способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) с целью индикации бруцелл в патматериале

Формула изобретения

Способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с целью индикации бруцелл в патматериале, включающий изготовление формалинизированных эритроцитов барана с последующей сенсибилизацией позитивной бруцеллезной сывороткой, отличающийся тем, что позитивную бруцеллезную сыворотку для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов разводят 1:50-1:100, инактивируют при 60°C в течение 30 мин, сенсибилизируют формалинизированные эритроциты инактивированной сывороткой, из расчета: осадок от 2 объемов 40%-ной взвеси эритроцитов барана, 1 объем 0,43-0,44%-ного раствора свежеприготовленного амидола, 1,0-1,5 объем позитивной сыворотки крови, разведенной 1:50-1:100, и выдерживают в течение 28-32 мин при 55-56°C.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к получению эритроцитарного бруцеллезного антительного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации, с целью индикации бруцелл в патматериале.

Известен «Способ получения эритроцитарного антительного диагностикума для индикации бруцелл в испытуемом материале», суть которого заключается в следующем. Для сенсибилизации эритроцитов используют позитивные бруцеллезные сыворотки крови, разведенные физиологическим раствором поваренной соли 1:80-1:100 или буферно-физиологическим раствором, инактивированным при 64°C в течение 20 минут, с оптимальной pH - 6,4-7,0.

Оптимальными параметрами условий сенсибилизации эритроцитов позитивными сыворотками крови являются следующие: 1 объем предварительно оттитрованной концентрации раствора амидола смешивают с 2 объемами 20%-ной взвеси фиксированных эритроцитов и 1 объемом позитивной бруцеллезной сыворотки крови в разведении 1:100, при инкубации в водяной бане при температуре 55°С в течение 25-30 минут, с периодическим встряхиванием через каждые 5-10 минут.

Сенсибилизированные эритроциты отмывают одним из стабилизаторов (нормальной лошадиной или кроличьей сыворотками), разведенных 1:100-1:500, на центрифуге при 1500-2000 об/мин в течение 5-10 минут двукратно, после чего суспендируют до 0,75%-ной концентрации изотоническим раствором поваренной соли и используют для постановки РНГА с целью индикации бруцелл: Ш.А. Барамова, автореф. дисс., к.в.н., 1988.

Недостатком данного способа является слабая активность диагностикума, изготовленного этим способом в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при индикации бруцелл в исследуемом материале. Кроме того, данный диагностикум в отдельных случаях спонтанно агглютинируются в РНГА нормальной кроличьей сывороткой, используемой в качестве стабилизатора для разведения исследуемых патматериалов, где отсутствуют бруцеллы. Поэтому мы решили разработать способ получения высокоактивного и специфичного бруцеллезного антительного эритроцитарного диагностикума для РНГА, лишенного указанных недостатков.

Целью изобретения является повышение активности и специфичности бруцеллезного антительного эритроцитарного диагностикума для РНГА. Эта цель достигается тем, что сенсибилизация эритроцитов барана (стабилизированных по Вайнбаху в нашей модификации) с помощью конъюгата амидола проводится по параметрам концентрации ингредиентов, рН, ионной силы среды, температуры и экспозиции.

Максимальная чувствительность и специфичность в РНГА получаются при следующих соотношениях ингредиентов: осадок от 2 объемов 40%-ной взвеси эритроцитов барана, 1 объем 0,43-0,44%-го раствора свежеприготовленного амидола и 1,0-1,5 объема позитивной сыворотки крови, разведенной 1:50-1:100 на 0,85%-ном растворе NaCl, pH - 7,0-7,2 в отсутствие фосфата буфера, инактивированного при 60°С в течение 30 минут, смесь перемешивают и выдерживают в водяной бане 28-32 минуты при 55-56°С, периодически встряхивая через каждые 5-6 минут.

Отмывание сенсибилизированных эритроцитов осуществляется 0,85%-ным раствором NaCl, содержащим нормальную кроличью сыворотку в разведении 1:50-1:100 или лошадиную сыворотку в разведении 1:220-1:250, инактивированные при 60°C в течение 30 минут, pH - 7,0-7,2. По окончании центрифугирования взвеси эритроцитов вносят в физиологический раствор с целью получения 2,5%-ной концентрации эритроцитов.

Предварительно активность и специфичность изготовленных антительных диагностикумов проверяют в РНГА, при исследовании единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК в предельных разведениях.

Проводили испытание антительного диагностикума, в сравнении с аналогичным препаратом, предложенным Ш.А. Барамовой.

Активность и специфичность антительного диагностикума, изготовленного по разработанному нами способу (антительный диагностикум Прикаспийского зонального НИВИ), проверяли в сравнении с аналогичным препаратом, предложенным Ш.А. Барамовой (прототип).

Для испытания диагностикума в РНГА исследовали единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК (табл.1).

Таблица-1
Результаты проверки активности диагностикумов в РНГА
Метод формалинизации эритроцитов	Концентрация амидола (%)
	0,24	0,27	0,30	0,32	0,34	0,36	0,38	0,40	0,43	0,44
	Выявлено бруцелл (тыс.м.к. в 1 мл)
По Вайнбаху в нашей модификации	с диагностикумом Прикасп. ЗНИВИ
	366,2	183,1	91,5	45,7	22,8	11,4	5,7	2,8	1,43	1,43
	с аналогом
	366,2	183,1	91,5	45,7	22,8	-	-	-	-	-

Как видно из данных, приведенных в таблице 1, разработанный нами диагностикум чувствительнее в 15,9 раза, в сравнении с аналогом.

Испытание антительного диагностикума в сравнении с аналогичным препаратом, изготовленным по методике Ш.А.Барамовой

Для испытания антительных диагностикумов в РНГА исследовали суспензии лимфоузлов и органов у здорового крупного рогатого скота (20 голов) и 30 - овец. Результаты проверки специфичности указанных диагностикумов представлены в таблице 2.

