2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноат, обладающий фунгицидным и противовоспалительным действием

Формула изобретения

2-(1 -Гидрокси-4 -изопропенил-1 -метилциклогексил-2 -тио)-метилэтаноат формулы I:



обладающий фунгицидным и противовоспалительным действием.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к химии серосодержащих и терпеновых соединений, а именно к терпенсульфиду формулы I, который может быть использован в медицинской практике в качестве средства, обладающего фунгицидным и противовоспалительным действием, для лечения микотических поражений кожи, сопровождающихся выраженным воспалительным процессом.

Известно, что средства, содержащие эфирные масла и их терпеновые компоненты, обладают фунгицидным и противовоспалительным действием (Пат. 2197994, РФ, МПК⁷ А61L 2/16. Дезинфекционное средство "Лесептик" / Слинина К.Н. [и др.]; заявитель и патентообладатель Науч.-исслед. вет. ин-т Нечерноземной зоны РФ, ООО Науч.-произв. фирма "Левес-НН", ГУП Центр. науч.-исслед. и проектный ин-т лес-хим. пром. - № 2000113057/13; заявл. 25.05.2000; опубл. 10.02.2003. Пат. 2054945, РФ, МПК⁶ А61К 35/78. Средство "Абисил-1", обладающее противовоспалительной, антибактериальной и ранозаживляющей активностью / Пинигина Н.М. [и др.]; заявитель и патентообладатель Пинигина Н.М. - № 95109894/14; заявл. 28.06.1995; опубл. 27.02.1996. Pharmacological activity of the essential oil of Bupleurum gibraltaricum: Anti-inflammatory activity and effects on isolated rat uteri / M.A.Ocete [et al.] // J. of Ethnopharmacology - 1989. - Vol.25, Iss. 3. - P.305-313. Бальзамическое средство для местного применения, обладающее антимикробным, противовоспалительным и болеутоляющим действием / Гармашова А.П. [и др.]; заявитель и патентообладатель ТОО НПФ "Левес-А", Ин-т гигиены труда и профзаболеваний ВСНЦ СО РАМН. - № 94025798/14; заявл. 12.07.1994; опубл. 27.08.1997).

В последнее время наблюдается значительный рост частоты грибковых заболеваний, что связано с увеличением числа факторов риска развития микозов (иммуносупрессивные факторы, использование антибиотиков и глюкокортикоидов) и вырабатыванием устойчивости грибов к известным фунгицидным средствам, что требует постоянного поиска новых лекарственных средств. Модификация природных терпенов путем введения серосодержащих биологически активных фрагментов позволяет получить лекарственное фунгицидное средство нового типа.

Известны структурные аналоги заявляемого соединения 2-(2'-гидрокси-2'-(4''-метилциклогекс-3''-енил)пропилтио)этановая кислота (Нуклеофильное тиилирование 8,9-оксида лимонена / В.А. Моргунова [и др.] // ХПС. - 1999. - Т.35. - № 2. - С.197-200. Startseva V.A. trans-Diepoxy derivative of limonene. Synthesis, structure, and products of oxirane ring opening with sulfur-containing reagents / V.A.Startseva, L.E.Nikitina, V.V.Plemenkov // Russian J. of Org. Chem. - 2001. Vol.37, Iss. 1. - P.34-36).

Заявляемое соединение, 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноат, его свойства в литературе не описаны.

Цель изобретения - новое эффективное соединение, обладающее фунгицидной активностью в сочетании с противовоспалительным действием, низкой токсичностью, и способ его получения.

Поставленная цель достигается предлагаемым изобретением, а именно 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноатом (формулы I). Способ получения терпенсульфида (I) заключается во взаимодействии (+)-1,2-оксида лимонена и метилового эфира меркаптоуксусной кислоты в метаноле при перемешивании и нагревании от 70 до 80°С в течение 5 часов и выделении продукта методом колоночной хроматографии.

