способ коррекции окислительного стресса и нарушения no продуцирующей функции эндотелия при сосудистых осложнениях сахарного диабета в эксперименте

Формула изобретения

Способ коррекции окислительного стресса и нарушения NO продуцирующей функции эндотелия при сосудистых осложнениях сахарного диабета в эксперименте, включающий предварительное одноразовое введение в организм крысы натощак внутрибрюшинно 5% водного раствора аллоксана в дозе 15 мг/кг веса животного с последующим введением лекарственного препарата, отличающийся тем, что в качестве лекарственного препарата используют афобазол, который вводят в условиях окислительного стресса после увеличения уровня глюкозы в крови крысы, по крайней мере, в два раза, подкожно в количестве 10 мг/кг живого веса один раз в сутки в течение 30 дней на фоне ежедневного введения L-аргинина в дозе 10 мг/кг веса животного или на фоне N^G -нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) - ингибитора фермента NOS-3 в дозе 25 мг/кг веса животного.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и медицине, в частности к эндокринологии, и касается лечения ангиопатии и патологии внутренних органов при экспериментальном аллоксановом диабете.

Исследование биохимических показателей гемодинамических сосудистых осложнений сахарного диабета остается одной из наиболее актуальных проблем современной медико-биологической науки. Среди нескольких гипотез, объясняющих патогенез сосудистых диабетических поражений, особое место занимает развитие окислительного стресса, вследствие повышенной генерации активных метаболитов кислорода (АМК), и нарушения антиоксидантной защиты (АОЗ) клеток. Фактором риска в условиях окислительного стресса становится нарушение функции эндотелия, основными механизмами которой могут быть изменения активности и/или экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3), сниженный синтез NO из L-аргинина, чувствительность гладкомышечных клеток (ГМК) к NO или усиленная его деградация за счет взаимодействия с активными формами кислорода (АФК), включая супероксид-анион, а также другими продуктами ПОЛ.

Учитывая важную роль в развитии сахарного диабета (СД) окислительного стресса, и нарушения NO-продуцирующей функции эндотелия, можно полагать, что необходимой составляющей патогенетической терапии диабетических ангиопатии является новый методологический подход, основанный на применении препарата, обладающего антиоксидантными свойствами и способностью нормализовать метаболизм NO (Зенина Т.А., Силкина И.В., Серединин С.Б., Мирзоян Р.С. Экспериментальная и клиническая фармакологии. - 2006. - № 4. - С.45-47; Balasanyan M.G., Kanayan A.S., Jhopchayan A.V. Acta Physiol. Hung. 2002. vol.89, № 1-3, p.198).

По данным литературы селективный анксиолитик афобазол, синтезированный в ГУНИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, обладает способностью позитивно модулировать продукцию NO, ингибируя индуцибельную изоформу NO-синтазы и стимулируя конститутивную эндотелиальную NO-синтазу (NOS-3) и одновременно обладает антиоксидантными свойствами (Середенин С.Б., Мелкумян Д.С., Вальдман Е.А. Влияние афобазола на содержание BDNF в структурах мозга инбредных мышей с различным фенотипом эмоционально-стрессовой реакции. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2006. - Т.69. - № 3. - С.3-6). Однако препарат афобазол ранее не использовали для коррекции эндотелиальной дисфункции при сосудистых осложнениях нейроангиопатиях, вызванных экспериментальным сахарным диабетом.

Весьма актуальным является исследование в эксперименте у крыс с сахарным диабетом типа 1 показателей активности ПОЛ, антиокислительной системы (АОС), концентрации суммарных метаболитов оксида азота (NOx), роли уровня экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3), липидного спектра крови и на основе этих фундаментальных данных разработка возможного пути коррекции нарушений с применением афобазола при экспериментальном сахарном диабете (ЭСД) у крыс. Вместе с тем следует отметить, что в доступной литературе отсутствуют данные о биохимических маркерах нарушения функции эндотелия и изучение влияния афобазола на метаболические показатели эндотелиальной дисфункции при экспериментальном сахарном диабете.

Известен способ коррекции эндотелиальной дисфункции при сосудистых осложнениях аллоксанового диабета в эксперименте, включающий использование в качестве лекарственного препарата убихинон-коэнзим Q₁₀, который вводят в количестве 0,11 мкл/100 г живого веса (см. патент РФ № 2455702, МПК⁹ G09D 23/28, G01N 33/48, A61K 31/122, A61P 5/48, A61P 9/08, опубл. 10.07.2012 г.).

