способ лечения и профилактики отравлений фосфорорганическими инсектицидами (фои)

Формула изобретения

Способ профилактики и лечения отравлений фосфорорганическими инсектицидами в эксперименте путем введения животным карбоксима и атропина в дозах, в 2-3 раза меньших, чем при их раздельном введении.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к токсикологии.

Известны способы лечения и профилактики отравлений инсектицидами, заключающиеся во введении внутрь организма обратимых ингибиторов холинэстеразы (ИХЭ), например пиридостигмина, который вызывал побочные эффекты в виде трофических поражений нервной системы и оказался малопригодным для профилактики отравлений (2, 3, 4).

Наиболее близким способом лечения и профилактики отравлений инсектицидами является введение внутрь организма обратимого ингибитора холинэстеразы - оксазила в малых дозах совместно с атропином (1).

Недостатки рассмотренного способа заключаются в следующем: оксазил не проникает через гематоэнцефалический барьер в отличие от карбоксима, и поэтому он недостаточно эффективен при профилактике отравлений ФОИ у человека; оксазил не обладает реактивирующим действием, а потому не пригоден для лечения отравлений ФОИ; оксазил токсичен и при хранении относится к группе «А».

Задача изобретения - повышение эффективности лечения и профилактики отравлений фосфорорганическими инсектицидами.

Технический результат поставленной задачи достигается тем, что в способе лечения и профилактики отравлений фосфорорганическими инсектицидами, заключающемся во введении в организм обратимого ингибитора холинэстеразы в комплексе с атропином, предлагается в качестве обратимого ингибитора холинэстеразы использовать карбоксим в дозах 1/30-1/100 Д₅₀, обладающий свойствами аллостерического обратимого ингибитора холинэстеразы, при этом атропин используется в субэффективных дозах (5 мг/кг).

Способ лечения и профилактики осуществлялся на следующих группах животных: мышах и кошках. Предварительно проведено определение свойств карбоксима с известными антихолинэстеразными веществами.

Примеры исследования антихолинэстеразной активности карбоксима с обратимыми ингибиторами холинэстеразы в эксперименте

Пример 1. Определение сравнительной антихолинэстеразной активности карбоксима с обратимыми ингибиторами холинэстеразы и характеристика его взаимодействия с ферментом.

Опыты выполнены in vitro с использованием в качестве фермента очищенной холинэстеразы эритроцитов человека с активностью 3,6 ЕД/мг. Применен метод непрерывного потенциометрического титрования ацетата, образующегося при гидролизе ацетилхолина, раствором КОН на автотитраторе ТТТ-1 с титрографом фирмы «Radiometr» (Дания) в условиях постоянства рН 7,4, концентрации субстрата ацетилхолина иодида=2×10 ^-3М и температуры 37,0°С. Определяли скорость гидролиза в разные отрезки времени. В зависимости от требований анализа либо определяли степень торможения в сопоставлении с контролем, либо вычисляли величину K_II - бимолекулярную константу скорости ингибиции или величину I₅₀. В последнем случае показатель приведен как определяемый в опыте, так и расчетный с поправкой для обратимых ингибиторов, с учетом конкуренции с ацетилхолином, добавляемым в инкубационную смесь (19). Обратимость определяли методом длительного диализа в сопоставлении с галантамином (табл.1 и 2)

Таблица 1
Сравнительные величины показателей I50 и характеристика взаимодействия карбоксима, галантамина, пиридостигмина и оксазила с холинэстеразой в опытах in vitro с и без ацетилхолина (+АХ и -АХ).
I50 в М/л
Вещества	Показатели и характеристика антихолинэстеразной активности
с АХ	без АХ		Характеристика взаимодействия с холинэстеразой
Карбоксим	1,5×10 -5±0,2	6,5×10-6±0,1	2,3	преимущественно неконкурентный
Оксазил	8,0×10 -10	8,0×10 -10	1,0	неконкурентный
Пиридостигмин	2,2×10-7	3,5×10 -8	6,2	смешанный конкурентно-неконкурентный
Галантамин	6,2×10-6	1,7×10 -7	35,4	Конкурентный
Примечание: карбоксим является преимущественно неконкурентным ингибитором холинэстеразы, ближе всего к ингибитору оксазилу.

Таблица 2
Остаточное торможение активности холинэстеразы в % к контролю при диализе инкубата с ингибиторами
Время диализа часы	Ингибиторы холинэстеразы
Карбоксим 1,3×10-5М	Галантамин 3,3×10-6М
0	66	58
2	55	42
6	33	23
24	29	13
Примечание: реактивация фермента после ингибиции карбоксимом сходна с реактивацией после ингибиции обратимым ингибитором галантамином.