Пример конкретного выполнения

Способ получения соединения 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата заключается во взаимодействии (+)-1,2-оксида лимонена с метиловым эфиром меркаптоуксусной кислоты в метаноле при перемешивании и нагревании от 70 до 80°С.

После отгонки растворителя продукт выделяли методом колоночной хроматографии на силикагеле (гексан/диэтиловый эфир, 10:1). Получили 2,2 г (65,0%) продукта - 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата - в виде маслянистой жидкости светло-желтого цвета.

Хромато-масс-спектр: 258 (М⁺, 3), 226 (7), 185 (10), 169 (15), 152 (30), 135 (45), 107 (90), 93 (50), 81 (40), 69 (62), 55 (60), 43 (100).

ПМР-спектр (CDCl ₃), , м.д.: 1.29 с, 1.30 с (3Н, 2СН₃), 1.66 с (3Н, СН₃), 2.2 м (1Н, Н-4), 2.4 ш.с. (1Н, ОН), 2.92 дд (1Н, Н-2, J_H2е_H3е=3.6 Гц, J_H 2е_H3а=5.4 Гц), 3.12 д, 3.22 д (2Н, 2SCH₂ ), 3.66 с, 3.70 с (3Н, 2OСН₃).

ИК-спектр ( , см^-1): 890, 1645 (C=CH₂), 1110 (С-O), 3200-3500 (ОН).

Исследование фунгицидной активности 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата

Исследование терпенсульфида (I), исходного (+)-1,2-оксида лимонена, а также его структурного аналога (+)-лимонена проводилось в течение 46 суток на 10 штаммах, относящихся к 9 видам микрогрибов, принадлежащих к трем основным классам мицелиальных и дрожжеподобных грибов (Endomycetes, Euascomyceles, Heterobasidiomycetes). Данные виды грибов наиболее часто являются возбудителями микозов и активными биодеструкторами строительных конструкций. Штаммы были получены из коллекции типовых и клинических культур микологической лаборатории Казанского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора.

Виды грибов:

Candida albicans (музейный непатогенный штамм № 4 и клинический штамм, выделенный от больного с висцеральным кадидозом), Candida parapsilosis, Candida krusei, Rodotorula rubra, Aspergillus niger, Aspergillus fumigatus, Penicillium tardum, Penicillium chrysogenum, Epidermophiton flocosum.

Фунгицидную активность лимонена, 1,2-оксида лимонена и терпенсульфида (I) изучали в опытах in vitro диско-диффузионным методом согласно рекомендации CLSI М51Р и методом определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) путем разведения в жидкой питательной среде, разработанным в 1994 году Национальным комитетом по клиническим лабораторным стандартам в США (National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS, Villanova, Pennsylvania, USA).

При определении фунгицидной активности диско-диффузионным методом (методом «аппликаций») использовали стандартную среду Сабуро, рекомендованную для посевов мицелиальных и дрожжеподобных грибов. Для исследования брали физиологически активные двухсуточные культуры дрожжеподобных грибов и шестисуточные культуры мицелиальных грибов. Далее готовили суспензию в концентрации 1-2 млн/мл. Суспензию вегетативных клеток или споровую суспензию тест-культуры, из расчета 1 млн спор на чашку, равномерно распределяли по поверхности твердой питательной среды в чашке Петри. На газон тест-культуры накладывали диски из фильтровальной бумаги, смоченные исследуемыми веществами. В контрольном опыте использовали диск, смоченный в: 1) дистиллированной воде и 2) БИОПАГ-Д. Препарат сравнения БИОПАГ-Д, действующим веществом которого является полигексаметиленгуанидин гидрохлорид, разработан и рекомендован НИИ дезинфектологии Минздрава России для применения в лечебно-профилактических и медицинских учреждениях. Чашки инкубировали при температуре 28°С в течение 6 суток. Подавление развития тест-культуры наблюдали на 2, 4 и 6 сутки. Степень чувствительности микрогрибов к данным веществам, то есть степень активности веществ, определялась по величине зоны задержки роста. Оценку активности веществ определяли по схеме, рекомендованной МУК 4.2.1890-04 (Методические указания «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» утверждены МЗ РФ 04.03.2004 № 4.2.1890-04. М., 2004).