Недостатком данного способа является то, что не приводились данные экспрессии NOS-3 и не исследовалось участие L-аргинина - субстрата синтеза NO и стимулятора экспрессии NOS-3, а также влияние ингибитора энзима - L-NAME у крыс с экспериментальным сахарным диабетом. На фоне L-аргинина и L-NAME и их комбинации с коэнзимом Q10 не исследовались показатели системы ПОЛ-АОС и характер изменений гемодинамики.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению является способ лечения нефроангиопатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных, включающий предварительное одноразовое введение в организм крысы натощак внутрибрюшинно 5% водного раствора аллоксана в дозе 15 мг/кг веса животного, с последующим введением лекарственного препарата (см. патент РФ № 2372898, МПК⁹ A61K 31/197, A61P 13/12, G09B 23/28, опубл. 20.11.2009 г.).

Недостатками прототипа являются отсутствие исследований по изучению влияния донора NO - L-аргинина и ингибитора энзима L-NAME на эти показатели, тогда как исследование этих веществ позволило бы выяснить новые звенья патогенеза сосудистых осложнений участие субстрата фермента L-аргинина и его ингибитора - L-NAME. Более того не представлены сведения о нарушении метаболизма холестерина и его влиянии на биодоступность оксида азота. Во всех этих условиях эксперимента отсутствуют данные о характере гемодинамических нарушений.

Технический результат заключается в определении дозы афобазола, повышении точности и достоверности коррекции экспериментального сахарного диабета по показателям окислительного стресса, NO-продуцирующей функции эндотелия и биодоступности NO.

Технический результат достигается тем, что в способе коррекции окислительного стресса и нарушения NO-продуцирующей функции эндотелия при сосудистых осложнениях сахарного диабета в эксперименте, включающем предварительное одноразовое введение в организм крысы натощак внутрибрюшинно 5% водного раствора аллоксана в дозе 15 мг/кг веса животного, с последующим введением лекарственного препарата, согласно изобретению, в качестве лекарственного препарата используют афобазол, который вводят в условиях окислительного стресса после увеличения уровня глюкозы в крови крысы, по крайней мере, в два раза, подкожно в количестве 10 мг/кг живого веса один раз в сутки в течение 30 дней на фоне ежедневного введения L-аргинина в дозе 10 мг/кг веса животного или на фоне N^G-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME)-ингибитора фермента NOS-3 в дозе 25 мг/кг веса животного.

Данный способ позволит вскрыть новые звенья патогенеза ангиопатии при хроническом аллоксановом диабете, предложить лечение, повышающее эффективность, воспроизводимость, удобство, доступность, безопасность и невысокую стоимость для проведения эксперимента на животных.

Сущность заявляемого способа подтверждена графически и таблицами: где на фиг.1 (а-г) представлены изменения концентрации общего холестерина и его содержание в липопротеинах различной плотности на фоне корригирующей терапии афобазолом при ЭСД.

Таблица № 1. Изменение уровня экспрессии NOS-3 под влиянием афобазола и его комбинации с L-аргинином и L-NAME.

Таблица № 2. Изменения системы ПОЛ-АОС на фоне ингибитора фермента NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME).

Таблица № 3. Изменения системы ПОЛ-АОС на фоне субстрата L-аргинина.

Таблицы № 4, 5, 6. Динамика изменения показателей гемодинамики в норме, при экспериментальном сахарном диабете и на фоне корригирующей терапии с афобазолом на фоне субстрата L-аргинина и ингибитора фермента NOS-3 - L-NAME.

Способ коррекции окислительного стресса и нарушения NO-продуцирующей функции эндотелия при сосудистых осложнениях сахарного диабета в эксперименте осуществляли следующим образом.

Для поражения инсулиногенных -клеток островков Лангерганса экспериментальный сахарный диабет (аллоксановый) вызывали путем внутрибрюшинного введения крысам 5% водного раствора аллоксана (синтезированного в лаборатории отдела патобиохимии ФГБУН ИБМИ ВНЦ РАН и РСО-А) в дозе 15 мг/кг веса животного натощак, на фоне 24-48 часового голодания при свободном доступе к воде. Через 48-72 часа натощак забирали кровь из хвоста крысы (микроколичество) и определяли уровень глюкозы глюкозооксидазным методом (тест-наборы). Модель считали состоявшейся при повышении глюкозы в крови в 2 раза. Для коррекции вводили афобазол подкожно в количестве 10 мг/кг веса животного один раз в сутки в течение 30 дней. Для выяснения вопроса о влиянии афобазола на доступность субстрата L-аргинина для эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3) вводили афобазол на фоне ежедневного введения L-аргинина в дозе 10 мг/кг веса животного. В другом варианте экспериментов вводили афобазол на фоне N^G-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) - ингибитора фермента NOS-3 в дозе 25 мг/кг веса животного, определяли показатели антиоксидантной системы, липидного спектра крови, состояние микро- и макрогемодинамики, а также концентрацию суммарных метаболитов NO и экспрессию эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) в условиях окислительного стресса, и по изменению этих показателей судили о наличии эндотелиальной дисфункции при сосудистых осложнениях сахарного диабета у животных.