Карбоксим является обратимым ингибитором со скоростью 1,5% час^-1, несколько уступая галантамину 1,9% час^-1.

Пример 2. Подавление карбоксимом скорости ингибирования холинэстеразы фосфаколом в опыте in vitro. K_II - бимолекулярная константа скорости фосфорилирования. Результаты приведены в табл.3.

Таблица 3
Константы KII фосфакола в зависимости от концентрации карбоксима - и их относительное изменение к контролю -
Концентрации карбоксима в М	Фосфакол
106×М мин-1
0 (контроль)	2,8
2×10-5	1,2	1,3
4×10-5	0,8	3,5
9×10 -5	0,5	5,6
Примечание: - бимолекулярная константа скорости ингибирования холинэстеразы фосфаколом (фосфорилирования) в отсутствие карбоксима. - То же, при разных концентрациях карбоксима, вводимого в инкубат за 15 мин до фосфакола. Отношение - уменьшения константы скорости фосфорилирования.

В концентрации выше 2×10^-5М карбоксим тормозит скорость фосфорилирования ацетилхолинэстеразы.

Пример 3. Влияние карбоксима на торможение активности холинэстеразы крови мышей армином и хлорофосом в условиях его предварительного и последующего введения (табл.4 и 5).

Таблица 4
Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю после раздельного и последовательного введения карбоксима и армина. Карбоксим вводили внутримышечно в дозе 15 мг/кг, армии - подкожно в дозе DL50. Активность фермента определяли методом потенциометрического титрования через 15 мин после введения карбоксима (контроль) и через 60 мин после введения армина (контроль и опыт). (М±m; n=6-7).
Вещество	Время введения карбоксима
до армина за 15 мин	после армина
через 15 мин	через 45 мин
Карбоксим (контроль)	11,3±3,1	-	-
Армии (контроль)	72,3±1,9	70,9±5,3	70,6±7,1
Карбоксим и армии	29,5±3,3	46,1±9,9	48,8±3,2
Примечание: Во всех случаях опыт абсолютно достоверно отличен от контроля. Экстренная (за 15 мин) профилактика достоверно эффективней лечения

Таблица 5
Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю при раздельном и последовательном введении карбоксима (в/м) и хлорофоса (п/к). (М±m, n=5) в разное время после последнего введения
Вещества	Время введения карбоксима	Время определения активности в мин
через 15	через 30	через 60
Карбоксим	-	7,2±6,3	10,1±2,8	11,5±4,2
Хлорофос	-	79,3±2,8	82,6±9,4	89,4±8,1
Карбоксим + Хлорофос	за 60 мин	51,3±16,6	59,4±12,1	60,1±9,7
Карбоксим + Хлорофос	за 30 мин	20,6±7,3	31,5±7,8	30,7±10,8
Карбоксим + Хлорофос	одновременно	10,1±2,8	10,1±2,8	10,1±2,8
Хлорофос + Карбоксим	через 15 мин	10,1±2,8	10,1±2,8	10,1±2,8
Примечание: Эффект карбоксима абсолютно достоверен при введении за 30 мин, одновременно и через 15 мин. Одновременное и лечебное применение активней ранней (за 30 мин) профилактики. Профилактика и лечение отравлений хлорофосом эффективней, чем отравление армином

Пример 3. Доказательство высокой эффективности защитного действия карбоксима в малых дозах (табл.6).

Таблица 6
Сравнительная профилактическая активность обратимых ингибиторов холинэстеразы при в/б введении одновременно с атропином в неэффективной дозе (5 мг/кг) за 15 мин до армина в дозе ЛД50 или параоксона в дозе 2 ЛД50. Показатель эффективности - ПЭ - равен отношению ЛД50 к дозе, снижающей летальность мышей до 50% - ПД50.
Вещества	Химическая характеристика веществ	Показатели активности
ЛД50, мг/кг	ПД50, мг/кг	ПЭ
ЛД 50:ПД50
Галантамин	третичный, изостеричный	16,70	2,700	6,2
Физостигмин	третичный, изостеричный	0,80	0,130	6,2
Аминостимин	третичный смешанной стеричности	0,23	0,027	8,3
Митолон	бисчетвертичный аллостерический	1,50	0,022	68,0
Оксазил	бисчетвертичный аллостерический	4,50	0,011	409,0
Карбоксим*	бисчетвертичный аллостерический	159,0	1,500	106,0
Примечание: *) карбоксим испытан как антагонист параоксона

Показатели торможения фосфорилирования коррелируют, но не совпадают с показателями потенцирования защитного эффекта. В случае карбоксима следует учитывать, что он в отличие от прочих испытан на параоксоне и к тому же обладает свойствами реактиватора.