Результаты исследования фунгицидной активности веществ диско-диффузионным методом приведены в таблице 1. Показано, что активность терпенсульфида по сравнению с лимоненом и 1,2-оксидом лимонена высока и не отличается от активности «БИОПАГ-Д». Тиотерпеноид проявлял высокую фунгистатическую активность на все виды тестируемых микрогрибов на твердой питательной среде в течение всего времени постановки опыта по сравнению с лимоненом и 1,2-оксидом лимонена.

В контрольных посевах без препаратов рост тест-культур был обильный, характерный для каждого вида гриба.

Для дальнейшего изучения фунгицидной активности исследуемых веществ использовали определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) методом разведения в жидкой питательной среде Сабуро согласно рекомендации NCCLS. При разведении тест-культуры в жидкой питательной среде фунгицидную активность оценивали по способности грибов расти в среде, содержащей разведения антимикробных агентов. МИК определяли как самую малую концентрацию антимикробного вещества, ингибирующую рост микроорганизма не менее чем на 70% по сравнению с контролем.

Для исследования были отобраны 4 вида микрогрибов, наиболее часто вызывающих глубокие микозы и способных активно существовать в жидкой питательной среде: Candida albicans (клинический штамм, выделенный от больного с висцеральным кандидозом), Rodotorula rubra, Aspergillus fumigatus, Epidermophiton flocosum. Брали физиологически активные двухсуточные культуры дрожжеподобных грибов и шестисуточные культуры мицелиальных грибов. Далее готовили суспензию в концентрации 1-2 млн/мл. Суспензию вегетативных клеток или споровую суспензию вносили в пробирки со средами, содержащими набор концентраций: от 160 мг/мл до 0,5 мг/мл. Инкубировали при температуре 28-30°С в течение 9 суток. В качестве контроля использовали среды в отсутствие препаратов. Результаты оценивали с помощью метода фотоколориметрии при длине волны 530 нм. Показатели сравнивали с показателями поглощения в контрольных пробирках. Если культура заполняла полностью поверхность среды с исследуемыми веществами в пробирках, то «читали» результаты визуально и прибегали к определению МИК 70% согласно рекомендации. Для удобства в анализе полученных данных оценка активности определялась в крестах по схеме, предложенной Г.Н.Першиным (Першин Г.Н. Методы экспериментальной химиотерапии / Г.Н.Першин. - М.: Медицина, 1971. - С.171-192). Обильный рост (+++); глубинный или поверхностный рост штаммов менее обилен, осадок или культура меньше, чем в контроле (++); рост слабый - неактивный менее 50-30% (+); более 70% задержки или отсутствие роста культуры по сравнению с контролем (+/-, -). Результаты фунгицидной активности исследуемых веществ методом разведения в жидкой питательной среде приведены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что терпенсульфид по сравнению с (+)-лимоненом и (+)-1,2-оксидом лимонена обладает наибольшей фунгицидной активностью. Так, уже при концентрации 10 мг/мл он оказывает фунгицидное действие на тестируемые культуры, а при концентрации 20 мг/мл полностью ингибирует рост культур, тогда как (+)-лимонен и (+)-1,2-оксид лимонена оказывают фунгицидное действие только в концентрации 40 мг/мл, а на штамм Aspergillus fumigatus - 80 мг/мл.

Частичное фунгицидное действие тиотерпеноида впервые начало проявляться через одни сутки при концентрации 1 мг/мл на штаммы Candida albicans, Rodotorula rubra и при 2,5-5 мг/мл на штаммы Aspergillus fumigatus, Epidermophiton flocosum. Однако в течение последующих суток штаммы начали слабо развиваться, и к концу девятых суток был отмечен умеренный рост, что говорит о фунгистатическом эффекте на виды тест-культур при концентрациях менее 20 мг/мл. Во всех контрольных пробирках отмечался сплошной рост тест-культур. Проведено 4 последовательностей опыта.

