тонкопленочный материал, содержащий функциональные компоненты, и способ получения тонкопленочного материала, содержащего функциональные компоненты

Формула изобретения

1. Тонкопленочный материал, содержащий функциональные компоненты и молекулы полиэлектролитов, сформированный на поверхности подложки, отличающийся тем, что он выполнен в виде слоя или слоев полиионных комплексов функциональных компонентов, связанных со слоем или слоями полиэлектролитов, при этом количество функциональных компонентов в комплексе больше 1, а функциональными компонентами являются коллоидные частицы.

2. Тонкопленочный материал по п.2, отличающийся тем, что он включает искусственные и/или природные молекулы полиэлектролитов.

3. Тонкопленочный материал по п.2, отличающийся тем, что он включает молекулы поликатионов, в состав которых входят атомы азота.

4. Тонкопленочный материал по п.3, отличающийся тем, что он включает молекулы поликатионов, в состав которых входят аминогруппы.

5. Тонкопленочный материал по п.2, отличающийся тем, что он включает молекулы полианионов, в состав которых входят ионизующиеся группы, выбираемые из серии: карбоксильные группы, фосфатные группы, сульфатные группы, сульфгидрильные группы.

6. Тонкопленочный материал по п.1, отличающийся тем, что коллоидными частицами являются органические коллоидные частицы, содержащие более одной молекулы.

7. Тонкопленочный материал по п.6, отличающийся тем, что органическими коллоидными частицами являются коллоидные частицы биологической природы.

8. Тонкопленочный материал по п.7, отличающийся тем, что коллоидными частицами биологической природы являются тилакоиды хлоропластов.

9. Способ получения тонкопленочного материала, содержащего функциональные компоненты и молекулы полиэлектролитов, включающий проведение процедуры чередующейся последовательной послойной адсорбции на подложку компонентов материала из водной фазы, отличающийся тем, что в водной фазе предварительно формируют полиионные комплексы функциональных компонентов, содержащие функциональные компоненты в количестве более 1, и затем проводят процедуры чередующейся последовательной послойной адсорбции на подложку сформированных комплексов и противоположно заряженных молекул полиэлектролитов, при этом на стадии предварительного формирования полиионных комплексов функциональных компонентов проводят реакции формирования комплексов функциональных компонентов с полиэлектролитами в водной фазе и создают стехиометрический избыток катионных или анионных групп в таких комплексах, обеспечивающий отличие от нуля суммарного электростатического заряда катионных и анионных групп таких полиионных комплексов, а в качестве функциональных компонентов используют коллоидные частицы.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве молекул полиэлектролитов используют искусственные и/или природные молекулы полиэлектролитов.

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве молекул поликатионов используют молекулы поликатионов, в состав которых входят атомы азота.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что в качестве молекул поликатионов используют молекулы поликатионов, в состав которых входят аминогруппы.

13. Способ по п.10, отличающийся тем, что в качестве молекул полианионов используют молекулы, в состав которых входят ионизующиеся группы, выбираемые из серии: карбоксильные группы, фосфатные группы, сульфатные группы, сульфгидрильные группы.

14. Способ по п.9, отличающийся тем, что в качестве коллоидных частиц используют органические коллоидные частицы, содержащие более одной молекулы.

15. Способ по п.14, отличающийся тем, что в качестве органических коллоидных частиц используют коллоидные частицы биологической природы.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что в качестве коллоидных частиц биологической природы используют тилакоиды хлоропластов.

Описание изобретения к патенту

Область техники

Изобретение относится к нанотехнологии и наноматериалам, биокаталитическим и биосенсорным технологиям, технологиям биоинженерии, технологиям получения тонкопленочных нанокомпозитных полимерных материалов и покрытий, которые могут использоваться в сенсорных и каталитических устройствах и системах.

Уровень техники

Тонкопленочные полимерные материалы и покрытия, содержащие функциональные биологические и/или искусственные компоненты (в частности, коллоидные частицы), широко используются в различных областях техники, включая производство оборудования и материалов для медицины, фармакологии, косметики, химической и пищевой промышленности, для биотехнологических производств, в производстве электронных и оптоэлектронных приборов, отделочных материалов, материалов и устройств бытового назначения.

Функциональными компонентами таких материалов являются различные по своей природе и структурно-функциональным характеристикам объекты, специфические свойства которых обеспечивают положительный технический результат от использования таких материалов и покрытий. Такими функциональными компонентами биологической природы являются, например, клетки, ферменты, пептиды, нуклеиновые кислоты. Используемые функциональные синтетические компоненты включают молекулы со специфическими оптическими и/или электронными свойствами и супрамолекулярные системы (красители, органические проводники и полупроводники), коллоидные частицы, в том числе неорганические коллоидные частицы, капсулы и другие нанофазные компоненты различного состава и размерности. Варьирование функциональных компонентов и оптимизация их пространственной организации в материале открывают широкие возможности для дизайна и разработки новых материалов и наноматериалов с заданными, улучшенными или новыми уникальными свойствами и функциями (полимеров и полимерных материалов, композитов, сплавов, керамик, продуктов биологического и медицинского назначения, оптических, сверхпроводящих, магнитных материалов и особо чистых веществ), что является важнной предпосылкой и условием дальнейшего технологического прогресса. Наноструктурированные и нанокомпозитные полимерные металлсодержащие материалы широко используются в настоящее время в различных областях техники, включая разработку и производство электронных и оптоэлектронных приборов и устройств, производство композитных материалов различного назначения, электропроводящих клеев, герметиков, пленок, защитных лакокрасочных покрытий и экранов для защиты от различных факторов внешней среды (коррозия, электромагнитные поля и ионизирующие излучения), в химической промышленности, в мембранных и каталитических технологиях, в биомедицинских, фармацевтических, сенсорных, аналитических и диагностических технологиях, в производстве отделочных материалов и в других областях. Тонкопленочные материалы, содержащие магнитные наночастицы, также широко используются в технике, в частности в системах хранения и преобразования информации (магнитные карточки, ленты, диски и т.д.).

