синергическая фармацевтическая композиция для лечения лейкемии

Формула изобретения

1. Синергическая фармацевтическая композиция для лечения острого и хронического миелоидного лейкоза и лимфоидного лейкоза у животных и человека, причем указанная композиция содержит эффективное количество хлорогенной кислоты (ХК) и 3-орто-пара-кумарилхинной кислоты (PCQ), выделенных из любых частей растения Piper betel и фармацевтически приемлемые добавки.

2. Композиция по п.1, где добавка выбрана из группы, состоящей из питательных веществ, таких как белки, углеводороды, сахара, тальк, стеарат магния, целлюлоза, карбонат кальция, крахмально-желатиновая паста и/или фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов, разбавителей или растворителей.

3. Композиция по п.1, в которой соотношение между ХК и PCQ, присутствующими в композиции, находится в диапазоне от 1:1 до 1:10, что эффективно для лечения лимфоидного лейкоза.

4. Композиция по п.1, где указанную композицию вводят перорально, внутривенно, внутримышечно или подкожно.

5. Композиция по п.1, причем указанную композицию вводят в дозе в диапазоне от 1 до 50 мг/кг массы тела/день по меньшей мере в течение периода в 4 нед.

6. Композиция по п.1, которую вводят в течение периода в диапазоне от 4 до 12 недель.

7. Композиция по п.1, которая обеспечивает ингибирование роста 2×10 ⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток К562 до 20% при дозе ХК 25 мкг/мл.

8. Композиция по п.1, которая обеспечивает ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток К562 до 4% при дозе PCQ 25 мкг/мл.

9. Композиция по п.1, которая обеспечивает ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток К562 до 44% при содержании каждого из КХ и PCQ по 25 мкг/мл.

10. Композиция по п.1, которая обеспечивает ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток U937 до 16,67% при дозе ХК 25 мкг/мл.

11. Композиция по п.1, которая обеспечивает ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток U937 до 2,08% при дозе PCQ 25 мкг/мл.

12. Композиция по п.1, которая обеспечивает ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток U937 до 50% при содержании каждого из КХ и PCQ по 25 мкг/мл.

13. Композиция по п.1, которая обеспечивает ингибирование роста 2×10 ⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий лейкемических клеток ХМЛ до 2,38% при дозе ХК 25 мкг/мл.

14. Композиция по п.1, которая обеспечивает ингибирование роста 2×10 ⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий лейкемических клеток ХМЛ до 2,38% при дозе PCQ 25 мкг/мл.

15. Композиция по п.1, которая обеспечивает ингибирование роста 2×10 ⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий лейкемических клеток ХМЛ до 20,3% при содержании каждого из КХ и PCQ по 25 мкг/мл.

16. Применение композиции по п.1 для лечения острого и хронического миелоидного лейкоза (ОМЛ и ХМЛ) и лимфоидного лейкоза у пациента, нуждающегося в таком лечении, путем введения указанному субъекту терапевтически эффективного количества указанной композиции.

17. Применение по п.16, при котором и КХ, и PCQ выделены из любых частей растения Piper betel.

18. Применение по п.16, при котором субъект выбран из млекопитающих, предпочтительно является человеком.

19. Применение по п.16, при котором добавка выбрана из группы, состоящей из питательных веществ, таких как белки, углеводороды, сахара, тальк, стеарат магния, целлюлоза, карбонат кальция, крахмально-желатиновой пасты, и/или фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов, разбавителей или растворителей.

20. Применение по п.16, при котором соотношение между ХК и PCQ, присутствующими в композиции, находится в диапазоне от 1:1 до 1:10, что эффективно для лечения лимфоидного лейкоза.

21. Применение по п.16, при котором указанную композицию вводят перорально, внутривенно, внутримышечно или подкожно.

22. Применение по п.16, при котором указанную композицию вводят в дозе от 1 до 50 мг/кг массы тела по меньшей мере 1 раз в день в течение периода 4 недели.

23. Применение по п.16, при котором указанную композицию вводят в течение периода от 4 до 3 месяцев.

24. Применение по п.16, при котором обеспечивается ингибирование роста 2×10⁶ /мл/лунок клеток лейкозных линий типа клеток К562 до 20% при дозе ХК 25 мкг/мл.

25. Применение по п.16, при котором обеспечивается ингибирование роста 2×10⁶ /мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток К562 до 4% при дозе PCQ 25 мкг/мл.

26. Применение по п.16, при котором обеспечивается ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток К562 до 44% при содержании каждого из КХ и PCQ по 25 мкг/мл.

