Неочищенные продукты перемешивали со смесью ацетонитрил/вода = 9:1 (1 мл) в некоторых случаях при добавлении 0,2мл ДМФ, отсасывали через картридж и промывали смесью ацетонитрил/вода = 9:1 (0,5мл). Выпавшие в осадок твердые вещества сушили в вакуумном сушильном шкафу при 50°С, и чистота была >80% согласно ВЭЖХ/МС. Маточный раствор очищали препаративной ВЭЖХ, так как он еще содержал большую долю продукта.

Стадия 4) Метиловый эфир 6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиа-фенантрен-7-карбоновой кислоты

68мг (0,266ммоль) бис(пинаколато)дибора, 71мг (0,725 ммоль) ацетата калия и 9 мг (0,012 ммоль) Pd(dppf) ₂ помещали в 2 мл ДМА. Добавляли 112 мг (0,242 ммоль) метилового эфира 4-бром-5-(2-бромфенилметансульфонил)-2-метилбензойной кислоты (стадия 3), растворенной в 4 мл ДМА, и перемешивали при 80°С в течение ночи под защитным газом. Реакционный раствор фильтровали через силикагель и промывали 20 мл ЭА. Органическую фазу промывали водой и 5%-ным раствором хлорида натрия, сушили над безводным сульфатом натрия и упаривали в вакууме. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ.

Согласно общему уравнению реакции

получали аналогично следующие продукты:

№	Продукт
2	Метиловый эфир 2-метил-5,5-диоксо-5,6-дигидро-5-тиабензо[c]фенантрен-3-карбоновой кислоты
3	Метиловый эфир 3,6-диметил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбоновой кислоты
4	Метиловый эфир 2-хлор-6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбоновой кислоты
5	Метиловый эфир 3-фтор-6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбоновой кислоты
6	Метиловый эфир 1-фтор-6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбоновой кислоты
7	Метиловый эфир 3-хлор-6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбоновой кислоты
8	Метиловый эфир 2-метокси-6-метил-9,9-диоксо-9,10- дигидро-9-тиафенантрен-7-карбоновой кислоты
9	Метиловый эфир 1-хлор-6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбоновой кислоты
10	Метиловый эфир 4,6-диметил-9,9-диоксо-9,10-дигидро- 9-тиафенантрен-7-карбоновой кислоты
11	Метиловый эфир 2,6-диметил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбоновой кислоты

Стадия 5) Дигидротиафенантренкарбонилгуанидины, общая методика

53 мг (0,5 ммоль) трет-бутилата калия суспендировали в 2 мл сухого ДМФ. К суспензии добавляли 50 мг (0,55 ммоль) гуанидин гидрохлорида и перемешивали эту суспензию при выведении влаги в течение 30 минут при комнатной температуре. После этого добавляли 0,1 ммоль метилового эфира со стадии 4, растворенного в 1 мл ДМФ, и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Выпавшие в осадок соли отфильтровывали и фильтрат очищали сразу же путем препаративной ВЭЖХ (материал колонки Merck Supersphere RP18e, градиент смеси ацетонитрил/вода с 0,1% муравьиной кислотой в качестве буфера). Полученные продукты характеризовали с использованием аналитической ВЭЖХ/МС на установке Agilent Serie 1100. Детектирование массы проводили с использованием положительной ионизации.

Способ А:

Колонка: Merck LiChroCart 55-2

Загрузка: PuroSpher STAR RP18

Скорость тока: 0,75 мл/мин

Температура: 40°С

Градиент:

Растворитель А: Ацетонитрил/вода (90:10)+0,5% муравьиная кислота

Растворитель В: Ацетонитрил/вода (10:90)+0,5% муравьиная кислота

Время [мин]	Растворитель В [%]
0,00	95,0
0,50	95,0
1,75	5,0
4,25	5,0
4,50	95,0
5,00	95,0
6,20	СТОП

Способ В:

Колонка: YMC J'Sphere ODS H80

Загрузка: 4 мкл

Скорость тока: 1,0 мл/мин

Температура: 30°С

Градиент:

Растворитель А: /вода + 0,05% трифторуксусная кислота

Растворитель В: Ацетонитрил

Время [мин]	Растворитель В [%]
0,00	10,0
2,50	95,0
3,30	95,0
3,35	10,0
3,60	СТОП

Согласно общей методике синтеза дигидротиафенантренкарбонилгуанидинов синтезировали соединения, указанные в заголовках примеров 1-11:

Пример:N-(6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 330 (М+1) ⁺, время удерживания 2384 мин (220 нм, способ А)

Пример:N-(2-метил-5,5-диоксо-5,6-дигидро-5-тиабензо[c]фенантрен-3-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 380 (М+1) ⁺, время удерживания 1793 мин (220 нм, способ В)

Пример:N-(3,6-диметил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 344 (М+1) ⁺, время удерживания 2411 мин (220 нм, способ А)

Пример: N-(2-хлор-6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 364 (М+1) ⁺, время удерживания 2390 мин (220 нм, способ А)

Пример: N-(3-фтор-6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 348 (М+1) ⁺, время удерживания 2215 мин (220 нм, способ А)

Пример:N-(1-фтор-6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 348 (М+1) ⁺, время удерживания 2218 мин (220 нм, способ А)

Пример 7: N-(3-хлор-6-метил)-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 364 (М+1) ⁺, время удерживания 2394 мин (220 нм, способ А)

Пример 8: N-(2-метокси-6-метил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 360 (М+1) ⁺, время удерживания 2271 мин (220 нм, способ А)

Пример:N-(1-хлор-6-метил)-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 364 (М+1) ⁺, время удерживания 2358 мин (220 нм, способ А)

Пример:N-(4,6-диметил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 344 (М+1) ⁺, время удерживания 2302 мин (220 нм, способ А)

Пример:N-(2,6-диметил-9,9-диоксо-9,10-дигидро-9-тиафенантрен-7-карбонил)гуанидинийформиат

МС (электрораспыление): 344 (М+1) ⁺, время удерживания 2671 мин (220 нм, способ А)

Способ NHE-ингибирования Jansen

IC₅₀ [нМ] ингибирования NHE-1 (Na⁺/H ⁺ обмен 1) определяли следующим образом:

FLIPR-тест для определения ингибиторов NHE-1 посредством измерения рН _i-восстановления в трансфицированных клеточных линиях, которые экспрессировали NHE-1 человека

Этот тест проводили в FLIPR (планшет-ридере флуоресцентного изображения) с имеющими черные стенки 96-луночными микротитрационными планшетами с прозрачным дном. Трансфицированные клеточные линии, которые экспрессировали различные подтипы NHE (исходная клеточная линия LAP-1 [полученная от профессора Pouyssegur, Nizza] вследствие мутагенеза и последующего отбора не обнаруживает NHE-активности), помещают накануне теста при плотности ˜25000 клеток на лунку.

[Среда для выращивания трансфицированных клеток (Исков + 10% фетальная телячья сыворотка) содержит дополнительно G418 в качестве антибиотика для отбора, для точного установления присутствия трансфицированных последовательностей].

Собственно тест начинается с удаления среды для выращивания и добавления 10 мкл на лунку загрузочного буфера (5 мкМ BCECF-AM [ацетоксиметилового эфира 2',7'-бис(карбоксиэтил)-5-(и-6)-карбоксифлуоресцеина] в 20 мМ NH₄Cl, 115 мМ холинхлориде, 1 мМ MgCl₂, 1 мМ CaCl₂ , 5 мМ KCl, 20 мМ HEPES, 5 мМ глюкозе; рН 7,4 [с доведением при помощи КОН]). Клетки инкубируют после этого в течение 20 минут при 37°С. Инкубирование приводит к загрузке клеток флуоресцирующим красителем, интенсивность флуоресценции которого зависит от рН _i, и NH₄Cl, который приводит к слабому подщелачиванию клеток.

[Нефлюоресцирующий предшественник красителя BCECF-AM способен в виде сложного эфира проникать через мембрану. Внутри клеток под действием эстераз высвобождается собственно краситель BCECF, который не проникает через мембрану].

