способ получения бесклеточной вакцины для иммунопрофилактики коклюша

Формула изобретения

Способ получения бесклеточной коклюшной вакцины путем выращивания культуры Bordetella pertussis на казеиново-угольном агаре с последующим смывом микробных клеток с поверхности питательной среды, отличающийся тем, что в микробной суспензии, содержащей 70±10 МОЕ микробных клеток, устанавливают рН 8,4±0,1, после чего в суспензию добавляют водный раствор дезоксихолата натрия до конечной концентрации 0,5% и выдерживают при температуре (3±1)°С в течение 2 ч, затем целевой продукт отделяют от биомассы центрифугированием, подвергают диафильтрации, ультрафильтрации, обезвреживают добавлением 0,03% формалина при рН 7,6±0,2 и температуре (36±3)°С в течение 3 суток, обезвреженный целевой продукт осаждают соляной кислотой при рН 3,5±0,3 в присутствии 0,30±0,05% гексаметафосфата натрия, полученный осадок растворяют в 0,9%-ном растворе натрия хлорида при рН 7,1±0,3 и проводят стерилизующую фильтрацию готового препарата.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а точнее к вакцинопрофилактике инфекционных заболеваний человека, и может быть использовано при производстве высокоиммуногенных безвредных препаратов для профилактики коклюша.

Известен способ получения бесклеточных коклюшных вакцин, предусматривающий выделение очищенных антигенов Bordetella pertussis с последующим их соединением в готовом препарате (K.М. Edwards, В.D. Meade, М.D. Decker et al. Comparison of 13 Acellular Pertussis Vaccines: Overview and Serologic Response. Pediatrics, 1995; 96: 548-557). Недостатками данного способа являются отсутствие адекватных лабораторных тестов, позволяющих проводить количественную оценку протективной активности получаемых вакцин, недостаточный объем данных эпидемиологических наблюдений за их эффективностью, а также невозможность к настоящему времени установить, какие именно антигены должны присутствовать в составе вакцин (Vaccines edited by Stanley A. Plotkin; Walter A. Orenstein - 3rd edition. 1999. USA).

Наиболее близким к предлагаемому изобретению аналогом является способ получения корпускулярной коклюшной вакцины, компонента АКДС-вакцины, включающий выращивание культуры Bordetella pertussis на питательной среде КУА (казеиново-угольный агар), смыв микробных клеток с поверхности питательной среды, инактивацию микробной взвеси формальдегидом (ФС 42-0504-6501-05. Вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная жидкая).

При этом АКДС-вакцина является наиболее реактогенным препаратом национального календаря профилактических прививок. Во многом осложнения при использовании данного препарата связаны с коклюшным компонентом.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение бесклеточной коклюшной вакцины со сниженной реактогенностью.

Сущность изобретения заключается в следующем. Микробную взвесь Bordetella pertussis обрабатывают раствором дезоксихолата натрия, целевой продукт отделяют от биомассы центрифугированием, подвергают диафильтрации, ультрафильтрации, обезвреживанию формальдегидом и теплом, очистке соляной кислотой в присутствии гексаметафосфата натрия и стерилизующей фильтрации.

Обработка клеток Bordetella pertussis раствором дезоксихолата натрия позволяет выделить антигенный комплекс, обладающий протективной активностью. На этапе диафильтрации достигается очистка целевого продукта от низкомолекулярных балластных примесей. Добавление формальдегида позволяет обезвредить потенциально токсичные компоненты препарата. Дополнительная очистка целевого продукта достигается путем обработки соляной кислотой в присутствии гексаметафосфата натрия. При этом снижается реактогенность выделенного, очищенного и обезвреженного антигенного комплекса в сравнении с цельноклеточным препаратом.