27. Применение по п.16, при котором обеспечивается ингибирование роста 2×10 ⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток U937 до 16,67% при дозе ХК 25 мкг/мл.

28. Применение по п.16, при котором обеспечивается ингибирование роста 2×10⁶ /мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток U937 до 2,08% при дозе PCQ 25 мкг/мл.

29. Применение по п.16, при котором обеспечивается ингибирование роста 2×10⁶ /мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток U937 до 50% при содержании каждого из КХ и PCQ по 25 мкг/мл.

30. Применение по п.16, при котором обеспечивается ингибирование роста 2×10 ⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий лейкемических клеток ХМЛ до 2,38% при дозе ХК 25 мкг/мл.

31. Применение по п.16, при котором обеспечивается ингибирование роста 2×10 ⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий лейкемических клеток ХМЛ до 2,38% при дозе PCQ 25 мкг/мл.

32. Применение по п.17, при котором обеспечивается ингибирование роста 2×10 ⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий лейкемических клеток ХМЛ до 20,3% при содержании каждого из КХ и PCQ по 25 мкг/мл.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Данное изобретение относится к лечению острого и хронического миелоидного лейкоза (ОМЛ и ХМЛ), а также лимфоидного лейкоза хлорогенной кислотой (ХК), выделенной из экстракта листьев Piper betel. Миелоидный лейкоз, и острый (ОМЛ), и хронический (ХМЛ), и лимфоидный лейкоз являются смертельными, нет препарата, направленного на разрушение лейкозных клеток, и такие клетки плохо реагируют на химиотерапию, которая всегда неспецифична и, таким образом, неблагоприятно влияет на нормальные клетки. Уникальным свойством лечения компонентом Piper betel (хлорогенной кислотой) является уничтожение миелоидных раковых клеток и лимфоидных раковых клеток и отсутствие воздействия на нормальные клетки.

Предпосылки изобретения и предшествующий уровень техники

Миелоидный лейкоз обычно подразделяют на 2 группы: острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) и хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ). ОМЛ характеризуется увеличением количества миелоидных клеток в костном мозге и прекращением их созревания. В США ежегодная заболеваемость ОМЛ составляет приблизительно 2,4 на 100000, и она прогрессивно увеличивается с возрастом до пика 12,6 на 100000 взрослых людей в возрасте 65 лет или старше. ХМЛ представляет собой злокачественное клональное расстройство гемопоэтических стволовых клеток. Средний возраст проявления [заболевания] составляет 53 года, но оно возникает во всех возрастных группах, включая детей. Естественное течение ХМЛ представляет собой прогрессирование из хронической доброкачественной фазы в быстро оборачивающийся фатальным бластный криз в пределах 3-5 лет или даже раньше. Прогноз ХМЛ также неблагоприятный, несмотря на большие достижения клинической медицины [1]. CD33 представляет собой специфический и полезный маркер в процессе дифференцировки миелоидных клеток [2]. Последние сообщения свидетельствуют о том, что связывание CD33 моноклональным антителом вызывало апоптоз, ведущий к ингибированию роста и пролиферации клеток ОМЛ и ХМЛ in vitro [2, 3]. С использованием специфичной для миелоидных клеток экспрессии CD33 гуманизированное моноклональное тело против CD33, конъюгированное с противораковым препаратом, было со значительным успехом испытано у пациентов с ОМЛ [4]. Аналогичным образом, лимфоидный лейкоз также подразделяется на 2 группы: острый лимфоцитарный лейкоз (ОЛЛ) и хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ). Лимфоидный лейкоз может воздействовать на дифференцировку и в Т-, и в В-клеточном направлении, и он преобладает у детей. Антимиелоидная активность экстрактов из листьев Piper betel заявлялась ранее (поданная патентная заявка № РСТ/IN00/00118 от 18 декабря 2000 г.), и 3-орто-пара-кумарилхинная кислота, активный фактор для лечения ОМЛ и ХМЛ, была заявлена 30.05.2002 г в предварительной патентной заявке № 60/384,163 (299/NF/2002).