По истечении срока эксперимента изучали перфузию в различных точках локации тканей (жидкостный обмен) прозвучиванием датчиком 10 МГц, работающим по принципу «слепого» допплера у наркотизированных животных. Затем крысы забивались под тиопенталовым наркозом; забирали кровь из сердца с использованием в качестве антикоагулянта 2,8% раствора ЭДТА для определения концентрации малонового диальдегида (МДА) и сыворотку для определения активности СОД, каталазы, церулоплазмина и NO.

Уровень экспрессии NOS-3 в эндотелии аорты определяли методом Метельской В.А., Гумановой Н.Г., Литинской О.А. (Оксид азота: роль в регуляции биологических функций, методы определения в крови человека // Лабораторная медицина. - 2005. - № 7. - С.19-24). Аорты извлекали, промывали физиологическим раствором и помещали в пластиковые пробирки, которые хранили в жидком азоте, после чего аорты обрабатывали соответственно методике. Полосу, соответствующую NOS-3, детектировали в соответствии с ее молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Пленку высушивали на воздухе, полосы сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы Total Lab. Результаты представляли в условных единицах как отношение интенсивности полосы X к интенсивности полосы, принятой за контроль на каждой пленке. Аорта экспериментальных крыс подвергалась гистологическому исследованию микроскопически. Количественную оценку гистологических изменений структуры проводили по методу Автандилова с помощью цифрового фотоаппарата "Nikon", совмещенного с микроскопом.

Пример.

Исследование проводили в 9 группах крыс-самцов линии Вистар:

1-я группа - контрольная в количестве 20 голов;

2-я группа - крысы с экспериментальным сахарным диабетом в количестве 30 голов;

3-я опытная группа - интактные крысы+L-аргинин в дозе 10 мг/кг в течение 30 дней в количестве 15 голов;

4-я опытная группа - интактные крысы+L-NAME в дозе 25 мг/кг в течение 30 дней в количестве 15 голов;

5-я опытная группа - крысы с ЭСД+L-аргинин в дозе 10 мг/кг в течение 30 дней в количестве 20 голов;

6-я опытная группа - крысы с ЭСД+L-NAME в дозе 25 мг/кг в течение 30 дней в количестве 20 голов;

7-я опытная группа - крысы с ЭСД+афобазол в дозе 10 мг/кг веса животного в количестве 30 голов;

8-я опытная группа - крысы с ЭСД+афобазол в дозе 10 мг/кг веса животного+L-аргинин 10 мг/кг в течение 30 дней в количестве 20 голов;

9-я опытная группа - крысы с ЭСД+афобазол в дозе 10 мг/кг веса животного+L-NAME 25 мг/кг в течение 30 дней в количестве 20 голов.

Экспериментальный сахарный диабет, характеризующийся инсулиновой недостаточностью, вызывали у крыс опытной группы путем внутрибрюшинного введения 5% водного раствора аллокеана в дозе 15 мг/кг массы тела натощак на фоне 24-48-часового голодания при свободном доступе к воде. Через 48-72 часа натощак забирали кровь из хвоста (микроколичество) и определяли уровень глюкозы глюкозооксидазным методом (тест наборы) и при повышении глюкозы в крови, по крайней мере, в 2 раза.

Для коррекции нарушений ПОЛ, АОС, липидного спектра крови, микро- и макрогемодинамики а также концентрации суммарных метаболитов NO и экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3) в условиях окислительного стресса вводили крысам опытной группы с экспериментальным сахарным диабетом в течение месяца подкожно афобазол в дозе 10 мг/кг массы тела.

По истечении периода введения исследовали показатели перекисного окисления липидов, антиоксидантной системы, липидного спектра крови, состояние микро- и макрогемодинамики, а также концентрацию суммарных метаболитов NO и экспрессию эндотелиальной NO-синтазы (NOS-3) в условиях окислительного стресса.