Таким образом, МИК для терпенсульфида составил 20 мг/мл.

Определение острой токсичности 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата

В экспериментах in vivo было исследовано действие терпенсульфида (I) в различных дозах. Варьирование доз осуществлялось путем разведения исследуемого липофильного соединения растворителем - фармакопейным оливковым маслом. Смешивание с растворителем осуществлялось при комнатной температуре механическим способом.

Определение показателя острой токсичности LD ₅₀ проводили на 156 нелинейных белых мышах обоего пола с массой тела 18-20 г. Исследуемые соединения вводили внутрижелудочно однократно в виде свежеприготовленных масляных растворов. Препарат сравнения диклофенак вводился мышам внутрижелудочно. Гибель животных регистрировали на третьи сутки, при наблюдении за состоянием животного в течение 14 дней. Смертельные дозы с доверительными интервалами и их средние ошибки определены пробитным методом Литчфилда и Уилкоксона (Беленький М.Л. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта / М.Л.Беленький. - Л.: Гос. из-во мед. лит., 1963. - 152 с).

Таблица 3
Токсичность 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата и препарата сравнения диклофенака при однократном внутрижелудочном введении
№	Исследуемые соединения	Показатель острой токсичности (LD50 в мг/кг)
1	терпенсульфид	10000 (7874÷12700)
2	лимонен	2300 (1815÷2806)
3	1,2-оксид лимонена	1000 (840÷1190)
4	диклофенак	710 (418÷1200)
Примечание: достоверность различия рассчитана по сравнению с контролем при р<0,05.

Из таблицы 3, отражающей результаты токсикологических исследований, видна чувствительность животных к изучаемому соединению (I), (+)-лимонену, (+)-1,2-оксиду лимонена и препарату сравнения.

В соответствии с классификацией опасности веществ по степени воздействия на организм (ГОСТ 12.1.007-76. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности. - Введ. с 01.01.1977 г. - Москва: Госкомитет СССР по стандартам, 2007. - 8 с.- (Система стандартов безопасности труда)) все изучаемые соединения относятся к классу умеренноопасных веществ. По классификации токсичности веществ (Методические указания «Общие вопросы. Гигиена, токсикология, санитарная оценка токсичности и опасности дезинфицирующих средств» утверждены МЗ РФ 10.02.2002, № 1.2.1105-02. М., 2002. 22 с.) изучаемые соединения можно разделить на следующие классы. К относительно безвредным относится 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноат, к практически нетоксичным соединениям относится (+)-лимонен, к классу малотоксичных соединений относится (+)-1,2-оксид лимонена, к классу умереннотоксичных соединений относится препарат сравнения диклофенак.

Так, 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноат менее токсичен для мышей, чем (+)-лимонен, в 4,3 раза, а (+)-1,2-оксид лимонена в 10 раз. Токсичность тиотерпеноида по сравнению с препаратом сравнения из группы противовоспалительных средств диклофенаком ниже в 14 раз.

Исследование противовоспалительной активности 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата

Противовоспалительный эффект веществ изучали на крысах с массой тела 150-180 г в дозах, эквивалентных по токсичности (1/10 LD₅₀, 1/20 LD₅₀, 1/30 LD₅₀ , 1/60 LD₅₀, 1/100 LD₅₀). Каждую дозу соединения вводили группам из 10 животных. Исследуемые соединения вводили зондом в желудок в виде водной эмульсии (в качестве эмульгатора использовали Твин-80) за 1 час до индукции воспаления. Препаратом сравнения явился стандартный 2,5% раствор диклофенака натрия, вводимый внутрижелудочно.