Следовательно, ранее полученные данные заявителя прямо согласуются с поданной в настоящее время заявкой на патент по хлорогенной кислоте (ХК), выделенной из фракций экстрактов листа бетеля для лечения острого и хронического миелоидного лейкоза и лимфоидного лейкоза. Известно, что хлорогенная кислота обладает антиаллергической активностью [5]. ХК также ингибирует глюкозо-6-фосфатные системы печени и почек [6]. ХК представляет собой ингибитор активности эпидермальной липоксигеназы и вызванного тканевым активатором плазминогена (ТАП, ТРА) ушного воспаления (7). ХК также оказывает ингибирующие эффекты на вызванное ТАП содействие распространению опухоли в коже мышей [7]. Сообщалось также об активности ХК против ВИЧ [8]. Хотя ингибирование содействия распространению опухоли относили на счет ХК, не было сообщений о противоопухолевой активности ХК в отношении развившихся опухолей, включая противолейкозную активность. В настоящей патентной заявке впервые заявлена противолейкозная активность и противоопухолевая активность ХК.

Листья Piper betel имеют сильный, едкий, ароматический запах и вкус и широко используются в Индии в качестве жвачки. В целом, для жевания используются созревшие или перезревшие листья, которые перестали расти, но еще не стали хрупкими. Основной препарат, предназначенный для жевания, состоит из листа бетеля, смазанного гидрированным лаймом и катечу, к которому добавляют соскребаемую мякоть ореха арека; ароматизаторы, такие как стружка кокосовых орехов, гвоздика, кардамон, фенхель, порошкообразный солодковый корень, мускатный орех, а также табак используются по вкусу. В некоторых местах изготовленный препарат листа Piper betel покрыт серебряной или золотой пленкой. В качестве жвачки, он имеет множество благоприятных свойств: онароматен, способствует пищеварению, оказывает стимулирующее действие на пищеварение и способствует отхождению газов. По медицинским показаниям его можно использовать при катарральных и легочных инфекциях; его также применяют в качестве припарок. Воздействие жевания листьев бетеля с орехом арека и другими добавками заключается в возбуждении слюнных желез и раздражении слизистой оболочки ротовой полости. Создаваемое красное окрашивание вызвано пигментом в орехе арека, которое проявляется под действием щелочи лайма и катечу. Создается незначительная степень стимуляции, которая, кроме придания приятного запаха, приводит к ощущению теплоты и благополучия. Самым важным фактором, определяющим ароматическую ценность листа, является количество и особенно природа присутствующего основного масла. Листья бетеля из различных регионов имеют различный запах и вкус. Самым острым является тип Санчи, в то время как самые мягкие и сладкие листья происходят из области Варанаси.

Листья бетеля содержат основные масла, содержание масел варьирует от 0,7 до 2,6%, в зависимости от разновидностей листьев. Масло состоит из фенолов и терпенов. Чем выше пропорция фенольного масла, тем лучше качество. Изомер эвгенола, называемый чавибетолом (фенол бетеля; 4-алкил-2-гидрокси-1-метоксибензол), считают характерным ингредиентом масла бетеля. Масло бетеля индийского типа содержит в качестве преобладающего фенольный ингредиент и используется при лечении различных респираторных заболеваний либо в виде местного нанесения, либо в виде полоскания для горла. Оно обладает свойствами, способствующими отхождению газов. Оно проявляет различные виды действия на центральную нервную систему млекопитающих. Основное масло и экстракты листьев обладают активностью против нескольких грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, таких как Micrococcus pyogenes var. Albus, Bacillus subtilis и B. Megaterium, Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Salmonella typhosa, Vibrio comma, Shigella dysenteriae, Proteus vulgaris, Pdseudomonas solanacaerum, Sarcina lutea и Erwinia carotorora. Основное масло и экстракты листьев также проявили противогрибковую активность против Asperigillus niger и A. Oryzae, Curvularia lunata и Fusarium oxysporum. Обнаруживается, что масло оказывает летальное воздействие на простейших Paramaeceum caudatum приблизительно через 5 мин контакта [5]. Паровой дистиллят листьев проявил активность против Mycobacterium tuberculosis.

Ссылки

1. Sawyer CL, The New England Journal of Medicine, 340(17): 1330-1340,1999.

2. Vitale, C; Romagnani, C, et al., Proc. Natl. Acd. Sci. USA, 96(26):15091-15096, 1999.

3. Vitale, C et al., Proc. Natl. Acd. Sci, USA., 98 (10): 5764-5769, 2001.

4. Sievers EL, Appelbaum, FR et al., Blood, 93: 3678-3684, 1999.

5. Ito H, Miyazaki T, Ono M and Sakurai H. Bioorg. Med. Chem. 6(7): 1051-1056, 1998.

6. Arion WJ et. al. Arch. Biochem. Biophys. 351(2): 279-285, 1998.

7. Conney AH et. al. Adv.Enzyme Regul. 31: 385-396, 1991.

8. Supriyatna G et. al. Phytomedicine, 7 (Suppl.II): 87, 2000.

Цели изобретения

Основной целью изобретения является предоставление нового применения соединения хлорогенной кислоты, выделенного из экстракта листьев Piper betel или из любых других источников,для лечения острого и хронического миелоидного лейкоза и лимфоидного лейкоза.