Таблица-2
Результаты проверки специфичности антительных диагностикумов в РНГА
Материал (суспензия)	Количество голов	Исследовано органов и лимфоузлов	Прикасп. ЗНИВИ вРНГА		Аналог в РНГА
			пол.	отр.	пол.	отр.
Из органов и лимфоузлов здорового кр. рог. скота	20	200		200	1	199
Из органов и лимфоузлов овец	30	150		150	2	148

Как видно из таблицы 2, при исследовании в РНГА антительным эритроцитарным диагностикумом, изготовленным по разработанному нами способу (антительный диагностикум Прикасп. ЗНИВИ), со всеми органами и лимфоузлами суспензий здоровых животных получен отрицательный результат, что показывает его высокую специфичность, тогда как по аналогу получен в 3 случаях положительный результат, т.е. прототип в отдельных случаях дает неспецифические реакций с суспензией здоровых животных.

Кроме того, аналог в отдельных случаях спонтанно агглютинируется в РНГА нормальной кроличьей сывороткой, используемой в качестве стабилизатора для разведения исследуемого патматериала для выявления возбудителя бруцеллеза, особенно, когда pH среды - 6,4, как это рекомендует Ш.А. Барамова.

Оказалось, что удлинение времени сенсибилизации эритроцитов до 32 минут привело к повышению чувствительности индикации возбудителя бруцеллеза, а с повышением температуры выше 28-32°C, при длительности контакта эритроцитов с позитивной сывороткой более 40-60 минут, развивалась спонтанная гемагглютинация (табл.3).

Таблица-3
Результаты индикации оптимальных параметров температуры и экспозиции сенсибилизации эритроцитов позитивной сыворотки крови (диагн. Прикасп. ЗНИВИ)
Разведение позитивной бруцеллезной сыворотки (сенситина)	Температура при экспозиции (мин.)
	45°C			50°C			55-56°C			60°C
	28	32	40	28	32	40	28	32	40	28	32	40
1:40	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
1:50	-	-	-	-	-	-	Дв	Дв	Спонтанная гемагглютинация
1:100	-	-	-	Дс	Дс	Дч	Дв	Дв	-//-	-//-	-//-	-//-
1:150	-	-	-	Дч	Дч	Спонтанная гемагглютинация			-//-	-//-	-//-	-//-
Примечание:	Дс - диагностикум, показавший в РНГА слабую чувствительность;
	Дч - диагностикум чувствительный, но с недостаточно высоким титром;
	Дв - диагностикум высокочувствительный;
	Спонт. гемаггл. - диагностикум, показавший в РНГА спонтанную гемагглютинацию;
	- диагностикум, показавший в РНГА отрицательный результат.

Многие исследователи (Чернышева М.Н. (1970), Садыков С.Ж. (1974), Абуталипов А. (1982), Ромахов В.А. (1992) и др.) для выявления бруцеллезного антигена а патматериале использовали реакцию нейтрализации антител (РНАт) и бактериологический метод. Поэтому мы решили провести сравнительное испытание диагностической эффективности антительного бруцеллезного диагностикума для РНГА (Прикасп. ЗНИВИ), реакции нейтрализации антител (РНАт) и бактериологического метода.

С этой целью был подвергнут исследованию патологический материал от больного бруцеллезом крупного рогатого скота (7 голов), овец (11 голов), молоко, инфицированное возбудителем этой болезни (5 проб) и водопроводная вода, инфицированная бруцеллами (вакцинным штаммом B.abortus 19) (3 пробы). Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица-4
Результаты сравнительного испытания различных методов для индикации бруцеллезного антигена в исследуемом материале
Материал	Исследова-но проб	Выявлен бруцеллезный антиген
		бактериологическим методом		РНАт		РНГА с антительным диагностикумом (ПЗНИВИ)
		пол.	отр.	пол.	отр.	пол.	отр.
Экстракт органов и лимфоузлов кр. рог. скота	7	5	2	6	1	7	-
Экстракт из органов и лимфоузлов от овец	11	10	1	10	1	11	-
Молоко, инфицированное бруцеллами	5	4	1	4	1	5	-
Водопроводная вода, инфицированная бруцеллами	3	3	-	3		3
Всего	26	22	4	23	3	26	-

Проведенными исследованиями установлены специфичность и высокая чувствительность антительного эритроцитарного диагностикума для выявления бруцеллезного возбудителя в патматериале, молоке и других объектах внешней среды.

При сравнительном испытании антительного эритроцитарного бруцеллезного диагностикума для РНГА с РНАт установлено, что антительный диагностикум чувствительнее в 22 раза. Кроме того, РНГА с антительным диагностикумом проста в постановке, РНАт является более сложной трехкомпонентной реакцией (положительная сыворотка + бруцеллезный антиген + эритроцитарный бруцеллезный антиген).

Бруцеллезный антительный диагностикум для РНГА по диагностической ценности и быстроте получения результатов превосходит также бактериологический метод исследования.

ЛИТЕРАТУРА

Абуталипов А. Сравнительная диагностическая эффективность РИФ, РНАт и бактериологического метода при бруцеллезе. Вестник с/х науки Казахстана, 1982, № 5, с.75-77.

Ромахов В.А. Дисс. д.в.н. в форме научного доклада, 1992.

Садыков С.Ж. Диагностическая эффективность РНГА и РНАт при бруцеллезе, «Ветеринария», 1974, № 6, с. 107-108.

Чернышева М.И. с соавт. Сухой эритроцитарный диагностикум для реакции пассивной гемагглютинации и РНАт при бруцеллезе, ЖМЭИ, 1970, № 12, с. 171 и др.