Пример 4. Влияние карбоксима на парализующее воздействие фосфакола в опытах на нервно-диафрагмальном препарате крысы.

Опыты выполнены на френико-диафрагмальных препаратах белых крыс. Изолированный препарат помещали в камеру с проточным раствором Тироде при аэрации карбогеном, температуре +28°С и рН 7,5±0,1. Нерв стимулировали прямоугольными импульсами от стимулятора ЭСЛ-2 длительностью 0,1 с, 3-кратной надпороговой силы и частотой 20 и 50 Гц. Сокращения регистрировали с помощью механотрона типа 6М×5С. Время каждой инкубации 60 мин, после чего начинали отмывание. Эффект регистрировали в разное время после окончания инкубации с фосфаколом в контроле и со вторым веществом в опыте. Результаты приведены в таб.7.

Таблица 7
Уровень амплитуды сокращений изолированной диафрагмы крыс в % к исходному при тетаническом раздражении френикуса с частотой 20 и 50 Гц при инкубации с фосфаколом в концентрации 0,5 мг/мл (контроль) и в условиях предварительного и последующего воздействия карбоксима в концентрации 10 мг/мл. Регистрация в разное время после последнего воздействия, n=4.
Вещества	Частоты раздражения нерва и время регистрации
20 Гц	50 Гц
45 мин	120 мин	45 мин	120 мин
Фосфакол (контроль)	15	20	10	15
Карбоксим + Фосфакол	65	80	40	50
Фосфакол + Карбоксим	100	100	100	100
Примечание: во всех случаях лечебное применения эффективней профилактического

Пример 5. Влияние карбоксима на торможение активности холинэстеразы крови мышей армином и хлорофосом в условиях его предварительного и последующего введения (табл.7 и 8).

Таблица 8
Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю после раздельного и последовательного введения карбоксима и армина. Карбоксим вводили внутримышечно в дозе 15 мг/кг, армии - подкожно в дозе DL50. Активность фермента определяли методом потенциометрического титрования через 15 мин после введения карбоксима (контроль) и через 60 мин после введения армина (контроль и опыт). (М±m; n=6-7).
Вещество	Время введения карбоксима
до армина за 15 мин	после армина
через 15 мин	через 45 мин
Карбоксим (контроль)	(11,3+3,1)	-	-
Армии (контроль)	(72,3±1,9)	(70,9±5,3)	(70,6±7,1)
Карбоксим и армии	29,5±3,3	46,1±9,9	48,8±3,2
Примечание: Во всех случаях опыт абсолютно достоверно отличен от контроля. Экстренная (за 15 мин) профилактика достоверно эффективней лечения

Таблица 9
Снижение активности холинэстеразы крови мышей в % к контролю при раздельном и последовательном введении карбоксима (в/м) и хлорофоса (п/к). (М±m, n=5) в разное время после после него введения
Вещества	Время введения карбоксима	Время определения активности в минутах
через 15	через 30	Через 60
Карбоксим	-	7,2±6,3	10,1±2,8	11,5±4,2
(контроль)
Хлорофос (контроль)	-	79,3±2,8	82,6±9,4	89,4±8,1
Карбоксим + Хлорофос	за 60 мин	51,3±16,6	59,4±12,1	60,1±9,7
Карбоксим + Хлорофос	за 30 мин	20,6±7,3	31,5±7,8	30,7±10,8
Карбоксим + Хлорофос	одновременно	10,1±2,8	10,1±2,8	10,1±2,8
Хлорофос + Карбоксим	через 15 мин	10,1±2,8	10,1±2,8	10,1±2,8
Примечание: Эффект карбоксима абсолютно достоверен при введении за 30 мин, одновременно и через 15 мин. Одновременное применение активней ранней (за 30 мин) профилактики. Профилактика и лечение отравлений хлорофосом эффективней, чем отравление армином

Главной итогом изобретения явилось создание и испытание профилактической активности комплекса, состоящего из карбоксима в дозе 1/3 эффективной с атропином, в дозе 1/2 эффективной (эти вещества в таких дозах при отравлении параоксоном были неэффективны). Эффект достигается за счет аллостерического потенцирования. Наличие потенцированного защитного эффекта доказывается примером 6.

Пример 6. Сравнительная эффективность карбоксима и атропина в действующих дозах и их комплекса в дозах, недостаточных для защиты мышей от гибели при отравлении параоксоном (табл.10).