Другой целью изобретения является предоставление новой фармацевтической композиции, включающей в себя носитель, наряду с соединением хлорогенной кислоты, для лечения острого и хронического миелоидного лейкоза и лимфоидного лейкоза.

Еще одной целью изобретения является предоставление способа выделения активной фракции из листьев или любых других частей растения Piper betel для лечения ОМЛ, ХМЛ и лимфоидного лейкоза.

Еще одной целью изобретения является предоставление упрощенного способа выделения активной фракции из всех частей растения Piper betel, обладающих видами биологической активности, релевантными для лечения ОМЛ, ХМЛ и лимфоидного лейкоза.

Еще одной целью изобретения является предоставление травяного продукта из листьев или любых других частей растения Piper betel для лечения ОМЛ, ХМЛ и лимфоидного лейкоза.

Еще одной целью изобретения является предоставление травяной хлорогенной кислоты из листьев Piper betel для лечения ОМЛ, ХМЛ и лимфоидного лейкоза.

Еще одной целью изобретения является предоставление способа получения экстракта из листьев или любых других частей растения Piper betel для лечения ОМЛ, ХМЛ и лимфоидного лейкоза.

Еще одной целью изобретения является предоставление упрощенного способа получения экстракта из листьев или любых других частей растения Piper betel для лечения ОМЛ, ХМЛ и лимфоидного лейкоза.

Еще одной целью изобретения является предоставление способа получения хлорогенной кислоты из листьев Piper betel для лечения ОМЛ, ХМЛ и лимфоидного лейкоза.

Еще одной целью изобретения является предоставление травяной хлорогенной кислоты, очищенной из листьев или любых других частей растения Piper betel, для лечения солидных опухолей, включая лимфомы.

Еще одной целью изобретения является предоставление новых способов применения хлорогенной кислоты (выделенной их любого источника или полученной синтетически) для лечения острого и хронического миелоидного лейкоза, лимфоидного лейкоза и солидных опухолей, включая лимфомы.

Сущность изобретения

Соответственно, настоящее изобретение связано с новым применением соединения хлорогенной кислоты, выделенного из экстракта листьев Piper betel или любых других источников для лечения острого и хронического миелоидного лейкоза и лимфоидного лейкоза. Кроме того, настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для лечения острого и хронического миелоидного лейкоза у животных и человека, причем указанная композиция включает в себя эффективное количество хлорогенной кислоты (ХК) и/или 3-орто-пара-кумарилхинной кислоты (PCQ), выделенных из любых частей растения Piper betel или любого другого естественного или синтетического источника, и фармацевтически приемлемые добавки.

Подробное описание изобретения

Соответственно, настоящее изобретение предоставляет фармацевтическую композицию для лечения острого и хронического миелоидного лейкоза у животных и человека, причем указанная композиция включает в себя эффективное количество хлорогенной кислоты (ХК) и/или 3-орто-пара-кумарилхинной кислоты (PCQ), выделенных из любых частей растения Piper betel или любого другого естественного или синтетического источника, и фармацевтически приемлемые добавки.

В одном варианте реализации изобретения добавка выбрана из группы, состоящей из питательных веществ, таких как белки, углеводороды, сахара, тальк, стеарат магния, целлюлоза, карбонат кальция, крахмально-желатиновая паста, и/или фармацевтически приемлемых носителей, эксципиентов, разбавителей или растворителей.

В другом варианте реализации соотношение между ХК и PCQ, присутствующими в композиции, находится в диапазоне от 1:0 до 1:10, что эффективно для лечения солидных опухолей, включая лимфомы.

В еще одном варианте реализации указанную композицию вводят перорально, внутривенно, внутримышечно или подкожно.

В еще одном варианте реализации композицию вводят в дозе от 1 до 50 мг/кг массы тела/день по меньшей мере в течение периода 4 нед.

В еще одном варианте реализации композицию вводят в течение периода от 4 нед до 12 нед.

В еще одном варианте реализации ингибирование роста 2×10 ⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток К562 составляет до 20% при дозе ХК 25 мкг/мл.

В еще одном варианте реализации ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток К562 составляет до 4% при дозе PCQ 25 мкг/мл.