Разрабатываемые технологии получения таких материалов должны быть экономически рациональны, экологически безопасны и включать методы, позволяющие эффективно контролировать состав, структуру и, соответственно, свойства материалов на наноуровне. Тонкопленочные материалы, содержащие иммобилизованные функциональные компоненты биологической природы (клетки или субклеточные компоненты, ферменты, нуклеиновые кислоты и т.д.), находят все большее применение в биотехнологии, биоинженерии, диагностике, сенсорных и биокаталитических технологиях. Эти технологии, как правило, экологически безопасны и экономически эффективны благодаря использованию ряда принципиально важных свойств биологических систем, таких как воспроизводимость, возобновляемость, исключительно высокая функциональная эффективность. Основные проблемы, стоящие на пути дальнейшего развития таких технологий, связаны с необходимостью разработки эффективных способов иммобилизации и включения биологических компонентов в функциональные материалы и устройства. Заявляемое изобретение способствует решению этой проблемы. Оно также открывает возможности получения тонкопленочных полимерных материалов и покрытий, содержащих в качестве функциональных компонентов коллоидные частицы, при нормальных условиях с использованием водных растворов и без дорогостоящего оборудования.

В заявляемом изобретении в качестве функциональных компонентов тонкопленочного материала используются коллоидные частицы различной природы (органические и неорганические коллоидные частицы, в частности супрамолекулярные биогенные коллоиды).

Моно- и многослойные организованные пленки органических соединений на твердых подложках изучаются и используются в технике уже более 60 лет. Тенденции неуклонного роста интереса к таким системам обусловлены тем, что они позволяют создавать многокомпонентные супрамолекулярные структуры с целенаправленно заданными составом и структурой. Применяемые для этого техника Ленгмюра-Блоджетт и хемисорбция из растворов могут быть использованы только с определенными классами молекул. Ленгмюровская техника требует специального оборудования и имеет существенное ограничение, связанное с тем, что используемое для формирования монослоев и пленок вещество должно быть поверхностно активно [М.Kuhn, D.Möbius, In: B.W.Rossiter, R.C.Baetzold (Eds.), Physical Methods of Chemistry Series; Part B, Vol. IXB, John Wiley & Sons, Inc, New York, 1993; G.L.Gaines, Insoluble Monolayers at Liquid-Gas Interfaces, Interscience Publishers: New York, 1966; G.G.Roberts, Langmuir-Blodgett films, Plenum Press, NY, 1990].

Альтернативный подход - формирование мультислойных тонкопленочных материалов посредством последовательной послойной чередующейся адсорбции противоположно заряженных компонентов водной фазы. Этот метод основан на электростатическом притяжении и образовании ионных связей между противоположно заряженными молекулами. Электростатическое взаимодействие значительно менее требовательно к природе взаимодействующих веществ и получаемые таким методом пленки слабо зависимы от природы, размера и структуры поверхности подложки.

Метод последовательной чередующейся адсорбции противоположно заряженных компонентов из раствора впервые предложен Илером и описан в патенте USA 3485658 от 23 декабря 1969 года. Этим методом на поверхности твердотельной подложки формировались покрытия, имеющие по крайней мере три монослоя твердотельных коллоидных частиц. В каждом монослое частицы были одинаковы, но в соседних монослоях частицы были различны. В этом изобретении слои не включали каких-либо функциональных компонентов.

Этот метод получил широкое распространение для модификации поверхностей и создания новых неорганических [R.K.Iler, Multilayers of colloidal particles, J.Colloid Interface Sci. 21 (1966), pp.569-594], органических [G.Decher, Science, 277 (1997), pp.1232-1237], гибридных органико-неорганических [Yu.M.Lvov, G.B.Sukhorukov, Membr. Cell Biol. 11 (1997), pp.277-285], биоорганических [W.Li, M.Xian, Z.Wang, C.Sun, M.Zhao, Thin Solid Films, 386 (2001), pp.121-126] и полимерных [G.Decher, Science, 277 (1997), pp.1232-1237] многослойных пленок, микрокапсул [G.B.Sukhorukov, M.Brumen, Е.Donath, H.Mohwald, J.Phys. Chem. В, 103 (1999), pp.6434- 6440] и других систем с контролируемыми на наноуровне структурой и свойствами [Multilayer Thin Films. Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, G.Decher ed., WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim, 2003]. Для создания такого рода пленок могут быть использованы различные соединения и структуры органической и неорганической природы [Р.Т.Hammond, Curr. Opin. Colloid Interface Sci., 4 (1999), pp.430-442]. Подобные методы последовательной чередующейся адсорбции были разработаны для формирования слоев неорганических ионных соединений, например сульфида цинка [патент USA 4675207 от 23 июня 1987 г.] и слоев гидроксидов металлов [патент России 2051207 от 27 декабря 1995 года].

Основным преимуществом метода чередующейся последовательной послойной адсорбции является его неспецифичность по отношению к адсорбируемым материалам. Широкий класс веществ и функциональных компонентов может быть внедрен в мультислойную пленку в процессе ее формирования, при этом структура пленки остается неизменной, детерминированной лишь условиями приготовления. Этот метод гораздо более общий, и он расширил возможности формирования молекулярных и композитных мультислоев на такие вещества и объекты, как белки и другие биологические полиэлектролиты, заряженные наночастицы и коллоиды. Большой интерес с точки зрения фундаментальных и прикладных проблем представляет использование природных полимеров - белков [М.Е.Бобрешева, Г.Б.Сухоруков, Е.А.Сабурова, Л.И.Елфимова, Л.И.Шабарчина, Б.И.Сухоруков, Биофизика, том 44, вып.5 (1999), с.813-820; С.А.Constantine, S.V.Mello, A.Dupont, X.Cao, D.Santos Jr., O.N.Oliveira Jr., F.T.Strixino, E.C.Pereira, V.Rastogi, T.-C.Cheng, J.J.DeFrank, R.M.Leblanc, J.Am.Chem. Soc. 125 (2003), pp.1805-1809] и нуклеиновых кислот [G.B.Sukhorukov, M.M.Montrel, A.I.Petrov, L.I.Shabarchina, B.I.Sukhorukov, Biosens. Bioelectron. 11 (1996), pp.913-922; M.M.Montrel, G.B.Sukhorukov, A.I.Petrov, L.I.Shabarchina, B.I.Sukhorukov, Sens. Actuators, B, Chem. 42 (1997), pp.225-231] в качестве материала для создания таких пленок. В большинстве случаев белки в пленках сохраняют свою функциональную биологическую активность [Yu.M Lvov, G.B.Sukhorukov, Protein architecture: assembly of ordered films by means of alternated adsorption of oppositely charged macromolecules, Membr. Cell Biol. 11 (1997), pp.277- 285; M.E.Бобрешева, Г.Б.Сухоруков, Е.А.Сабурова, Л.И.Елфимова, Л.И.Шабарчина, Б.И.Сухоруков, Биофизика, том 44, вып.5 (1999), с.813-820]. При этом значительно возрастает их стабильность (пероксидаза, глюкоамилаза и глюкоизомераза сохраняли свою активность в пленке после трехмесячного инкубирования при 4°С на уровне 95% от первоначального значения, глюкозооксидаза сохранила активность после десятидневного инкубирования при 60°С). Линейный рост ферментативной активности пленки, содержащей пероксидазу, от количества слоев наблюдался вплоть до толщины в 10 слоев.