Способ получения препарата осуществляется следующим образом. Для изготовления вакцины используют 3-5 штаммов возбудителя коклюша. Bordetella pertussis 1 фазы. Микробы выращивают на КУА в матрацах при (36±1)°С в течение 48 ч. По истечении указанного времени выросшую культуру в каждом матраце контролируют на бактериологическую чистоту и типичность морфологии микробных клеток путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. С каждого матраца с культурой В.pertussis, удовлетворяющего требованиям по морфологии и чистоте, производят смыв культуры стерильным 0,9% раствором натрия хлорида (рН 7,2). Бактериальную суспензию сливают в стерильную бутыль. Производят стандартизацию суспензии по оптическому стандарту мутности, устанавливая концентрацию 60-80 МОЕ микробных клеток в 1 мл суспензии. В стандартизованной суспензии устанавливают рН 8,4±0,1 с помощью 5% раствора натрия гидроксида. К охлажденной до (3±1)°С микробной суспензии, содержащей 60-80 МОЕ, добавляют 10% раствор дезоксихолата натрия до конечной концентрации его в суспензии, равной 0,5%, и выдерживают при температуре (3±1)°С в течение двух часов при периодическом перемешивании. После этого целевой продукт отделяют от биомассы посредством центрифугирования. Полученный раствор целевого продукта подвергают осветляющей фильтрации через мембраны с диаметром пор 1-3 мкм. Затем проводят очистку целевого продукта на ультрафильтрационной установке, состоящей из перистальтического насоса и мембранных аппаратов с пределом задержания веществ по молекулярной массе 15 кД. Вначале проводят диафильтрацию против десяти объемов 0,9% раствора натрия хлорида. По окончании диафильтрации раствор концентрируют до исходного объема, добавляют 0,03% от объема 40% раствора формальдегида, коррегируют рН до 7,6±0,2, подвергают микрофильтрации через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм и выдерживают при температуре (36±3)°С в течение 3 суток. Далее проводят дополнительную очистку целевого продукта осаждением соляной кислотой при рН 3,5±0,3 в присутствии 0,30±0,05% гексаметафосфата натрия при температуре (4±2)°С. Образовавшийся осадок растворяют в 0,9% растворе натрия хлорида при рН 7,1±0,3 до содержания белка не менее 0,4 мг/мл (по методу Лоури), после чего проводят стерилизующую фильтрацию препарата.

Пример.

На матрацы с питательной средой КУА засеяли штаммы Bordetella pertussis №№39, 267, 305 (10 матрацев на каждый штамм). Матрацы инкубировали 48 часов при 36°С. По истечении указанного времени выросшую культуру в каждом матраце контролировали на бактериологическую чистоту и типичность морфологии визуально и микроскопически. В каждый матрац с культурой В.pertussis, удовлетворяющей требованиям по морфологии и чистоте, внесли по 50 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Матрацы оставили в горизонтальном положении посевной поверхностью кверху на 5 минут, после чего смыли культуру путем покачивания.

Содержимое матрацев с культурой каждого штамма объединили в соответствующие бутыли. Объем микробной взвеси каждого штамма составил 450 мл, содержание микробных клеток - 120 МОЕ. После этого в каждую бутыль добавили 300 мл 0,9% раствора натрия хлорида. Содержание микробных клеток по результатам контроля составило 75 МОЕ. Суспензии всех трех штаммов были объединены в общую бутыль емкостью 5 л. Объем суспензии составлял 2,25 л, рН - 7,0. Провели коррекцию рН 10% раствором гидроксида натрия до 8,5.

К суспензии добавили 112,5 мл стерильного 10% раствора дезоксихолата натрия и выдержали 2 часа при температуре (4±2)°С при периодическом встряхивании.

Далее суспензию центрифугировали при 3000 об/мин в течение 1 часа. Полученный осадок отбросили, а надосадочную жидкость объемом 2,3 л освободили от мелкодисперсных примесей микрофильтрацией на мембранах с диаметром пор 3 мкм. После этого целевой продукт подвергли диафильтрации на полых волокнах марки ВПУ-15 против 25 л 0,9% раствора натрия хлорида. По окончании диафильтрации целевой продукт сконцентрировали ультрафильтрацией до 1,5 л, добавили 0,45 мл 40% раствора формальдегида, скорректировали рН 5% раствором натрия гидроксида до 7,8, профильтровали через пластины с диаметром пор 0,22 мкм в стерильную бутыль объемом 3 л. Полученный раствор выдержали при температуре (36±1)°С в течение 72 часов.

Затем к препарату добавили 15 мл 33% раствора гексаметафосфата натрия и довели рН 5% раствором соляной кислоты до рН 3,4. Образовавшийся осадок отделили центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут и растворили в 1,0 л 0,9% раствора натрия хлорида при подщелачивании 5% раствором натрия гидроксида до рН 7,0. Полученный раствор подвергли стерилизующей фильтрации через пластины с диаметром пор 0,22 мкм. Содержание белка в препарате составило 0,4 мг/мл.

Препараты, полученные с использованием предлагаемого способа, были отконтролированы согласно Фармакопейной статье 42-0504650105 «Вакцина коклюшно-дифтерийно-столбнячная адсорбированная жидкая (АКДС-вакцина)». При исследовании безвредности препаратов на белых беспородных мышах было показано, что препарат безопасен в дозах до 2,0 мг (Таблица 1).