В еще одном варианте реализации ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток К562 составляет до 44% при содержании каждого из КХ и PCQ по 25 мкг/мл.

В еще одном варианте реализации ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток U937 составляет до 16,67% при дозе ХК 25 мкг/мл.

В еще одном варианте реализации ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток U937 составляет до 2,08% при дозе PCQ 25 мкг/мл.

В еще одном варианте реализации ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий типа клеток U937 составляет до 50% при содержании каждого из КХ и PCQ по 25 мкг/мл.

В еще одном варианте реализации ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий лейкемических клеток ХМЛ составляет до 2,38% при дозе ХК 25 мкг/мл.

В еще одном варианте реализации ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий лейкемических клеток ХМЛ составляет до 2,38% при дозе PCQ 25 мкг/мл.

В еще одном варианте реализации ингибирование роста 2×10⁶/мл/лунку клеток лейкозных линий лейкемических клеток ХМЛ составляет до 20,3% при содержании каждого из КХ и PCQ по 25 мкг/мл.

Еще один вариант реализации предоставляет собой применение композиции для лечения острого и хронического миелоидноголейкоза (ОМЛ и ХМЛ) и лимфоидного лейкоза путем введения фармацевтической композиции, включающей в себя эффективное количество хлорогенной кислоты (ХК) и/или 3-орто-пара-кумарилхинной кислоты (PCQ), выделенных из любых частей растения Piper betel или любого другого источника, и/или в комбинации с фармацевтически приемлемыми добавками.

Изобретение описано здесь ниже со ссылкой на примеры, которые являются лишь иллюстративными и никоим образом не должны трактоваться как ограничивающие диапазон настоящего изобретения.

Краткое описание сопровождающих чертежей

На Фиг.1 представлена ВЭЖХ фракции Е, со временем удерживания (ВУ) различных пиков, разделенных на 3 зоны, Z_A, Z _B и Z_C.

Фиг.1а. Пики были пронумерованы (в зоне Z_A имеется 4 основных пика, тогда как в зоне Z_B имеется 10 пиков, от очень маленьких до умеренных, и в зоне Z_C имеется 2 различных пика).

На Фиг.2 представлен острый одиночный пик.

На Фиг.3 представлена структура хлорогенной кислоты (ХК) или 3-каффеоилхинной кислоты.

На Фиг.4 представлены микрофотографии линий лейкозных клеток, клеток пациента с ХМЛ и мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) здорового донора после обработки ХК.

Пример 1:

Сбор растительного материала

Листья и другие части растения Piper betel собирают с вьющегося растения из различных областей Западной Бенгалии, Индия. Эталонный образец депонирован в Отделе химии лекарственных средств в Индийском институте химической биологии, 4 Raja S.C. Mullick Road, Kolkata-700 032.

Пример 2: Выделение соединения хлорогенной кислоты

4,7 кг свежесобранных листьев Piper betel промывают дистиллированной водой и затем разрезают на маленькие кусочки. Маленькие кусочки листьев собирают вместе, смешивают с 1,0 л дистиллированной воды и тщательно гомогенизируют в блендере для смешивания. Гомогенат пропускают через мелкую марлю, чтобы отфильтровать крупные частицы, и фильтрат собирают. Процесс повторяют 2-3 раза для получения максимального выхода. Объединенный фильтрат затем центрифугируют, собирают аликвоту прозрачного раствора и лиофилизируют до полутвердой массы, которая составляет приблизительно 110 г.

Собранный материал исследуют на биологическую активность, т.е. разрушение лейкозных клеток. После обнаружения положительной активности начинают очистку. 10 г указанного выше материала загружают на колонку Sephadex LH-20 и подвергают хроматографированию, используя воду, смесь вода-метанол (1:1) и метанол в качестве элюата. 3 различные фракции, полученные таким образом из трех различных систем растворителя, отдельно контролируют на наличие биологической активности. Активность локализуется только во фракции 2, т.е. метанол-вода (1:1), называемой фракцией Е. Фракцию Е затем подвергают анализу ВЭЖХ с использованием аналитической колонки ODS-3. Колонку уравновешивают смесью метанол-вода-уксусная кислота (23:76:1), скорость потока поддерживают на уровне 1,0 мл/мин, и пики идентифицируют при 280 нм. В соответствии со временем удерживания (ВУ), различные пики можно разделить на 3 зоны, Z_A, Z _B и Z_C (фиг.1). Зона Z _A содержит 4 основных пика, тогда как в зоне Z _B имеется 10 пиков, от очень маленьких до умеренных, и зона Z_C содержит 2 различных пика. Удобно наблюдать биологическую активность трех зон, Z _A, Z_B и Z_C, которые отдельно испытывают на лейкозных клетках для выявления деструктивной активности. Все 3 проявляют биологическую активность.