Помимо получения пленок с заданным составом и структурной организацией на поверхности плоской подложки, последовательная послойная адсорбция полиэлектролитов была использована для разработки методов получения микрокапсул и оболочек. Известен способ микрокапсулирования биологически активного материала [патент USA 5100673 от 31 марта 1992 года]. В соответствии с этим способом формируется полиэлектролитная полупроницаемая мембрана, покрывающая биоактивный материал. При этом мембрана формируется из биосовместимого, нетоксичного полиоснования и поликислоты. Такая полиэлектролитная мембрана не включает в свой состав какие-либо функциональные компоненты.

Метод получения полиэлектролитных слоев на коллоидных частицах, а также метод получения полых оболочек с использованием послойной чередующейся адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов описан в патенте USA 6479146 от 12 ноября 2002 года и патенте USA 7101575 от 5 сентября 2006 года. Выбирая соответствующие полиэлектролиты и заряженные коллоиды в качестве поверхностей для их адсорбции, можно формировать из мультислоев организованные композитные объекты типа капсул и оболочек. Создание полиэлектролитных пленок на микро- и наночастицах является логическим следствием последовательной послойной адсорбции полиэлектролитов на плоские поверхности. Данный метод дает возможность получать коллоидные частицы с контролируемой наноструктурой поверхности. Использование растворимых коллоидов позволяет получить после удаления ядра такой коллоидной системы полые микро- и нанокапсулы [G.B.Sukhorukov, M.Brumen, E.Donath, Н.Mohwald, J.Phys. Chem. В, 103 (1999), pp.6434-6440; G.В.Sukhorukov, E.Donath, S.Davis, Н.Lichtenfeld, F.Caruso, V.I.Popov and Н.Mohwald, Polimer for Advanced Technologies, 9 (1998), p.759].

Использование высокой специфичности и функциональной эффективности биологических систем (например, ферментов) является важным и перспективным для широкого спектра практических применений. Живая клетка, микроорганизм или органелла, в отличие от фермента, представляет собой готовый биологический реактор, в котором осуществляются процессы, способствующие поддержанию эффективности функциональной системы на высоком уровне (например, регенерация кофакторов). Разработка и создание систем, включающих в качестве функционального компонента биологический объект, в большой степени зависит от наличия методик, позволяющих стабилизировать и сохранить этот биологический объект. Одним из методов решения этой задачи является иммобилизация [Дж. Вудфорд, Иммобилизованные клетки и ферменты, Москва, изд-во Мир, 1988].

Благодаря развитию методов и технологий получения многослойных полиэлектролитных пленок на поверхностях подложек, в последнее время значительный интерес представляет изучение особенностей и возможностей применения данной технологии для решения задач иммобилизации живых клеток [M.J.Wissink, R.Beernink, А.А.Poot, G.H.Engers, T.Beugeling, W.G.Van Aken, J.Feijen, J.Control Release, 64 (2000), pp.103-114; H.J.Salacinski, G.Punshon, B.Krijgsman, G.Hamilton, A.M.Seifalian, Artif. Organs, 25 (2001), pp.947-982]. Известно, что полиэлектролитные пленки могут быть использованы для решения задач иммобилизации клеток на поверхностях [Р.Tryoen-Toth, D.Vautier, Y.Haikel, J.C.Voegel, P.Schaff, J.Chluba, J.Ogier, J.Biomed. Mater Res. 60 (2002), pp.657-667]. Исследование культур клеток эндотелия (клеток, выстилающих поверхности кровеносных и лимфатических сосудов, сердечных полостей) показало, что полимерные пленки, сформированные полиаллиламингидрохлоридом и полистиролсульфонатом, способствуют увеличению клеточной адгезии, не подавляют метаболическую активность клеток и не препятствуют их пролиферации [С.Bouraa, P.Menub, Е.Payanc, С.Picartd, J.C.Voegeld, S.Mullera, J.F.Stoltza, Biomaterials, 24 (2003), pp.3521-3530].

Формирование полимерной оболочки непосредственно на поверхности белковых агрегатов возможно с помощью чередующейся последовательной адсорбции полиэлектролитов из водной фазы [F.Caruso and G.Sukhorukov, Coated Colloids: Preparation, Characterization, Assembly, In: Multilayer Thin Films. Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, (G.Decher ed.), WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2003, pp.331-363]. Многослойное полимерное покрытие является эффективным барьером, отделяющим капсулированный фермент от внешней среды. Принцип формирования многослойной оболочки такого рода вокруг белкового агрегата такой же, как при создании многослойных полиэлектролитных пленок на поверхностях подложек и коллоидных частиц. Методика инкапсуляции агрегатов химотрипсина, представленная в работе [F.Caruso and G.Sukhorukov, Coated Colloids: Preparation, Characterization, Assembly, In: Multilayer Thin Films. Sequential Assembly of Nanocomposite Materials, (G.Decher ed.), WILEY-VCH Veriag GmbH & Co. KGaA, Weinheim, 2003, pp.331-363], состоит из следующих этапов. К водному раствору -химотрипсина добавлялся хлорид натрия, что приводило к агрегации белковых молекул. Ввиду положительного суммарного электростатического заряда поверхности химотрипсина при рН среды, используемой в работе, для создания первого полиэлектролитного слоя применялся полианион - полистирол сульфонат (PSS). Следующий полиэлектролитный слой состоял из полиаллиламингидрохлорида (РАН). Таким образом, можно получить фермент, заключенный в микрокапсулу, состоящую из произвольного желаемого числа слоев полимера. Оболочка такого рода не проницаема для высокомолекулярных ингибиторов. Исследования ферментативной активности капсулированного -химотрипсина показали, что она сохранилась приблизительно на уровне 70% от активности исходного фермента.