Таблица 1
Иммунизация			Суммарный вес			Прибавка в весе
№ группы	Доза препарата	Количество животных	до введения, г	на 3 сутки, г	на 7 сутки, г	абсолют., г	относит., %
1	2 мг/мл бесклеточный препарат	10	149,2	176,5	202,8	53,6	85,6%
2	1 мг/мл бесклеточный препарат	10	149	173,4	203,4	54,4	86,9%
3	0,5 мг/мл бесклеточный препарат	10	149,8	175,8	200,3	50,5	80,6%
4	0,25 мг/мл бесклеточный препарат	10	150,2	177,4	213,4	63,2	100,9%
5	Контроль (0,9% р-р хлорида натрия)	10	150,1	179,3	212,7	62,2	100%
6	Корпускулярный препарат	10	150,6	175,8	195,5	44,9	72,2%

Как следует из таблицы 1, прибавка в весе мышей была максимальной в случае введения препарата, полученного по предлагаемому способу. При этом минимальная прибавка массы тела должна составлять не менее 60% от таковой в случае введения 0,9% раствора хлорида натрия.

Препарат обладал более низкой гистаминсенсибилизирующей активностью в сравнении с корпускулярным аналогом. Результаты отражены в Таблице 2.

Таблица 2
Препарат	Разведение	Кол-во животных в опыте
		взято	выживших
ОСО 5 (отраслевой стандартный образец)	20 МОЕ - 1 мл	5	0
	4 МОЕ - 1 мл	5	1
	0,8 МОЕ - 1 мл	5	3
Бесклеточный препарат (предлагаемое изобретение)	2 мг - 1 мл	5	5
	0,4 мг - 1 мл	5	5
	0,08 мг - 1 мл	5	5
Корпускулярный препарат (прототип)	20 МОЕ - 1 мл	5	2
	4 МОЕ - 1 мл	5	4
	0,8 МОЕ - 1 мл	5	5

Лимфоцитозстимулирующая активность корпускулярного и бесклеточного препаратов в тех же дозах была умеренной - 300-450 лимфоцитов в 100 квадратах камеры Горяева; против 250 лимфоцитов при введении 0,9% раствора натрия хлорида.

Для оценки протективных свойств противококлюшных препаратов использовали регламентированный тест Кендрик. При постановке теста были использованы мыши гибриды первого поколения (CBAхC57BL/6J). Сравнительная оценка разных серий бесклеточного препарата и корпускулярной вакцины показывает их сопоставимую иммуногенность (Таблица 3).

Таблица 3
Препарат	Заражающая доза нейротоксичного штамма В. pertussis 18323, клеток	Взято мышей в опыт	Выжило мышей	Процент выживаемости
Бесклеточный препарат с.1	100000	18	13	72,2%
Бесклеточный препарат с.2	100000	20	15	75,0%
Бесклеточный препарат с.3	100000	16	16	100%
Корпускулярный препарат с.1	100000	19	14	73,7%
Корпускулярный препарат с.2	100000	18	14	77,8%
Корпускулярный препарат с.3	100000	18	15	83,3%

Таким образом, при использовании бесклеточного препарата процент выживаемости иммунных мышей составлял от 72,2 до 100%, тогда как при использовании корпускулярного препарата - от 73,7 до 83,3%. Регламентированный показатель протективной активности составляет 70%.

При оценке гуморального иммунитета в опытах на аутбредных морских свинках было показано, что содержание антител в сыворотках животных двукратно иммунизированных бесклеточным и корпускулярным препаратами различалось недостоверно (Таблица 4).

Таблица 4
Препарат	Средняя геометрическая титра по реакции агглютинации*
	Первая прививка	Вторая прививка
Бесклеточный	160 (73,4-347,1)	1470 (659,2-3279,4)
Корпускулярный	149 (39,5-564,6)	1575 (887,3-2798,8)
* - величина, обратная разведению сыворотки

Изучение локальных иммуноморфологических реакций на введение патентуемого препарата и корпускулярной вакцины (прототип) проводили на мышах-тетрагибридах (CBA/C57BL/6J). В результате проведенных исследований было установлено, что иммунное воспаление при использовании бесклеточного препарата протекает по типу гиперчувствительности замедленного типа, тогда как при использовании корпускулярного препарата преобладает иммунокомплексный механизм, что может привести к развитию таких серьезных побочных реакций и осложнений, как васкулиты, артриты, нейропатии.

Таким образом, предложенный способ получения бесклеточной коклюшной вакцины позволяет получать препараты, обладающие высокой иммуногенной активностью и значительно сниженной реактогенностью по сравнению с корпускулярной вакциной.