Можно отметить, что Z_C, которая имеет 2 различных пика, имеет время удерживания (R₁ ) 17,77 и 26,66 мин. Пик R₁ 17,77 мин демонстрирует значительную активность, и поэтому была определена его структура и подана заявка на патент (299/NF/2002; от 30 мая 2002 г.). Последний, т.е. пик R₁ 26,66 мин, не проявил никакой активности.

Зона Z_B содержит 10 пиков (от 1 до 10) различных размеров. Объединенная фракция пиков 1-10 продемонстрировала активность по уничтожению клеток. По этой причине все различные пики отдельно проконтролировали на наличие биологической активности. Основными пиками среди них были 2, 3, 4 и 8, соответствующие R₁, соответственно, составили 6,58, 7,14, 7,56 и 11,97 мин, и ни один из них не проявил активность. Следовательно, маленькие пики отдельно исследовали сбором повторных фракций для каждого из пиков для увеличения количества присутствующих в них активных молекул. Выявляли активность указанных пиков, т.е. 1, 5, 6, 7, 9 и 10, имеющих R₁, соответственно, 5,16, 8,34, 9,16, 9,86, 13,94 и 14,68 мин. За исключением пика 6 (R ₁ 9,16 мин), объединенные фракции лиофилизируют и повторно проводят ВЭЖХ; острый одиночный пик указывает на чистоту объединенной фракции (фиг.2). Ее затем подвергали ИК-, ЯМР- и Масс-спектральному анализу для определения структуры.

KBr ИК max cm -1:	3355(OH), 1689(CO), 1637, 1604 1522, 1443, 1286, 1189, 1121, 1082 1039, 975 и 854
1H-ЯМР (CD 3OD):	7,57(1H), 7,06(1H), 6,96(1H), 6,79(1H) 6,27(1H), 5,34(1H), 4,17(1H), 3,73(1H) и 2,13(4H)
13 C-ЯМР (CD3OD):	176,00, 167,65, 148,56, 146,08, 145,79, 126,78, 121,98, 115,46, 114,24, 75,11, 72,45, 70,96, 70,26, 37,75 и 37,19
FABMS m/z:	355(M++Н) и 377(М++Na)

Определяемая таким образом структура, как было показано, соответствует хлорогенной кислоте или 3-каффеоилхининной кислоте, с точкой плавления 205-206°С [ ]_D-33,25 (H₂ O) (фиг.3). Хлорогенная кислота имеется на рынке в чистом виде. Ее покупали и сравнивали с хлорогенной кислотой, выделенной из листьев Piper betel, и ясно показали, что имеющийся материал представляет собой хлорогенную кислоту.

Структура, ранее заявленная с целью получения патента, представляла собой 3-пара-кумарилхинную кислоту, которая проявляла разрушающую CD33+ миелоидные клетки, но не CD33- клетки активность, и это очень похоже на хлорогенную кислоту. За исключением дополнительной гидроксильной группы в положении С-3 ароматического кольца в хлорогенной кислоте, другие структуры являются в точности аналогичными. Поэтому можно предположить, что дополнительная активность хлорогенной кислоты в сравнении с 3-пара-кумарилхинной кислотой вызвана присутствием гидроксильной группы в положении С-3 ароматического кольца. Данное конкретное различие придало более широкую и сильную активность хлорогенной кислоте в разрушении и CD33-, и CD33+ клеток, а также лимфоидных лейкозных клеток.

Зона Z_A продемонстрировала биологическую активность. Она содержала 4 пика, 1, 2, 3 и 4, соответствующие R ₁, соответственно, 0,65, 1,32, 1,8 и 2,55. Поскольку выделение отдельного пика под Z_A затруднительно, нельзя определить локализацию связанной с пиком активности.

Пример 3:

Получение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) у пациентов с миелоидным лейкозом.

Цельную кровь (по 10 мл каждой пробы) берут у пациентов с ранее диагностированным миелоидным лейкозом, у одного пациента был диагностирован ОМЛ, а у другого - ХМЛ. Мононуклеарные клетки отделяют центрифугированием в градиенте плотности Ficoll/hypaque.

Пример 4:

Культура линии клеток эритролейкоза К562. Эту линию клеток берут из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), VA, USA. Данная линия клеток соответствует CD33-. Клетки К562 выращивают in vitro в среде RPMI-1640, содержащей 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки.