Этот же метод использовался для микрокапсулирования фермента лактатдегидрогеназы [М.Е.Бобрешева, Г.Б.Сухоруков, Е.А.Сабурова, Л.И.Елфимова, Л.И.Шабарчина, Б.И.Сухоруков, Биофизика, том 44, вып.5 (1999), с.813-820]. В результате исследования свойств фермента в многослойной полиэлектролитной оболочке отмечено появление новых свойств фермента по сравнению с его свойствами в свободном состоянии в растворе. В частности, было установлено, что капсулированный фермент не подвергается инактивации в течение более суток, в то время как инактивация обычного фермента в аналогичных условиях происходит за 30 минут. У капсулированного фермента обнаружена значительно большая устойчивость к щелочной денатурации, чем у свободного.

Микрокапсулирование целых клеток и клеточных органелл может представлять интерес для биотехнологии. Клетки и органеллы, в отличие от отдельных ферментов, представляют собой готовые биологические реакторы. Инкапсуляция клеток может быть актуальна для биомедецинских целей, в частности трансплантологии. В последнее время ведется разработка различных иммуноизолирующих систем, при использовании которых вещества с низким молекулярным весом (электролиты, кислород, биоактивные секреторные вещества) проникают через мембрану, и в то же время снижается риск контакта трансплантата с иммуноцитами и антителами. Требования к используемым полимерам включают стабильность, устойчивость к абсорбции протеинов и низкую токсичность. Некоторые полимеры для инкапсулирования в настоящее время уже проходят клинические испытания [И.Г.Беляева, О.В.Галибин, Г.Б.Сухоруков, А.Д.Вилесов, Применение нового метода инкапсулирования в клеточной трансплантологии, Москва, 2005, III съезд трансплантологов РФ (тезисы доклада)].

Иммобилизация и, в частности, инкапсулирование живых клеток и органелл методом чередующейся последовательной адсорбции синтетических полиэлектролитов и исследование влияния полиэлектролитов на клеточный метаболизм являются сравнительно новым направлением развития прикладных исследований и биотехнологических разработок. Из литературы известно, например, что покрытие мембран клеток дрожжей (Saccharomyces cerevisiae) четырьмя-шестью последовательными слоями полиаллиламин гидрохлорида и полистиролсульфоната не приводило к ингибированию процесса клеточного дыхания [A.Diaspro, D.Silvano, S.Krol, O.Cavalleri, A.Gliozzi, Langmuir, 18 (2002), pp.5047-5050]. Известен способ иммобилизации живых метаболически активных микроорганизмов на твердотельной подложке, описанный в патенте USA 4287305 от 1 сентября 1981 года, заключающийся в введении в контакт частиц агрегатного материала с водорастворимым полиэлектролитом, таким как желатин, сшивании полиэлектролита путем взаимодействия с сшивающим агентом, таким как глутаровый альдегид, для обеспечения сшитого покрытия на частицах агрегатного материала, контактировании покрытых частиц с живыми микроорганизмами и инкубации микроорганизмов в контакте с сшитым покрытием для обеспечения покрытия метаболически активных микроорганизмов. Иммобилизованные таким способом микроорганизмы продолжали расти и осуществлять репродуктивные функции. В этом способе микроорганизмы не включаются в состав тонкопленочного полиэлектролитного материала.

Известен способ иммобилизации белков и полиэлектролитов на поверхности твердотельных объектов, описанный в патенте CZ 9500761 от 16 октября 1996 г. В этом способе белки и полиэлектролиты иммобилизуются на поверхности твердых тел в форме пленок, состоящих из молекулярных слоев белков и полиэлектролитов. Способ включает стадию (а) - иммобилизацию слоя белков или полиэлектролита с помощью физической адсорбции или химических связей, стадию (б) - последовательную чередующуюся адсорбцию молекулярных слоев белков или полиэлектролитов, имеющих противоположные электрические заряды, стадию (с) - фиксацию полученной комплексной пленки путем химической сшивки и стадию (д) - промывку и удаление несшитых компонентов. Недостатком способа является его сложность, многостадийность и трудоемкость. Также способ не предполагает предварительного формирования комплексов иммобилизуемых функциональных компонентов - белков - с полиэлектролитами в водной фазе.

Известен способ получения иммобилизованного белкового тонкопленочного реактора и способ проведения химической реакции с использованием иммобилизованного белкового тонкопленочного реактора, описанный в патенте USA 6107084 от 22 августа 2000 года. Способ получения иммобилизованного белкового тонкопленочного реактора заключается в погружении пористой твердотельной подложки поочередно в водный раствор белка и в водный раствор полииона, заряженного противоположно белку, и формировании структурно-управляемого тонкопленочного материала с одним или многими слоями белка на подложке с точностью молекулярного уровня. Этот способ не предполагает предварительного формирования комплексов иммобилизуемых функциональных компонентов - белков - с полиэлектролитами в водной фазе. Существенным недостатком этого способа является формирование слоев функциональных компонентов (белков) в монослойном режиме, когда за одно погружение подложки происходит адсорбция молекулярного слоя индивидуальных функциональных компонентов. При необходимости включения в тонкопленочный материал значительного количества функциональных компонентов это обстоятельство обусловливает необходимость многократного повторения процедуры адсорбции.