Таблица 10
Оценка защитного эффекта атропина, карбоксима в условиях их раздельного и совместного профилактического (за 15 мин) и лечебного # (через 1 мин) внутрибрюшинного применения при отравлении белых мышей параоксоном подкожно. Число животных в группе 8-10; ЛД50 ±m мг/кг
Средства защиты в мг/кг	ЛД50±m Фосфакола	Показатели наклона кривой летальности	Индекс защиты
Контроль (параоксон)	(0,71±0,07)	(0,2)	-
Атропин 10	1,79±0,29	0,4	2,5
Карбоксим 15	3,34±0,49	0,5	4,7
Атропин 5 + Карбоксим 5	20,0±5,5	0,9	28,2
Атропин 5# + Карбоксим 5#	17,7±6,7	1,1	24,9
Атропин 10 + Дипироксим 20*	8,9±3,7	-	12,5
Примечание: ПН - показатель наклона= :ЛД50=(m N): ЛД50. Большой наклон кривой свидетельствует о малой опасности применения комплекса; ИЗ - индекс защиты=ЛД 50опыта:ЛД50контроля. # - препараты вводили лечебно. *) вместо карбоксима использован дипироксим в 4 раза большей дозе, чем карбоксим, с атропином в дозе 10 мг/кг.

Итак, использование комплекса карбоксима с атропином в субэффективных дозах (в 2-3 раза меньших, чем при раздельном применении) увеличило их профилактическую эффективность в 6-11 раз, что и требовалось доказать. Приведенные материалы позволяют считать, что на основе изобретения может быть создан эффективный, безопасный и нетоксичный профилактический антидот ФОИ для работников сельского хозяйства и других специальностей.

Пример 7. Группе из 8 котов (возраст 8-11 лет) с диагнозом отравление ФОИ (хлорофосом) в ветеринарной клинике «Барс» проведено лечение с применением карбоксима и атропина в субэффективных дозах. Результаты приведены в табл.11.

Таблица 11
Количество эхиноцитов у кошек до и после лечения сочетанием карбоксима и атропина
№ иссл.	до лечения	после лечения
Нормальн. эритр., %	Деформир. эритр., %	Нормальн. эритр., %	Деформир. эритр., %
1	88,26	11,74	93,3	6,7
2	87,5	12,5	95,6	4,4
3	90,6	9,4	90,06	9,94
4	88,35	11,65	91,15	8,85
5	89,8	10,2	93,5	6,5
6	87,93	12,07	92,6	7,4
М±m	88,74±1,38	11,26±1,38	92,7±2,23	7,3±2,23

Как видно из табл.11, количество эхиноцитов у кошек, отравленных ФОИ, снижается с 11,26±1,38% до 7,3±2,23% после лечения. Это существенным образом сказывается на состоянии регионарного кровотока, ликвидирует застойные явления, улучшает мозговое кровоснабжение. Из табл.11 видно, что после лечения сочетанием карбоксима и атропина у всех пациентов уровень холинэстеразы крови пришел к своим физиологическим нормам. При этом улучшалось клиническое состояние животных и отсутствовали клинические признаки отравления.

Положительный эффект предлагаемого изобретения заключается в использовании комплекса карбоксима с атропином в субэффективных дозах, что увеличило их профилактическую эффективность в 6-11 раз. Приведенные материалы позволяют считать, что на основе изобретения может быть создан эффективный, безопасный и нетоксичный лечебно-профилактический антидот ФОИ для животных.

Источники информации

1. Петров А.Н., Софронов Г.А., Нечипоренко С.П., Сомин И.Н. антидоты фосфорорганических отравляющих веществ.// Рос. Хим. ж. (Ж. хим. об-ва им. Д.И.Мендилеева). - 2004. - Т.48, № 2. - С.110-116.

2. Прозоровский В.Б. Лечебный и профилактический антидоты ФОВ. // Актуальные вопросы профилактики и терапии интоксикаций. Сб. научн. тр. Научно-практ. мед. центра «Нейрон» и НИИИЦ (МБЗ) ГосНИИИ военной мед. СПб.: изд «Астрон». - 2005. - С.9-16.

3. Chemical faund biological defense program. // Annnal report to congrese merch 2005: Department of defense [USA]. - 2005. - 62 p.

4. Прозоровский В.Б., Тонкопий В.Д., Суслова И.М. Взаимодействие обратимых ингибиторов с каталитическими и аллостерическими участками холинэстераз. // Бюлл. эксперим. биол. и мед. - 1976. - Т.82, № 8. - С.947-949.