Пример 5:

Культура линии промоноцитарных клеток U937. Эту линию клеток получают из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), VA, USA, и выращивают in vitro, как описано для линии клеток К562. Данная линия клеток соответствует CD33+.

Пример 6:

Инкубация РВМС пациентов с миелоидным лейкозом в присутствии хлорогенной кислоты (ХК) in vitro.

РВМС (1×10 ⁵-2×10⁶/мл) пациентов с миелоидным лейкозом инкубируют с различными концентрациями КХ в течение 48 ч при 37°С в 5% СО₂. Затем клетки промывают и считают с целью определения их жизнеспособности.

Пример 7:

Инкубация CD33+ линии клеток U937 в присутствии КХ. Клетки U937 (1х10⁵ - 2х10 ⁶/мл) инкубируют с различными концентрациями КХ в течение 48 ч при 37°С в 5% СО₂. Затем клетки промывают и считают с целью определения их жизнеспособности.

Пример 8:

Инкубация CD33- линии клеток К562 в присутствии КХ. Клетки К562 (1х10⁵ - 2х10 ⁶/мл) инкубируют с различными концентрациями КХ в течение 48 ч при 37°С в 5% СО₂. Затем клетки промывают и считают с целью определения их жизнеспособности.

Пример 9:

Культура линии Molt-4 линии Т-лимфоидных клеток. Эту линию клеток получают из Американской Коллекции Типовых Культур (АТСС), VA, USA, и выращивают in vitro, как описано для линии клеток К562.

Пример 10:

Получение мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) у здоровых лиц. Собирают цельную кровь, и мононуклеарные клетки отделяют путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll/hypaque.

Пример 11:

Анализ прогрессии клеточного цикла и апоптоза методом проточной цитометрии. РВМС пациента с ХМЛ культивируют в среде RPMI-1640 с добавкой 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки в присутствии или отсутствие КХ (100,0 мкг/мл) в течение 48 ч при 37°С в 5% СО₂. Клетки фиксируют 40% этанолом, обработанным 500 мкг/мл РНКазой А, а затем 69 мкМ йодида проподия, для анализа содержания ДНК методом проточной цитометрии, как описано (Mitra et al., Molecular Medicine, 6:527-541, 2000).

Результаты примеров 6, 7 и 8:

Как показано в табл.1, РВМС пациентов с миелоидным лейкозом, CD33+ линия промоноцитарных клеток U937 и CD33- линия эритролейкозных клеток К562 разрушались хлорогенной кислотой.

Результаты примеров 9 и 10:

Как показано в табл.2, линия эритролейкозных клеток К562, линия промоноцитарных клеток U937 и лейкозные клетки пациента с ХМЛ разрушались хлорогенной кислотой. Линия Molt-4 линии Т-лимфоидных клеток требует более высокой дозы. Напротив, ХК по существу не воздействует на РВМС здоровых доноров. Микрофотографии клеток U937, K562, РВМС пациента с ХМЛ, Molt-4 и нормальных РВМС после культивирования в течение 48 ч в присутствии или отсутствие КХ показаны на фиг.4. Авторы настоящего изобретения ранее заявляли, что 3-орто-пара-кумарилхинная кислота (PCQ) обладает активностью против миелоидного лейкоза (299/NF/2002; 30 мая 2002 г.). Здесь авторы изобретения показывают, что комбинация хлорогенной кислоты (КХ) и 3-орто-пара-кумарилхинной кислоты в соотношении 1:1 более эффективна, чем каждая из КХ и PCQ в отдельности, при разрушении линий лейкозных клеток или лейкозных клеток пациента с миелоидным лейкозом, но не оказывает эффектов на РВМС здорового донора (табл.3).

Результаты примера 11:

Анализ клеточного цикла показал, что после 2 дней культивирования хлорогенная кислота в концентрации 100,0 мкг/мл вызывает апоптоз в лейкозных клетках пациентов с ХМЛ in vitro ввиду их накопления в фазе S, G₂ или М. Приведено сравнение с клетками, культивированными в одной среде (таблица 4).