Известен тонкопленочный материал, описанный в патенте USA 5208111 от 4 мая 1993 года, представляющий собой моно- или мультислойный элемент на поверхности подложки, который состоит из а) модифицированной подложки, имеющей ровную поверхность, модификация означает нанесение ионов или ионизуемых соединений одного знака на ее поверхность, и б) одного или более слоев, сформированных из органических материалов, которые в каждом слое содержат ионы одинакового знака, при этом ионы в первом слое имеют заряд, противоположный заряду модифицированной подложки, а в случае нескольких слоев каждый последующий слой имеет заряд, противоположный заряду предыдущего слоя. Слоевые элементы такого типа на подложках получают путем нанесения индивидуальных слоев из растворов органического материала в подходящих растворителях на модифицированную подложку в ходе последовательной физической адсорбции (образования соли). Недостатком данного метода является ограничение компонентов, которые могут включаться в материал, только органическими компонентами. В материал не включают функциональных компонентов и адсорбцию на подложку проводят из растворов, не содержащих полиэлектролитных комплексов включаемых в материал компонентов.

В патенте USA 6316084 от 13 ноября 2001 года описаны прозрачные покрытия, устойчивые к царапанию, магнитные покрытия, электрически и термически проводящие покрытия, а также УФ-поглощающие покрытия на твердых подложках. Покрытия получают методом электростатической самосборки одного слоя органических или полимерных молекул и одного слоя неорганических кластеров способом последовательной адсорбции противоположно заряженных компонентов слой за слоем при комнатной температуре. Комбинация неорганических кластеров, имеющих размер частиц предпочтительно менее 30 нм, и гибких органических молекул позволяет получать пленки толщиной десятки и сотни нанометров, с большими порами и прекрасной стрессовой релаксацией. Недостатком данного метода является ограничение функциональных компонентов, которые могут включаться в материал, неорганическими кластерами. В материал не включают биологических функциональных компонентов и адсорбцию на подложку проводят из растворов, не содержащих полиэлектролитных комплексов, включаемых в материал функциональных компонентов.

Наиболее близкими к заявляемому изобретению являются тонкопленочный слоистый материал на твердой подложке, содержащий функциональные компоненты, и способ его получения, описанные в патенте США 6020175, НКИ 435/180, от 1 февраля 2000 года (прототип). В этом патенте описаны слоистые мультислойные функциональные тонкие пленки, формируемые на твердотельных подложках, и метод их получения. Пленки на подложках содержат слои функциональных молекул (белков, пигментов или красителей), смешанные с полимерными ионами (полиэлектролитами), в комбинации с множественными слоями полиэлектролитов без функциональных молекул. Минимальное количество слоев в пленке равно двум. Способ получения таких пленок осуществляют следующим образом: твердотельную подложку, имеющую электрический заряд, погружают в раствор смеси функциональных молекул и примешанного полиэлектролита, имеющего электрический заряд, противоположный заряду твердотельной подложки, затем подложку с полученным первым слоем (состоящим из смеси функциональных молекул с полиэлектролитом) погружают в раствор полиэлектролита (без функциональных молекул), имеющего электрический заряд, противоположный заряду полиэлектролита в первом полученном слое - так формируют второй слой - слой полиэлектролита без функциональных молекул. Процедуру получения двух указанных слоев можно повторять требуемое число раз. Также пленки могут быть получены путем погружения твердотельной подложки в раствор полиэлектролита, имеющего электрический заряд, противоположный заряду подложки, с последующим погружением подложки в раствор функциональных молекул и примешанного полиэлектролита, имеющих суммарный электрический заряд, противоположный заряду раствора полимера, и повторением по крайней мере один раз погружения подложки в растворы. В качестве функциональных молекул используют белки, выбираемые из группы, включающей глюкозоксидазу, пероксидазу, глюкоамилазу, алкогольдегидрогеназу, диапоразу, цитохромы, лизоцим, гистоны, миоглобин и гемоглобин. В качестве пигментов используют молекулы различных известных красителей, в частности Конго красный, тетрафенилпорфин-тетрасульфоновая кислота и др. В известном способе отсутствует стадия предварительного формирования агрегатов молекул-функциональных компонентов тонкопленочного материала.

Существенным недостатком известных технических решений, в частности прототипа, и их отличием от заявляемого метода является формирование слоев функциональных компонентов в монослойном режиме, когда за одно погружение подложки происходит адсорбция слоя индивидуальных функциональных компонентов. При необходимости включения в тонкопленочный материал значительного количества функциональных компонентов это можно обеспечить только многократным повторением процедуры адсорбции, что обусловливает трудоемкость такого метода, его низкую производительность и, соответственно, низкую экономическую эффективность.

Анализ научно-технической и патентной информации о состоянии соответствующего уровня техники указывает на явные тенденции развития современных наукоемких технологий, которые характеризуются неуклонным уменьшением характерных размеров структурных и функциональных компонентов материалов, систем и устройств, что непосредственно связано с неуклонно возрастающей технологической востребованностью и расширяющейся областью практических применений высокодисперсных, наностуктурированных, нанокомпозитных материалов и функциональных наносистем. Варьирование и комбинирование различных функциональных нанокомпонентов и оптимизация их пространственной организации в наноструктурированном полимерном материале открывают широкие возможности для дизайна и разработки новых материалов с заданными, улучшенными или новыми уникальными свойствами и функциями, а также полифункциональных материалов. В связи с вышеизложенным анализом уровня техники и перспектив его развития очевидна необходимость разработки новых эффективных способов получения тонкопленочных, в частности, нанокомпозитных материалов, содержащих функциональные коллоидные частицы различной природы.

Задачей изобретения является создание тонкопленочного полимерного композитного материала, содержащего в качестве функциональных компонентов коллоидные частицы, в котором обеспечиваются возможности эффективного сохранения нативности и функциональных характеристик функциональных компонентов. Задачей изобретения является также разработка относительно простого, не требующего особых условий (реализуемого при нормальных условиях) способа получения такого материала, обеспечивающего эффективное высокопроизводительное включение коллоидные частиц в состав тонкопленочного материала.

Раскрытие изобретения

Решение поставленной задачи достигается заявляемым тонкопленочным материалом, содержащим в качестве функциональных компонентов коллоидные частицы, и способом получения тонкопленочного материала, содержащего такие функциональные компоненты.