Результаты свидетельствуют о существенном снижении концентрации МДА в крови под влиянием афобазола у диабетических крыс (с 8,65±0,031 нмоль/мл до 7,26±0,061 нмоль/мл (p<0,001) (см. строка 1, таблица 2). Анализ активности АОС показал достоверное возрастание активности СОД в сыворотке крови и эритроцитах (соответственно с 1,45±0,044 усл.ед. до 1,78±0,148 усл.ед. (p<0,05) и с 64,4±1,53 ед.акт. до 74,6±1,55 ед.акт. (p<0,001)) (см. строка 4, таблица 2), а повышенные данные каталазы и церулоплазмина достоверно снизились. Вместе с тем следует отметить, что активность каталазы осталась повышенной, что вероятно является проявлением клеточной компенсаторной реакции. В группе крыс на фоне лечения афобазолом статистически достоверно повысилась концентрация суммарных метаболитов NO в сыворотке крови с 32,54±1,56 мкмоль до 48,7±0,844 мкмоль (p<0,001) (см. строка 2, таблица 2). Для выяснения эффективности действия афобазола на процессы ПОЛ и активность ферментов АОЗ провели корреляционный анализ. Полученные данные в этой группе диабетических крыс, получавших лечение афобазолом, показали наличие прямой значимой корреляционной зависимости между концентрацией МДА и активностью каталазы (r=+0,60), и концентрацией церулоплазмина (r=+0,58) и обратной связи между снижением концентрации МДА и повышенной активности СОД в сыворотке крови (r=-0,61). Происходило повышение концентрации суммарных метаболитов NO и корреляционный анализ показал наличие отрицательной связи с МДА (r=-0,57).

Таким образом, афобазол угнетает ПОЛ, коррегирует взаимоотношения между ферментами АОЗ и способствует повышению концентрации суммарных метаболитов NO, хотя уровень их содержания не достигает контрольных значений. Полученные данные демонстрируют мембранопротекторные свойства афобазола in vivo при СД в эксперименте. Наши исследования впервые показали, что in vivo при СД у крыс афобазол, угнетая СРО и восстанавливая АОЗ, способствует повышению экспрессии eNOS и соответственно концентрации NO.

Ряд факторов влияют на экспрессию NOS-3 и эффективность образования NO:

- доступность субстрата L-аргинина

- наличие эндогенного ингибитора фермента NOS-3 - АДМА.

- состояние коферментов: НАДФН₂, ТТБП и т.д.

- влияние окисленных ЛНП, вызывающих атерогенные изменения сосудистой стенки.

Были исследованы изменения показателей обмена ХС: концентрации ОХС, ХС ЛВП, ХС ЛНП, ТАГ на фоне лечения афобазолом у крыс с СД. Анализ содержания общего ХС в сыворотке крови и его распределения в липопротеинах различной плотности показал, что на фоне лечения происходит статистически достоверное снижение концентрации ОХС с 3,896±0,161 ммоль/л до 2,493±0,04 ммоль/л, p<0,001, повышение ХС ЛВП с 0,556±0,012 ммоль/л до 0,601±0,003 ммоль/л, p<0,01 и значительное снижение в ЛНП с 3,124±0,15 ммоль/л до 1,706±0,044 ммоль/л, p<0,001 (см. фиг.1). Одновременно снижалась и концентрация ТАГ в сыворотке крови с 0,476±0,018 ммоль/л до 0,41±0,019 ммоль/л, p<0,02 (см. фиг.1).

Для выяснения взаимосвязи между концентрацией NO и липопротеиновым спектром сыворотки крови провели корреляционный анализ и выявили наличие отрицательной связи между этими показателями (r=-0,69; r=-0,67; r=-0,64; r=-0,71). Следовательно, снижение ОХС и ХС ЛНП в условиях угнетения ПОЛ способствовало повышению биодоступности NO. Для выяснения вопроса о влиянии афобазола на доступность субстрата L-аргинина для NOS-3 в другом варианте исследований вводили афобазол на фоне ежедневного введения L-аргинина в дозе 10 мг/кг веса тела в течение 3-х недель диабетическим крысам. По окончании эксперимента определяли в сыворотке крови концентрацию суммарных метаболитов NO и показатели окислительного стресса. Полученные результаты продемонстрировали повышение концентрации NO с 32,54±1,56 мкмоль при ЭСД до 42,27±0,893 мкмоль (p<0,01) при ЭСД+аргинин и до 50,54±0,472 (p<0,001) (см. строка 2, таблица 3) на фоне введения аргинина с афобазолом в этих вариантах исследований. Сопоставительный анализ данных у крыс с ЭСД на фоне L-аргинина и комбинации L-аргинина с афобазолом показал более существенное снижение концентрации МДА и повышение концентрации NO на фоне комбинированного введения L-аргинина и афобазола (см. таблица 3).

Эти данные подтверждают, что афобазол повышает биодоступность субстрата L-аргинина к своему ферменту и соответственно концентрацию суммарных метаболитов NO. Можно полагать, что афобазол в комбинации с L-аргинином оказывает влияние и на сам фермент NOS-3. Для выяснения этого вопроса мы исследовали экспрессию NOS-3 на фоне комбинированного введения L-аргинина и афобазола. Данные показали повышение уровня экспрессии NOS-3 на фоне комбинированного применения L-аргинина и афобазола.