Таблица 1. Хлорогенная кислота разрушает лейкозные клетки пациентов и линии лейкозных клеток in vitro
Соединение	Ингибирование роста клеток после 48 ч инкубации, в %
	РВМС* пациента с ОМЛ	РВМС пациента с ХМЛ	Линия промоноцитарных клеток (U937)	Линия эритролейкозных клеток (К562)
Только среда	0,0	0,0	0,0	0,0
Хлорогенная кислота (КХ)
10 мкг/мл	нет данных	нет данных	25,0	46,6
15 мкг/мл	нет данных	нет данных	43,7	93.3
20 мкг/мл	9,5	5,8	90,6	100,0
50 мкг/мл	16,6	10,3	-	-
100 мкг/мл	73,8	22,5	-	-
500 мкг/мл	85,7	32,3	-	-
Примечание: 1. РВМС* - Мононуклеарные клетки периферической крови 2. Количество использованных клеток составило 15 /мл/лунку

Таблица 2. Ингибирование роста линий лейкозных клеток и лейкозных клеток пациента с ХМЛ ХК in vitro
Клетки	Инкубация с (мкг/мл)	Ингибирование роста клеток, в %
		1 день	2 дня	4 дня
К562	Среда	0,00	0,00	0,00
	КХ(10,0)	8,00	48,14	85,18
	КХ(25,0)	20,00	62,96	92,59
	КХ(50,0)	28,00	77,78	100,0
	КХ(100,0)	84,00	98,14	100,0
U937	Среда	0,00	0,00	0,00
	КХ(10,0)	8,33	44,0	57,14
	КХ(25,0)	16,66	52,00	71,42
	КХ(50,0)	25,00	64,00	89,28
	КХ(100,0)	45,83	96,00	100,0
Molt4 (линия Т-лимфоидных клеток)	Среда	0,00	0,00	0,00
	КХ(50,0)	3,57	6,67	12,5
	КХ(100,0)	6,89	14,67	18,75
	КХ(200,0)	13,79	46,67	62,5
РВМС пациента с ХМЛ	Среда	0,00	4,76	14,28
	КХ(50,0)	4,76	22,22	30,00
	КХ(100,0)	9,52	45,0	55,56
Нормальные РВМС	Среда	0,00	3,33	3,33
	КХ(50,0)	6,66	10,34	15,2
	КХ(100,0)	6,66	17,24	19,5
Следует отметить, что количество используемых клеток составляло 15 на 1 мл на 1 лунку

Таблица 3. Комбинация хлорогенной кислоты (ХК) и 3-орто-пара-кумарилхинной кислоты (PCQ) более эффективна при разрушении линий лейкозных клеток и лейкозных клеток пациентов с ОМЛ и ХМЛ in vitro
Клетки	Инкубация в присутствии	Ингибирование роста клеток в % (после инкубации в течение 3 дней)
К562 Линия эритролейкозных клеток	Среды	0,00
	КХ(25,0 мкг/мл)	20,00
	КХ(50,0 мкг/мл)	28,00
	PCQ(25,0 мкг/мл)	4,00
	PCQ(50,0 мкг/мл)	8,00
	КХ(25,0 мкг/мл)+ PCQ(25,0 мкг/мл)	44,00
U937 Линия промиелоцитарных клеток	Среды	0,00
	КХ(25,0 мкг/мл)	16,67
	КХ(50,0 мкг/мл)	25,00
	PCQ(25,0 мкг/мл)	2,08
	PCQ(50,0 мкг/мл)	4,17
	КХ(25,0 мкг/мл)+ PCQ(25,0 мкг/мл)	50,00
Лейкозные клетки пациента с ХМЛ	Среды	0,00
	КХ(25,0 мкг/мл)	2,38
	КХ(50,0 мкг/мл)	4,67
	PCQ(25,0 мкг/мл)	2,38
	PCQ(50,0 мкг/мл)	4,76
	КХ(25,0 мкг/мл)+ PCQ(25,0 мкг/мл)	20,3
РВМС здорового индивидума	Среды	0,00
	КХ(25,0 мкг/мл)	1,03
	КХ(50,0 мкг/мл)	1,03
	PCQ(25,0 мкг/мл)	0,00
	PCQ(50,0 мкг/мл)	1,67
	КХ(25,0 мкг/мл)+ PCQ(25,0 мкг/мл)	1,03
Количество используемых клеток составляло 25 на 1 мл на 1 лунку. Уничтожение клеток указанными соединениями (в %) зависит от количества клеток, присутствующих в 1 мл.

Таблица 4. Количество клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла (в %), после обработки КХ в течение 2 дней
Тип клеток	Инкубация с	Суб G0/G1 (апоптозные 2n ДНК)	G0/G1 (2n ДНК)	2+G2+M (>2n ДНК)
Лейкозные клетки пациента с ХМЛ	Среды	4,65	51,56	43,87
	КХ (100,0 мкг/мл)	10,64	33,13	56,35