После 20-минутной инкубации загрузочный буфер, который содержит NH₄Cl и свободный предшественник BCECF-AM, удаляют трехкратным промыванием в устройстве для промывания клеток (Tecan Columbus) в каждом случае 400 мкл промывочного буфера (133,8 мМ холинхлорид, 4,7 мМ KCl, 1,25 мМ MgCl ₂, 1,25 мМ CaCl₂, 0,97 мМ К ₂НРО₄, 0,23 мМ KH ₂PO₄, 5 мМ HEPES, 5 мМ глюкоза; рН 7,4 [с доведением при помощи КОН]). Оставшиеся в лунках остаточные объемы составляют 90 мкл (возможны объемы 50-125 мкл). Стадия промывки удаляет свободный BCECF-AM и приводит вследствие удаления наружных ионов NH₄ ⁺ к внутриклеточному подкислению (˜рН_i 6,3-6,4).

Поскольку равновесие внутриклеточного NH ₄ ⁺ с NH₃ нарушается удалением внеклеточного NH₄ ⁺ и последующим моментально начинающимся прохождением NH ₃ через мембрану клетки, процесс промывки приводит к тому, что внутриклеточный Н⁺ остается и является причиной внутриклеточного подкисления, которое может в конце концов привести к гибели клетки, если достаточно долго сохраняется. В этот момент важно, чтобы промывочный буфер не содержал натрия (<1 мМ), так как внеклеточные ионы натрия могли бы приводить к моментальному восстановлению рН_i за счет активности клонированных NHE-изоформ.

Важно также, чтобы все применяемые буферы (загрузочный буфер, промывочный буфер, буфер для восстановления) не содержали НСО₃ ^-ионов, так как присутствие бикарбоната привело бы к активации мешающих бикарбонат-зависимых систем регуляции pH_i, которые содержатся в исходной клеточной линии LAP-1.

Микротитрационные планшеты с подкисленными клетками переносят после этого (в пределах до 20 минут после подкисления) в планшет-ридер FLIPR. Во FLIPR внутриклеточный флуоресцентный краситель возбуждают светом с длиной волны 488нм, который производится аргоновым лазером, и измеряемые параметры (мощность лазера, время освещения и диафрагму (бленду) встроенной в FLIPR CCD-камеры) выбирают таким образом, чтобы средний сигнал флуоресценции на лунку находился между 30000 и 35000 относительных единиц флуоресценции.

Собственно измерение в FLIPR начинается с того, что управляемое программное обеспечение будет делать один снимок CCD-камерой через каждые 2 точки. Спустя десять секунд проводят восстановление внутриклеточных рН добавлением 90 мкл буфера для восстановления (133,8 мМ NaCl, 4,7 мМ KCl, 1,25 мМ MgCl₂, 1,25 мМ CaCl₂ , 0,97 мМ К₂НРО₄, 0,23 мМ KH₂PO₄, 10 мМ HEPES, 5 мМ глюкоза; рН 7,4 [с доведением при помощи КОН]) при помощи встроенного во FLIPR 96-луночного устройства для пипетирования.

В качестве положительных контролей (100% NHE-активность) служат лунки, в которые добавляют чистый буфер для восстановления, отрицательные контроли (0% NHE-активность) содержат промывочный буфер. Во все другие лунки добавляют буфер для восстановления с концентрированным в 2 раза тест-соединением. Измерение в FLIPR заканчивают через 60 точек измерения (две минуты).

Необработанные данные вводят в программу ActivityBase. При помощи этой программы сначала рассчитывают NHE-активности для каждой испытуемой концентрации соединения и из них IC₅₀-показатели для этих соединений. Поскольку ход восстановления рН _i не во время всего эксперимента является линейным, но снижается в конце в результате уменьшающейся NHE-активности, важно выбрать для оценки измерения ту часть, в которой увеличение флуоресценции положительных контролей является линейным.

Пример	IC 50 ингибирования NHE-1
1	15,6
2	24,2
3	8,6
4	10,8
5	15,6
6	16,5
7	11,7
8	10,2
9	13,9
10	67,7
11	19,5