Изучение антиэкссудативной активности 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата в сравнении с (+)-1,2-оксидом лимонена, (+)-лимоненом и диклофенаком на модели каррагенинового отека лапы у крыс

Оценку влияния на фазу острого экссудативного воспаления проводили с применением модели каррагенинового отека лапы у крыс (Winter C.A. Carrageenin-induced edema in hind paw of the rat as an assay for antiiflammatory drugs / C.A.Winter, E.A.Risley, G.W.Nuss // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1962. - Vol.111. - P.544-547). Острую воспалительную реакцию воспроизводили субплантарным введением 0,1 мл 1% раствора каррагенина (сульфатированного полисахарида из ирландского морского мха). Определение значений средних и стандартной ошибок проводили традиционными методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы «Биостат». Показатель ED₅₀ определен пробитным методом Литчфилда и Уилкоксона.

Выраженность экссудативной воспалительной реакции оценивали по результатам онкометрии через 3 часа после индукции воспаления.

Таблица 4
Противовоспалительная активность на модели карагенинового отека у крыс (М±m) при внутрижелудочном введении
№	Исследуемые соединения	Доза	Онкометрический показатель через 3 часа
1	контроль (вода для инъекций)	-	0,94±0,05
2	контроль (Твин-80)	-	0,93±0,05
3	терпенсульфид	1/10 LD50 (1000 мг/кг)	0,37±0,01
1/20 LD 50 (500 мг/кг)	0,36±0,01
1/30 LD50 (333 мг/кг)	0,53±0,04
1/60 LD50 (167 мг/кг)	0,46±0,04
1/100 LD50 (100 мг/кг)	0,73±0,04
4	лимонен	1/10 LD50 (230 мг/кг)	0,47±0,03
1/20 LD 50 (115 мг/кг)	0,42±0,05
1/30 LD50 (76,7 мг/кг)	0,29±0,03
1/60 LD50 (38,3 мг/кг)	0,61±0,02
1/100 LD50 (23 мг/кг)	0,73±0,05
5	1,2-оксид лимонена	1/10 LD 50 (100 мг/кг)	0,29±0,03
1/20 LD50 (50 мг/кг)	0,33±0,02
1/30 LD50 (33,3 мг/кг)	0,43±0,04
1/60 LD50 (16,7 мг/кг)	0,43±0,03
1/100 LD50 (10 мг/кг)	0,43±0,04
6	диклофенак	1/10 LD50 (71 мг/кг)	0,44±0,01
1/20 LD 50 (35,5 мг/кг)	0,44±0,02
1/30 LD50 (24 мг/кг)	0,63±0,03
1/60 LD50 (11,8 мг/кг)	0,7±0,01
1/100 LD50 (7,1 мг/кг)	0,53±0,02
Примечание: достоверность различия рассчитана по сравнению с контролем при р<0,05.

Таблица 5
Противовоспалительная активность на модели карагенинового отека у крыс при внутрижелудочном введении
№	Исследуемые соединения	Доза	Экссудативная реакция, %	Показатель ED 50, мг/кг
1	контроль (вода для инъекций)	-	100	-
2	контроль (Твин-80)	-	100	-
3	терпенсульфид	1/10 LD50 (1000 мг/кг)	40,4	165 (110÷247,5)
1/20 LD50 (500 мг/кг)	38,4
1/30 LD50 (333 мг/кг)	77,7
1/60 LD50 (167 мг/кг)	48,9
1/100 LD50 (100 мг/кг)	56,4
4	лимонен	1/10 LD50 (230 мг/кг)	50,0	50 (31÷82)
1/20 LD 50 (115 мг/кг)	44,7
1/30 LD50 (76,7 мг/кг)	31,0
1/60 LD50 (38,3 мг/кг)	65,0
1/100 LD50 (23 мг/кг)	77,7
5	1,2-оксид лимонена	1/10 LD 50 (100 мг/кг)	31,0	33 (19÷56)
1/20 LD50 (50 мг/кг)	35,1
1/30 LD50 (33,3 мг/кг)	45,7
1/60 LD50 (16,7 мг/кг)	45,5
1/100 LD50 (10 мг/кг)	45,7
6	диклофенак	1/10 LD50 (71 мг/кг)	46,8	7 (4,7÷10,5)
1/20 LD 50 (35,5 мг/кг)	46,8
1/30 LD50 (24 мг/кг)	67,0
1/60 LD50 (11,8 мг/кг)	74,5
1/100 LD50 (7,1 мг/кг)	56,0
Примечание: достоверность различия рассчитана по сравнению с контролем при р<0,001.