В другом варианте экспериментов вводили афобазол на фоне L-NAME-ингибитора фермента NOS-3, контролем служили исследования на фоне введения одного ингибитора L-NAME. У интактных и диабетических крыс в этих вариантах определили концентрацию МДА, NO и экспрессию NOS-3. Данные показали, что концентрация NO значительно снизилась через 3 недели после введения L-NAME с 51,069±0,50 мкмоль до 33,13±0,595 мкмоль (p<0,001) (см. строка 2, таблица 2), причиной чему могло послужить угнетение экспрессии eNOS. В другом варианте исследований при введении афобазола на фоне L-NAME концентрация суммарных метаболитов NO повысилась с 30,74±0,567 мкмоль до 40,23±0,62 мкмоль, p<0,001, тогда как уровень МДА в крови снизился с 9,186±0,009 нмоль/мл до 8,01±0,053 нмоль/мл, p<0,001 (см. строки 1, 2, таблица 2).

Для подтверждения участия NOS-3 исследовали уровень экспрессии NO продуцирующего фермента в экстрактах аорты у диабетических крыс (см. таблица 1). Экспериментальные данные подтвердили впервые, что анксиолитик - афобазол, угнетая ПОЛ, повышает концентрацию NO и несомненно оказывает стимулирующее влияние на экспрессию NOS-3, тогда как на фоне L-NAME уровень экспрессии NOS-3 в экстрактах аорты был значительно снижен.

Коррекция дисфункции эндотелия, показателей окислительного стресса и метаболизма NO, сопровождалась повышением средней и систолической скоростей кровотока в сосудах микроциркуляторного русла, снижением плотности сосудистой стенки - индекса Гослинга (PI) и удельного периферического сосудистого сопротивления - индекса Пурсело (RI) (см. таблицы 5, 6).

Эти гемодинамические изменения свидетельствуют о повышении процессов перфузии, обусловленные снижением сосудистого сопротивления - реографического индекса и повышением средней и систолической скоростей кровотока на фоне введения афобазола. Для подтверждения эффективности влияния афобазола на гемодинамику в микроциркуляторном русле провели корреляционный анализ между концентрацией NO и скоростью кровотока соответственно средней, систолической и диастолической (r=+0,51; r=+0,56; r=+0,57; p<0,001). Из таблицы видно, что между повышением концентрации NO и процессов микроциркуляции выявлена положительная сильная корреляционная связь.

Исследования кровотока в магистральных артериальных сосудах (БА) показали снижение средней (М), систолической (S) и диастолической (D) скоростей кровотока на фоне введения афобазола (см. таблицы 4, 5, 6). Характер изменений гемодинамики в почечных артериях показал аналогичную картину, характеризующуюся снижением средней (М) и систолической (S) скоростей кровотока на фоне лечения афобазолом. Данные реографических показателей выявили повышение индекса Гослинга (PI), следовательно, упругоэластических свойств (плотности) сосудистой стенки, а также индекса Пурсело (RI), отражающего регионарное периферическое сосудистое сопротивление на фоне афобазола. В HПB происходит снижение средней (М), систолической (S) и диастолической (D) скоростей кровотока, а также понижение реографических индексов: PI - индекса Гослинга и RI - индекса Пурсело (см. таблицы 5, 6). Эти данные свидетельствуют о том, что афобазол, оказывая антиоксидантное действие, повышает концентрацию суммарных метаболитов NO и уровень экспрессии NO - продуцирующего фермента - eNOS в эндотелии сосудов. Эти изменения метаболизма NO способствуют восстановлению функции эндотелия и снижают уровень гиперперфузии в магистральных артериальных сосудах. В противоположность этому восстановление функции регуляторов тонуса сосудов в микроциркуляторном звене способствует увеличению перфузии - жидкостного обмена.

Использование предлагаемого способа позволит по сравнению с прототипом повысить эффективность лечения, для коррекции экспериментального сахарного диабета в условиях окислительного стресса, что характеризует его влияние на основное патогенетическое звено развивающейся ангиопатии при аллоксановом диабете у экспериментальных животных, повысить воспроизводимость, удобство, доступность, безопасность, и низкую стоимость проведения эксперимента и эффективность на крысах с экспериментальным сахарным диабетом.