Сущность изобретения заключается в том, что заявляемый тонкопленочный материал, содержащий функциональные компоненты и молекулы полиэлектролитов, сформированный на поверхности подложки, существенно отличается от известных тем, что он выполнен в виде слоя или слоев полиионных комплексов (своего рода агрегатов) функциональных компонентов, связанных со слоем или слоями полиэлектролитов, при этом количество функциональных компонентов в полиионном комплексе (агрегате) больше 1, а функциональными компонентами являются коллоидные частицы. В принципе, в материале наряду с такими агрегатами могут содержаться и индивидуальные функциональные компоненты. Материал в принципе может содержать одинаковые или различные функциональные компоненты в одном или в различных слоях. Такой тонкопленочный материал может включать искусственные и/или природные молекулы полиэлектролитов. В его состав могут входить молекулы поликатионов, в состав которых входят атомы азота. Атомы азота в таких молекулах могут входить в состав аминогрупп и групп, включающих четвертичный аммоний. В частности, такими молекулами могут быть молекулы полиаллиламина. Тонкопленочный материал включает молекулы полианионов, в состав которых входят ионизующиеся группы, выбираемые из серии: карбоксильные группы, фосфатные группы, сульфатные группы, сульфгидрильные группы. В частности, он может включать молекулы полистиролсульфоната, молекулы полиакриловой кислоты или молекулы нуклеиновых кислот (в том числе ДНК). Коллоидными частицами, вводимыми в состав материала в качестве функциональных компонентов, являются органические коллоидные частицы, содержащие более одной молекулы. Такими частицами могут быть коллоидные частицы биологической природы, в частности тилакоиды хлоропластов. В принципе, коллоидными частицами, вводимыми в состав материала в виде агрегатов, могут быть коллоидные частицы различной природы.

Способ получения тонкопленочного материала, содержащего функциональные компоненты и молекулы полиэлектролитов, включающий проведение процедуры чередующейся последовательной послойной адсорбции на подложку компонентов из водной фазы, существенно отличается от известных способов тем, что в водной фазе предварительно формируют полиионные комплексы (агрегаты) функциональных компонентов, содержащие функциональные компоненты в количестве более 1, и затем проводят процедуры чередующейся последовательной послойной адсорбции на подложку сформированных полиионных комплексов и противоположно заряженных молекул полиэлектролитов, при этом на стадии предварительного формирования полиионных комплексов функциональных компонентов проводят реакции формирования комплексов функциональных компонентов с полиэлектролитами в водной фазе и создают стехиометрический избыток катионных или анионных групп в таких комплексах, обеспечивающий отличие от нуля суммарного электростатического заряда катионных и анионных групп таких полиионных комплексов-агрегатов, а в качестве функциональных компонентов используют коллоидные частицы. То обстоятельство, что сформированные полиионные комплексы коллоидных частиц в водной фазе обладают ненулевым суммарным электростатическим зарядом, обусловливает существование кулоновских сил взаимного отталкивания агрегатов частиц в водной фазе, препятствующих их дальнейшей агрегации, и обеспечивает стабильность таких комплексов как коллоидной системы в целом. С другой стороны, электрический заряд комплексов обеспечивает возможности для их эффективной адсорбции на противоположно заряженную подложку и использование известной процедуры чередующейся последовательной послойной адсорбции противоположно заряженных компонентов из водной фазы для формирования мультислойного тонкопленочного материала, содержащего такие полиионные комплексы (агрегаты). Противоположно заряженными компонентами, находящимися в водной фазе, которые могут включаться в состав материала в соответствии с заявляемым изобретением, являются полиионные комплексы (агрегаты) коллоидных частиц. Также описанным способом возможно формирование мультислойного тонкопленочного материала путем чередующейся последовательной послойной адсорбции предварительно полученных противоположно заряженных полиионных комплексов (агрегатов) функциональных компонентов. В принципе, в состав материала наряду с сформированными комплексами могут включаться и индивидуальные функциональные компоненты, которые также могут адсорбироваться и включаться в состав тонкопленочного материала таким способом. В материал могут быть включены одинаковые или различные функциональные компоненты. В качестве молекул полиэлектролитов могут использоваться искусственные и/или природные полиэлектролиты. В качестве молекул поликатионов используют молекулы, в состав которых входят атомы азота. Атомы азота в таких молекулах могут входить в состав аминогрупп и групп, включающих четвертичный аммоний. В частности, в качестве таких молекул могут использоваться молекулы полиаллиламина. В качестве полианионов используют молекулы, в состав которых входят ионизующиеся группы, выбираемые из серии: карбоксильные группы, фосфатные группы, сульфатные группы, сульфгидрильные группы. В частности, используют молекулы полистиролсульфоната, молекулы полиакриловой кислоты или молекулы нуклеиновых кислот (в том числе ДНК). В качестве коллоидных частиц используют органические коллоидные частицы, содержащие более одной молекулы. Такими частицами могут быть коллоидные частицы биологической природы, в частности тилакоиды хлоропластов. В принципе, в качестве коллоидных частиц, вводимых в состав материала заявляемым способом в виде агрегатов, могут быть использованы коллоидные частицы различной природы.

Существенное отличие заявляемого материала и способа его формирования от известных материалов и способов их получения, в том числе от прототипа, состоит в том, что в прототипе функциональными компонентами являются молекулы, а в заявляемом изобретении тонкопленочный материал включает полиионные комплексы коллоидных частиц (представляющие собой компактные агрегаты коллоидных частиц), связанные в материале со слоем или слоями противоположно заряженных полиэлектролитов. Эти агрегаты коллоидных частиц предварительно формируют в водной фазе и адсорбируют на подложку, что обеспечивает иммобилизацию на подложке за один цикл адсорбции существенного количества функциональных компонентов (коллоидных частиц). Слои иммобилизованных функциональных компонентов на подложках, сформированные в соответствии с заявляемым изобретением, характеризуются рядом отличий и преимуществ по сравнению с известными методами иммобилизации функциональных компонентов, в частности компонентов биологической природы. В заявляемом изобретении функциональные компоненты встроены в полиионные комплексы, которые, в свою очередь, включены в матрицу прочного полимерного слоя, образованного молекулами поликатионов и полианионов, что обеспечивает большую надежность их иммобилизации и уменьшает влияние факторов, обусловленных взаимодействием со структурообразующими молекулами полиэлектролитов. В результате обеспечивается эффективное сохранение нативности и функциональной активности функциональных компонентов в материале, что улучшает функционально-технологические свойства и характеристики заявляемого тонкопленочного материала.