Как видно из таблиц 4 и 5, заявляемый продукт 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноат оказывает одинаковое противовоспалительное действие с исходными веществами ((+)-1,2-оксидом лимонена, (+)-лимоненом) и препаратом сравнения диклофенак.

Изучение антипролиферативной активности 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата на модели фетровой гранулемы у крыс

Оценку влияния на хроническое пролиферативное воспаление проводили с использованием модели фетровой гранулемы у крыс (Meier R. On the mechanism of cortisone inhibition of connective tissue proliferation / R.Meier, W.Schuler, P.Desaulles // Experientia. - 1950. - Vol.6, Iss. 12. - P.469-471). Хроническое пролиферативное воспаление вызывали имплантацией под кожу живота 4 простерилизованных фетровых дисков массой 10 мг. Определение значений средних и стандартной ошибок проводили традиционными методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы «Биостат». Показатель ED ₅₀ определен пробитным методом Литчфилда и Уилкоксона.

Пролиферативную реакцию оценивали по разнице между массой высушенной гранулемы и исходной массой фетрового диска.

Таблица 6
Противовоспалительная активность на модели фетровой гранулемы у крыс (М±m) при внутрижелудочном введении
№	Исследуемые соединения	Доза	Пролиферативная реакция
1	контроль (вода для инъекций)	-	684,3±7,0
2	контроль (Твин-80)	-	689,2±16,9
3	терпенсульфид	1/10 LD50 (1000 мг/кг)	273,0±4,36
1/20 LD 50 (500 мг/кг)	414,7±3,84
1/30 LD50 (333 мг/кг)	374,5±1,39
1/60 LD50 (167 мг/кг)	210,0±3,36
1/100 LD50 (100 мг/кг)	221,2±3,97
4	лимонен	1/10 LD50 (230 мг/кг)	498,7±13,74
1/20 LD 50 (115 мг/кг)	450,0±12,85
1/30 LD50 (76,7 мг/кг)	344,7±8,71
1/60 LD50 (38,3 мг/кг)	280,2±3,81
1/100 LD50 (23 мг/кг)	258,1±5,13
5	диклофенак	1/10 LD50 (71 мг/кг)	397,9±10,27
1/20 LD 50 (35,5 мг/кг)	364,6±5,16
1/30 LD50 (24 мг/кг)	358,6±3,75
1/60 LD50 (11,8 мг/кг)	352,0±3,01
1/100 LD50 (7,1 мг/кг)	352,1±9,37
Примечание: достоверность различия рассчитана по сравнению с контролем при р<0,05.

Таблица 7
Противовоспалительная активность на модели фетровой гранулемы у крыс при внутрижелудочном введении
№	Исследуемые соединения	Доза	Пролиферативная реакция, %	Показатель ED 50, мг/кг
1	контроль (вода для инъекций)	-	100	-
2	контроль (Твин-80)	-	100	-
3	терпенсульфид	1/10 LD50 (1000 мг/кг)	39,6	200,0 (137,9÷290,0)
1/20 LD50 (500 мг/кг)	60,17
1/30 LD50 (333 мг/кг)	54,3
1/60 LD50 (167 мг/кг)	32,0
1/100 LD50 (100 мг/кг)	32,1
4	лимонен	1/10 LD50 (230 мг/кг)	72,3	84,0 (47,7÷147,8)
1/20 LD 50 (115 мг/кг)	65,3
1/30 LD50 (76,7 мг/кг)	48,5
1/60 LD50 (38,3 мг/кг)	40,66
1/100 LD50 (23 мг/кг)	37,4
5	диклофенак	1/10 LD50 (71 мг/кг)	58,0	8,0 (4,0÷16,0)
1/20 LD 50 (35,5 мг/кг)	52,9
1/30 LD50 (24 мг/кг)	52,03
1/60 LD50 (11,8 мг/кг)	51,07
1/100 LD50 (7,1 мг/кг)	51,16
Примечание: достоверность различия рассчитана по сравнению с контролем при р<0,001.