Таблица 1
«Способ коррекции окислительного стресса » Изменение уровня экспрессии eNOS под влиянием афобазола и его комбинации с L-аргинином и L-NAME
	L-name	ЭСД+L-name	аргинин	ЭСД+аргинин	ЭСД+L-name+афобазол	ЭСД+аргинин+афобазол
M	0,567	0,305	1,05	0,65	0,753	1,51
m	0,088	0,003	0,087	0,104	0,199	0,12
Р1		0,01	0,001	-	-	0,001
Р2			0,001	0,01	0,05	0,001
Р3				0,01	-	0,01
Р 4					-	0,001
Р5					0,01	0,01
Примечание: P1 - достоверность относительно L-name; Р2 - достоверность относительно ЭСД+L-name; P2 - достоверность относительно L-аргинина; Р4 - достоверность относительно ЭСД+L-аргинина; Р5 - достоверность относительно ЭСД+афобазола

Таблица 2
«Способ коррекции окислительного стресса Изменения показателей в системе ПОЛ-АОС на фоне ингибитора фермента NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) при ЭСД
Группы показатели		N	ЭСД	L-name	ЭСД+L-name	ЭСД+афобазол	ЭСД+L-name+афобазол
МДА, нмоль/мл	M±m	6,87±0,044	8,65±0,031	7,213±0,012	9,186±0,009	7,26±0,061	8,01±0,053
	Р1		0,001	0,001	0,001	0,001	0,001
	Р2			0,001	0,001	0,001	0,001
	Р3				0,001	-	0,001
	Р 4					0,001	0,001
	Р5						0,001
NO, мкмоль	M±m	51,069±0,5	32,54±1,56	33,13±0,595	30,74±0,567	48,7±0,844	40,23±0,62
	Р1		0,001	0,001	0,001	0,02	0,001
	Р2			-	-	0,001	0,001
	Р3				0,01	0,001	0,001
	Р 4					0,001	0,001
	Р5						0,001
каталаза, мкат/л	M±m	225,56±25,57	345,33±3,16	310,03±2,054	382,14±1,58	307,6±3,35	338,15±1,84
	Р1		0,001	0,01	0,001	0,01	0,001
	Р2			0,001	0,001	0,001	0,05
	Р3				0,001	-	0,001
	Р 4					0,001	0,001
	Р5						0,001
СОД, ед.акт.	M±m	88,2±1,07	64,4±1,53	82,1±1,24	61,5±2,63	74,6±1,55	70,1±1,51
	Р1		0,001	0,01	0,001	0,001	0,001
	Р2			0,001	-	0,001	0,01
	Р3				0,001	0,01	0,001
	Р 4					0,001	0,01
	Р5						0,05
церулоплазмин, мг/л	M±m	338,66±6,365	467,6±8,945	360,2±6,697	497,1±5,25	394,2±4,86	430,1±5,08
	P1		0,001	0,02	0,001	0,001	0,001
	Р2			0,001	0,01	0,001	0,01
	Р3				0,001	0,001	0,001
	Р 4					0,001	0,001
	Р5						0,001

Таблица 3
«Способ коррекции окислительного стресса » Изменения показателей в системе ПОЛ-АОС на фоне субстрата L-аргинина при ЭСД
Группы показатели		N	ЭСД	аргинин	ЭСД+аргинин	ЭСД+афобазол	ЭСД+аргинин+афобазол
МДА, нмоль/мл	M±m	6,87±0,044	8,65±0,031	6,8±0,017	7,88±0,021	7,26±0,061	7,03±0,014
	Р1		0,001	-	0,001	0,001	0,01
	Р2			0,001	0,001	0,001	0,001
	Р3				0,001	0,001	0,001
	Р 4					0,001	0,001
	Р5						0,01
NO, мкмоль	M±m	51,069±0,5	32,54±1,56	53,25±0,412	42,27±0,893	48,7±0,80	50,54±0,472
	Р1		0,001	0,01	0,001	0,02	-
	Р2			0,001	0,001	0,001	0,001
	Р3				0,001	0,001	0,001
	Р 4					0,001	0,001
	Р5						0,05
каталаза, мкат/л	M±m	225,56±25,57	345,33±3,16	221,72±1,056	320,2±2,08	307,6±3,35	283,64±1,42
	Р1		0,001	-	0,01	0,01	0,05
	Р2			0,001	0,001	0,001	0,001
	Р3				0,001	0,001	0,001
	Р 4					0,01	0,001
	Р5						0,001
СОД, ед.акт.	M±m	88,2±1,07	64,4±1,53	88,8±1,031	70,3±1,096	74,6±1,55	82,5±1,276
	Р1		0,001	-	0,001	0,001	0,01
	Р2			0,001	0,01	0,001	0,001
	Р3				0,001	0,001	0,001
	Р 4					0,05	0,001
	Р5						0,001
церулоплазмин, мг/л	M±m	338,66±6,365	467,6±8,945	336,3±1,43	419,8±6,806	394,2±4,86	351,4±2,676
	Р1		0,001	-	0,001	0,001	-
	Р2			0,001	0,001	0,001	0,001
	Р3				0,001	0,001	0,001
	Р 4					0,01	0,001
	Р5						0,001