Преимуществами заявляемого изобретения являются также существенное упрощение и удешевление технологии получения тонкопленочных полимерных композитных материалов и покрытий на поверхности частиц, возможность получения биосовместимых покрытий, экологичность и относительная простота метода. Это обусловлено отличительными особенностями и преимуществами разработанного способа, связанными с тем, что он основывается на относительно простых физико-химических синтетических принципах, не связанных с использованием высокого вакуума, высоких давлений, сильных электрических и магнитных полей, высоких или низких температур, он вполне приемлем с экологической точки зрения. Простота способа получения тонкопленочного материала обеспечивает, соответственно, упрощение и удешевление технологии. Способ позволяет варьировать в широких пределах и оптимизировать состав, структуру и свойства заявляемого материала. Возможность включения в получаемый материал биогенных или биоактивных компонентов позволяет делать такой материал биосовместимым или биоактивным.

Способ позволяет избегать использования токсичных органических растворителей в процессе получения полимерных покрытий на поверхности частиц. Разработанный способ позволяет существенно повысить эффективность и производительность процесса формирования такого материала. Состав тонкопленочного материала, представляющего собой комплекс молекул поликатионов и полианионов с включенными функциональными компонентами, обеспечивает эффективное сохранение нативности и функциональной активности компонентов в полимерном слое, что существенно улучшает эксплуатационные характеристики полученного материала. Метод получения материала является экологически безопасным и позволяет получать большое количество материала, а также предполагает возможности автоматизации технологического процесса.

Технический результат изобретения заключается в том, что оно позволяет получать новые тонкопленочные функциональные полимерные композитные материалы и покрытия, включающие полимерные молекулы и коллоидные частицы различной природы. Способ позволяет обеспечить высокую плотность упаковки коллоидных частиц в материале. Толщина таких материалов может регулироваться с высокой точностью за счет используемого метода пошаговой послойной адсорбции компонентов материала в процессе формирования материала. Возможности включения в такой материал различных по своей природе функциональных компонентов позволяют создавать материалы с заданными свойствами и полифункциональные материалы.

Краткое описание чертежей

Фиг.1 - схема процесса получения тонкопленочного материала, включающего предварительно сформированные в водной фазе комплексы полиэлектролитов и функциональных компонентов, путем послойной адсорбции компонентов из растворов.

Фиг.2 - схема строения тонкопленочного материала, включающего предварительно сформированные в водной фазе комплексы полиэлектролитов и функциональных компонентов.

Фиг.3 - микрофотография полиэлектролитной пленки, включающей 3 слоя комплексов полиэлектролитов и хлоропластов и 3 слоя полианиона полистиролсульфоната, сформированной на поверхности кварцевой подложки.

Фиг.4 - изображение отдельных индивидуальных хлоропластов, включенных в полиэлектролитную пленку (состоящую из полистиролсульфоната и полиаллиламина), сформированную на поверхности твердотельной подложки (полированный кремний), полученное методом сканирующей электронной микроскопии (контрольный образец).

Фиг.5 - изображение отдельных индивидуальных хлоропластов, включенных в полиэлектролитную пленку (состоящую из полистиролсульфоната и полиаллиламина), сформированную на поверхности твердотельной подложки (полированный кремний), полученное методом сканирующей электронной микроскопии (контрольный образец).

Фиг.6 - изображение комплексов полиэлектролитов и хлоропластов, полученных в водной фазе и включенных в полиэлектролитную пленку (состоящую из полистиролсульфоната и полиаллиламина), сформированную на поверхности твердотельной подложки (полированный кремний), полученное методом сканирующей электронной микроскопии.

Фиг.7 - изображение комплексов полиэлектролитов и хлоропластов, полученных в водной фазе и включенных в полиэлектролитную пленку (состоящую из полистиролсульфоната и полиаллиламина), сформированную на поверхности твердотельной подложки (полированный кремний), полученное методом сканирующей электронной микроскопии.

Фиг.8 - светоиндуцированные изменения амплитуды сигнала ЭПР 1 от окисленных центров P ₇₀₀ ⁺ контрольного образца (А) хлоропластов и хлоропластов в составе полиэлектролитных комплексов (Б).

Фиг.9 - характерные кривые быстрой индукции флуоресценции в контрольном образце хлоропластов и в составе полиэлектролитных комплексов (вставка в центральной части чертежа) в присутствии и в отсутствие гербицида диурона.

Пример осуществления изобретения

В качестве примера реализации изобретения нами получены тонкопленочные материалы, содержащие в качестве функциональных компонентов коллоидные частицы - биоколлоиды (тилакоиды хлоропластов высших растений).

Для получения тонкопленочного материала использовались полимерные электролиты фирм Aldrich/Sigma: полиаллиламингидрохлорид (РАН), полистиролсульфонат (PSS), натриевая соль нативной ДНК лосося, природный полиамин спермин, полиакриловая кислота. Для приготовления растворов использовали ультрачистую деионизованную воду (сопротивление 18 МОм/см), получаемую с использованием системы очистки воды "MilliQ" фирмы "Millipore". В работе использовали свежеприготовленную воду и водные растворы на ее основе. Для приготовления буферных растворов использовали Tris-HCl буфер производства фирм Aldrich/Sigma, сахарозу марки «хч» и соли NaCl и MgCl₂ марки «хч». Для получения необходимой величины рН раствора использовали добавки кислоты (HCl) и щелочи (КОН) марки «хч».

Хлоропласты выделялись из листьев шпината согласно процедуре, описанной в [В.В.Птушенко, М.С.Гинс, В.К.Гинс, А.Н.Тихонов, Физиология растений, т.49 (2002), с.656-662] и включающей следующие основные стадии: измельчение листьев, 3 центрифугирования с целью отделения хлоропластов от клеточного сока и фрагментов клеточной мембраны. Эта методика позволяет получить хлоропласты класса Б - с разрушенной внешней оболочкой, но с неповрежденными тилакоидными мембранами, содержащими все компоненты цепи электронного транспорта за исключением ферредоксина. Хлоропласты суспендировались в буфере, содержащем 0,2 М сахарозы, 2 мМ MgCl₂ и 0,01 М Tris-HCl буфера (рН=7,5).