Результаты, приведенные в таблицах 6 и 7, показывают, что 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноат проявляет более высокую противовоспалительную активность по сравнению с (+)-лимоненом и не уступающую таковой препарата сравнения диклофенак.

Изучение жаропонижающего действия 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата

Жаропонижающий эффект терпенсульфида (I) в сравнении с (+)-лимоненом и диклофенаком изучали на крысах с массой тела 150-180 г в дозах, эквивалентных по токсичности (1/10 LD ₅₀, 1/20 LD₅₀, 1/30 LD₅₀, 1/60 LD ₅₀, 1/100 LD₅₀), исследуемых соединений и препарата сравнения (табл.8). Каждую дозу соединения вводили группам из 10 животных. Исследуемые соединения вводили зондом в желудок в виде водной эмульсии (в качестве эмульгатора использовали Твин-80) за 1 час до индукции гипертермии. Препаратом сравнения явился стандартный 2,5% раствор диклофенака натрия. Лихорадочную реакцию вызывали внутривенной инъекцией в хвостовую вену пирогенала в дозе 500 МПД/кг (Loux J.J. Antipyretic testing of aspirin in rats / J.J.Loux, P.D. de Palma, S.L.Yankell // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 1972. - Vol.22, Iss.4. - P.672-625). Определение значений средних и стандартной ошибок проводили традиционными методами вариационной статистики с использованием компьютерной программы «Биостат». Показатель ED₅₀ определен пробитным методом Литчфилда и Уилкоксона.

Жаропонижающую активность оценивали по уменьшению гипертермии через 2 часа после введения соединения.

Таблица 8
Жаропонижающая активность на модели пирогеналовой лихорадки у крыс (М±m) при внутрижелудочном введении
№	Исследуемые соединения	Доза	Данные термометрии через 2 часа	Показатель ED50, мг/кг
1	контроль (вода для инъекций)	-	39,24±0,07	-
2	контроль (Твин-80)	-	39,2±0,08	-
3	терпенсульфид	1/10 LD50 (1000 мг/кг)	35,35±0,04*	200,0 (128÷312)
1/20 LD 50 (500 мг/кг)	35,23±0,02*
1/30 LD50 (333 мг/кг)	35,6±0,04*
1/60 LD50 (167 мг/кг)	34,63±0,03*
1/100 LD50 (100 мг/кг)	35,72±0,05*
4	лимонен	1/10 LD50 (230 мг/кг)	37,62±0,13*	86,0 (50,9÷145)
1/20 LD 50 (115 мг/кг)	37,3±0,05*
1/30 LD50 (76,7 мг/кг)	37,5±0,17*
1/60 LD50 (38,3 мг/кг)	38,33±0,05*
1/100 LD50 (23 мг/кг)	38,5±0,08
5	диклофенак	1/10 LD50 (71 мг/кг)	38,88±0,1	5,0 (3,0÷9,0)
1/20 LD 50 (35,5 мг/кг)	38,8±0,12
1/30 LD50 (24 мг/кг)	38,7±0,04
1/60 LD50 (11,8 мг/кг)	38,42±0,04*
1/100 LD50 (7,1 мг/кг)	38,35±0,03*
Примечание: * - достоверность различия рассчитана по сравнению с контролем при р<0,05.

Данные таблицы 8 свидетельствуют о наличии у исследуемого в эквитоксических дозах 2-(1'-гидрокси-4'-изопропенил-1'-метилциклогексил-2'-тио)-метилэтаноата более выраженной жаропонижающей активности по сравнению с препаратом сравнения диклофенаком и (+)-лимоненом.

Таким образом, заявляемое соединение обладает противовоспалительной активностью, сопоставимой с активностью препарата сравнения диклофенаком, превышает таковую для (+)-лимонена и выгодно отличается от них по токсическим характеристикам.