Таблица 4
«Способ коррекции окислительного стресса » Характер изменений показателей гемодинамики в норме, на фоне ингибитора фермента NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) и субстрата L-аргинина у интактных крыс
	Перфузия	БА	нпв	ПА левая	ПА правая
контроль
М, см/с	2,518±0,076	13,468±0,473	9,420±0,440	5,052±0,304	4,377±0,402
S, см/с	11,338±0,264	38,8341,223	15,868±1,754	20,019±0,880	19,59±1,020
D, см/с	6,335±0,168	2,083±0,232	1,223±0,137	4,638±0,415	5,651±0,521
PI, см/с	7,668±0,250	2,814±0,155	1,692±0,121	5,036±0,297	4,830±0,467
GD, мм рт.ст.	0,042±0,001	0,548±0,020	0,118±0,008	0,148±0,012	0,27±0,011
RI, усл.ед.	1,490±0,036	0,948±0,011	1,042±0,008	1,191±0,029	1,24±0,044
L-аргинин
М, см/с	2,62±0,007	13,12±0,0087	9,21±0,011	4,92±0,0097	4,22±0,0086
S, см/с	11,48±0,01	37,9±0,0097	14,75±0,011	19,76±0,0063	19,16±0,01
D, см/с	6,41±0,009	1,91±0,0086	1,13±0,0073	4,75±0,011	5,73±0,013
PI, см/с	7,5±0,009	2,9±0,0068	1,52±0,0083	5,18±0,0077	4,91±0,012
GD, мм рт.ст.	0,047±0,0028	0,48±0,0058	0,08±0,0068	0,11±0,0089	0,1±0,0061
RI, усл.ед.	1,38±0,0068	0,98±0,0089	0,91±0,0088	1,21±0,0063	1,26±0,01
L-NAME
М, см/с	2,42±0,008	13,79±0,011	9,56±0,009	5,1±0,089	4,45±0,01
S, см/с	11,05±0,0097	39,02±0,012	16,54±0,012	20,84±0,01	19,63±0,009
D, см/с	6,27±0,011	2,16±0,008	1,43±0,008	4,51±0,008	5,6±0,008
PI, см/с	8,05±0,008	2,74±0,01	1,71±0,008	4,92±0,008	4,79±0,008
GD, мм рт.ст.	0,041±0,001	0,58±0,011	0,12±0,009	0,154±0,001	0,13±0,007
RI, усл.ед.	1,51±0,008	0,92±0,011	1,08±0,008	1,18±0,008	1,23±0,01

Таблица 5
«Способ коррекции окислительного стресса » Характер изменений показателей гемодинамики при ЭСД, на фоне ингибитора фермента NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) и субстрата L-аргинина
	Перфузия	БА	нпв	ПА левая	ПА правая
ЭСД
М, см/с	2,137±0,064	15,710±0,518	9,871±0,426	5,308±0,245	4,946±0,276
	ПП)	ПП)
S, см/с	10,48±0,165	40,292±0,855	18,204±0,544	22,59±0,50	20,025±0,485
	ПП)			П)
D, см/с	6,25±0,220	2,95±0,372	2,162±0,219	4,09±0,303	5,495±0,378
		ПП)	ПП)	ПП)
PI, см/с	9,504±0,231	2,804±0,149	1,793±0,092	3,746±0,259	3,973±0,282
	ПП)			ПП)
GD, мм рт.ст.	0,04±0,001	0,651±0,018	0,124±0,008	0,2±0,01	0,15±0,008
	1)
RI, усл.ед.	1,572±0,03	0,932±0,010	1,12±0,013	1,145±0,021	1,207±0,029
ЭСД+L-аргинин
М, см/с	2,28±0,0085	15,03±0,013	9,74±0,015	5,27±0,008	4,88±0,0098
	3333)2)	3333 )	3333)	3333)	3333)
S, см/с	10,78±0,012	39,7±0,0098	17,89±0,013	21,84±0,016	19,99±0,013
	3333)	3333)	3333)	3333)	3333)
D, см/с	6,29±0,0097	2,81±0,027	2,02±0,022	4,16±0,019	5,54±0,018
	3333 )	3333)	3333)	3333)	3333)
PI, см/с	8,64±0,014	2,807±0,018	1,75±0,02	3,96±0,013	4,09±0,011
	3333)222)	3333)	3333)	3333)	3333)
GD, мм рт.ст.	0,05±0,0011	0,61±0,012	0,12±0,0006	0,18±0,009	0,148±0,001
	2222)	3333)	3333)	3333)	3333)
RI, усл.ед.	1,53±0,011	0,939±0,0012	1,09±0,0097	1,158±0,001	1,214±0,001
	3333)	3333)	3333)	3333)	3333)
ЭСД+L-NАМЕ
М, см/с	2,05±0,012	15,98±0,018	9,93±0,011	5,38±0,01	5,02±0,01
	4444)222)	4444)	4444)	4444)	4444)
S, см/с	10,07±0,017	41,16±0,012	18,35±0,01	22,83±0,012	21,08±0,014
	4444)222)	4444 )	4444)	4444)	4444) 2)
D, см/с	6,02±0,014	3,07±0,01	2,26±0,008	3,92±0,01	5,35±0,011
	4444)	4444)	4444)	4444)	4444)
PI, см/с	9,74±0,015	2,78±0,014	1,84±0,012	3,47±0,008	3,81±0,013
	4444 )		4444)	4444)	4444)
GD, мм рт.ст.	0,031±0,0011	0,69±0,009	0,131±0,001	0,23±0,006	0,168±0,001
	4444)2222)	4444)		4444)	4444)
RI, усл.ед.	1,68±0,017	0,942±0,001	1,18±0,008	1,117±0,001	1,18±0,008
	4444)222)	4)	4444)2222 )	4444)	4444)
Примечание: Pi - относительно нормы; Р2 - относительно ЭСД; Р3 - относительно L-аргинина; Р4 - относительно L-name