Включение агрегатов коллоидных частиц в состав тонкопленочного материала, формируемого на поверхности твердотельных подложек, производилось с использованием известного метода последовательной чередующейся адсорбции противоположно заряженных компонентов из водного раствора и состояло из следующих этапов (см. табл.1 и фиг.1).

В случае использования в качестве коллоидных частиц суспензии тилакоидов хлоропластов (биогенные коллоиды) на первом этапе формировались комплексы тилакоидов хлоропластов и полиэлектролитов в водной фазе. К суспензии хлоропластов (окончательная концентрация ˜ 0,5 мг/мл по хлорофиллу) добавлялся концентрированный водный раствор анионного полимера PSS (˜2 мг/мл, ˜500 мМ NaCl, рН 7,5).

Окончательная концентрация PSS в суспензии хлоропластов составляла 0,33 мг/мл (˜0,8 мМ, в расчете на мономер). Затем к суспензии тилакоидов хлоропластов, содержащей PSS, добавлялся концентрированный раствор катионного полимера РАН (˜2 мг/мл, ˜500 мМ NaCl, pH 7,5). Окончательная концентрация РАН в суспензии хлоропластов составляла 0,33 мг/мл (˜1,6 мМ, в расчете на мономер). Таким образом были сформированы поликомплексы полиэлектролитов и тилакоидов хлоропластов в водной фазе, фактически представляющие собой агрегаты тилакоидов, включающие более одной коллоидной частицы. Окончательные концентрации компонентов в суспензии подбирались таким образом, чтобы обеспечить суммарный положительный заряд получаемого комплекса: количество добавляемого РАН приблизительно вдвое превышало количество, необходимое для нейтрализации поверхностного отрицательного электростатического заряда хлоропластов.

На втором этапе с целью формирования тонкопленочного материала на подложке кварцевые подложки помещались в суспензию, содержащую сформированные поликомплексы (агрегаты тилакоидов и полиэлектролитов) с избыточным положительным зарядом, включающие тилакоиды хлоропластов и полиэлектролиты (PSS и РАН), а затем в раствор полианиона PSS (˜2 мг/мл, ˜500 мМ NaCl, pH 7,5). Схема такого процесса формирования тонкопленочного композитного полимерного материала представлена на фиг.1. Каждый описанный выше этап адсорбции продолжался примерно 15 минут и был отделен от последующего этапа промывкой образца в дистиллированной воде в течение 1 минуты.

Табл.1.
Получение тонкопленочного материала на поверхности твердотельной подложки, содержащего комплексы хлоропластов и полиэлектролитов.
1. Подложка из полированного кварца инкубируется 15 мин в суспензии хлоропластов, содержащей PSS (0,8 мМ) и РАН (1,6 мМ).
2. Промывка в дистиллированной воде ˜1 мин.
3. Инкубация в растворе PSS (2 мг/мл) ˜15 мин.
4. Промывка в дистиллированной воде ˜1 мин.

Нами были получены тонкопленочные материалы, содержащие комплексы тилакоидов хлоропластов и полиэлектролитов, иммобилизованные на поверхности кварцевой подложки и состоящие из шести последовательно адсорбированных слоев поликомплексов тилакоидов хлоропластов с полиэлектролитами и полианиона PSS (см. схему на фиг.2, а также фиг.3-7). Морфология полученного тонкопленочного материала, содержащего тилакоиды хлоропластов, была исследована методами оптической и сканирующей электронной микроскопии (см. фиг.3-7). На фиг.4 и 5 представлены изображения отдельных индивидуальных тилакоидов хлоропластов, включенных в полиэлектролитную пленку, сформированную на поверхности твердотельной подложки (контрольный образец). На фиг.3, 6 и 7 представлены изображения поликомплексов полиэлектролитов и тилакоидов хлоропластов, получаемых предварительно в водной фазе и включенных затем в полиэлектролитную пленку, сформированную на поверхности твердотельной подложки (кварц или полированный кремний). Аналогичные результаты были получены при использовании полиакриловой кислоты в качестве полианиона при формировании мультислойной структуры материала.

Функциональную активность тилакоидов хлоропластов, иммобилизованных в полученном тонкопленочном материале, оценивали с помощью метода ЭПР по кинетике светоиндуцированных изменений величины сигнала ЭПР 1 от окисленных центов Р ₇₀₀ ⁺ в соответствии с известной методикой, описанной ранее в работах [А.Н.Тихонов, Э.К.Рууге, В.К.Субчински, Л.А.Блюменфельд, Физиол. растений (1975), т.22, с.5-15; A.N.Tikhonov, G.B.Khomutov, E.K.Ruuge, L.A.Blumenfeld, Biochim. Biophys. Acta 637 (1981), pp.321-333]. В качестве количественного показателя фотохимической активности фотосистемы 2 хлоропластов было использовано отношение А₀/А₀, где A₀ - величина сигнала ЭПР 1, индуцированного насыщающим светом с длиной волны 707 нм, А₀ - уменьшение величины сигнала после переключения света 707 нм на свет с длиной волны 650 нм. Было установлено, что заметного ингибирования процессов светоиндуцированного электронного транспорта в мембранах тилакоидов хлоропластов при их включении в полиэлектролитные комплексы и в тонкопленочный материал не происходит (см. фиг.8). Также для количественной оценки функциональной активности тилакоидов хлоропластов использовали известный метод анализа выхода флуоресценции хлорофилла [А.К.Кукушкин, А.Н.Тихонов, Лекции по биофизике фотосинтеза, М., изд. МГУ, 1999]. Было установлено, что гербицид диурон существенно влияет на ход кривой индукции флуоресценции тилакоидов хлоропластов (см. фиг.9). При этом установлено, что параметры кинетики индукции флуоресценции тилакоидов хлоропластов, включенных в состав тонкопленочного материала в качестве функциональных компонентов, также обладают высокой чувствительностью к диурону (см. фиг.9). Это обстоятельство позволяет использовать такой материал в качестве активных элементов сенсоров.