Таблица 6
«Способ коррекции окислительного стресса » Характер изменений показателей гемодинамики при ЭСД на фоне корригирующей терапии с афобазолом и его комбинации с ингибитором NOS-3 - NG-нитроаргинин метилового эфира (L-NAME) и субстрата L-аргинина
	Перфузия	БА	нпв	ПА левая	ПА правая
ЭСД+афобазол
М, см/с	2,43±0,072	14,5±0,23	9,61±0,37	5,1±0,28	4,61±0,24
	222)	2)
S, см/с	11,22±0,137	39,08±1,14	16,69±0,85	20,87±0,46	19,92±0,96
	222)			22)
D, см/с	6,29±0,16	2,14±0,031	1,59±0,18	4,31±0,32	5,51±0,39
		2)	2)
PI, см/с	8,04±0,28	2,81±0,131	1,708±0,11	4,64±0,19	4,17±0,26
	2222)			222)
GD, мм рт.ст.	0,042±0,001	0,59±0,02	0,121±0,009	0,16±0,012	0,14±0,01
		2)		22)
RI, усл.ед.	1,51±0,01	0,941±0,02	1,063±0,017	1,16±0,022	1,22±0,027
	2)		222)
ЭСД+L-аргинин+афобазол
М, см/с	2,44±0,027	13,71±0,105	9,47±0,04	5,086±0,034	4,46±0,04
		3333)1)	3333)	3333)	3333)
S, см/с	11,25±0,101	38,92±0,08	16,1±0,03	20,23±0,055	19,69±0,048
	3333 )	3333)	3333)	3333)	3333)
D, см/с	6,21±0,028	2,17±0,051	1,4±0,035	4,57±0,034	5,6±0,03
	333)	3333)	3333)	3333)	333)
PI, см/с	7,91±0,043	2,81±0,062	1,7±0,032	4,97±0,029	4,62±0,036
	3333)			3333)	3333)
GD, мм рт.ст.	0,04±0,002	0,52±0,013	0,119±0,001	0,15±0,002	0,13±0,007
	3333)	3333)1)		333)	33)
RI, усл.ед.	1,5±0,013	0,944±0,001	1,052±0,001	1,191±0,001	1,234±0,002
		333)	3333)	3333)	3333)
ЭСД+L-NAME+афобазол
М, см/с	2,34±0,01	15,01±0,011	9,668±0,009	5,178±0,098	4,471±0,01
	4444)	4444)1)	4444 )	4)	4444)
S, см/с	10,97±0,007	40,72±0,009	17,13±0,008	21,62±0,009	19,83±0,016
	4444)	4444)	4444)	4444)	4444)
D, см/с	6,22±0,011	2,63±0,009	1,809±0,009	4,34±0,009	5,573±0,016
	4444)	4444) 1111)	4444)	4444)	4444)
PI, см/с	8,17±0,01	2,71±0,007	1,744±0,007	4,682±0,009	4,46±0,011
	4444)	4444)	4444)	4444)	4444)
GD, мм рт.ст.	0,38±0,01	0,61±0,008	0,123±0,001	0,169±0,009	0,14±0,009
	4444)1111)	4444)	4444)	4444)	444)
RI, усл.ед.	1,59±0,007	0,91±0,01	1,082±0,006	1,171±0,009	1,221±0,012
	4444)1111)	444)	4444)	4444)	444)
Примечание: P1- относительно ЭСД+афобазола; Р2 - относительно ЭСД; Р3 - относительно - ЭСД+L-аргинин; Р4 - относительно ЭСД+L-NAME