способ получения биологически активной кормовой добавки

Формула изобретения

1. Способ получения биологически активной кормовой добавки из растительного сырья, предусматривающий аэробное глубинное культивирование пробиотической целлюлолитической бациллы Bacillus subtilis 8130 до получения титра вегетативных клеток не менее 10⁹ КОЕ/мл, контроль на отсутствие спор в клетках бациллы, смешивание полученной жидкой культуры с растительным сырьем в массовом соотношении, обеспечивающем получение 45-70% влажности массы, к полученной смеси добавляют бикарбонат натрия до достижения рН среды 7,0-7,5 и проводят твердофазную ферментацию при затрудненном доступе кислорода в течение 2-4 сут до получения конечного продукта с общим количеством клеток бациллы не менее 10⁹ клеток/г.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют облепиховый, шиповниковый, подсолнечниковый шрот или жмых, отходы мукомольного производства, производства круп, в том числе, рисовую шелуху, шелуху гречихи.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к кормопроизводству, в частности к способам приготовления биологически активных кормовых добавок для млекопитающих, птиц, рыб, повышающих эффективность пищеварения, основанных на переработке целлюлозосодержащего субстрата из растительного сырья и отходов.

К числу перспективных направлений микробной биотехнологии относится создание биологически активных пробиотических препаратов, оказывающих разностороннее действие на животный организм и позволяющих применять их как для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, так и для стимуляции роста и повышения продуктивности животных. В настоящее время разработаны способы получения пробиотических препаратов, имеющих в своем составе бактерии вида Bacillus subtilis.

Известно, что бациллы продуцируют различные биологически активные вещества: ферменты, аминокислоты, витамины, антибиотики и обладают выраженным иммуномодулирующим действием в полости желудочно-кишечного тракта. Физиолого-биохимические свойства бацилл позволяют использовать их в составе лечебно-профилактических пробиотических препаратов и в составе кормовых биологически активных добавок.

Из уровня техники известны пробиотические препараты и способы их получения на основе культуры В.subtilis, предназначенные для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы. Например, штамм бактерий В.subtilis ВКМ В-2250Д используют для получения пробиотического препарата «Субтилис», который нормализует деятельность желудочно-кишечного тракта животных и перспективен в лечении и профилактике бактериальных инфекций (1). Препарат представляет собой жидкую споровую культуру бактерий В.subtilis (80-90% спор) или лиофильно высушенные клетки со спорами. Недостатком препарата в сухой форме является применение спор бактерий, что может вызвать загрязнение спорами окружающей среды при смешении с кормом и кормлении животных. Жидкая форма препарата не удобна для транспортировки, длительного хранения.

Известен способ получения лечебно-профилактического корма для животных, включающий введение в измельченный корм пробиотика на основе культуры бактерий В.subtilis ВКПМ-В-4759 в сухом (лиофилизованном) виде, смешивание компонентов корма с пробиотиком, нагрев острым паром до температуры 65-95° и гранулирование (2). Однако стадия смешения споровой бактерии в сухом виде с кормом создает опасность повышенного обсеменения спорами воздуха и производственных помещений.

Известен способ кормления сельскохозяйственных животных, при котором к основному рациону добавляют отход производства препарата «Биоспорин» - пробиотика из ассоциации бацилл В. subtilis ВКПМВ-2335(3) и В.licheniformis ВКПМВ-2336 (31). Отходом является фугат, полученный после отделения клеток, который используют в жидком виде в рационах животных ежедневно в период откорма или курсами по 14-21 день. Обоснованием к применению фугатов в качестве кормовой добавки в животноводстве является то, что содержащиеся в препарате клетки В.subtilis ВКПМВ-2335 (3) и В.licheniformis ВКПМВ-2336 (31) способствуют стабилизации нормальной микрофлоры кишечника, вытеснению патогенных и условно патогенных микроорганизмов, обеспечивают защиту от кишечных вирусов за счет стимуляции местного иммунитета, продукции интерферона и повышения общей резистентности организма (3). В фугате присутствует остаточное количество клеток бацилл, обеспечивающее его некоторую биологическую эффективность. Следует отметить, что получение пробиотиков, состоящих из ассоциации нескольких видов бактерий, требует контроля за сохранением необходимого соотношения форм бактерий в ассоциации для обеспечения стабильных показателей качества препарата и его отхода - фугата. Однако фугат не удобен для длительного хранения и транспортировки.

Приведенные выше примеры основаны на глубинном аэробном культивировании бацилл для накопления биомассы бактерий в жидкой питательной среде (2-3% сухих веществ в культуральной жидкости) и получении спор, в то время как естественные условия пищеварительного тракта - анаэробные, влажность химуса не превышает 75%, а микроорганизмы, обитающие в кишечном тракте, представлены вегетативными клетками. Кроме того, при получении препаратов не учитываются целлюлолитические свойства В.subtilis и не используются клетчатковые субстраты для выращивания клеток.

Известен способ получения корма для животных из растительного сырья, включающий измельчение растительного сырья и его ферментативный гидролиз, который осуществляют путем внесения в растительный субстрат предварительно приготовленного препарата на основе содержимого слепой кишки обыкновенной полевки Microtus arvalis (4). Однако предложенная ассоциация бактерий не может длительное время сохранять стабильное соотношение входящих в нее компонентов, что создает трудности для получения препарата с заданными свойствами.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биологически активной кормовой добавки с помощью твердофазного процесса обработки целлюлозосодержащего сырья в факультативно-анаэробных условиях (5) прототип. Способ включает получение посевного материала, внесение его в количестве 2-10% в растительный субстрат (различные типы шротов, сухую пивную дробину, отруби и т.д.). Затем влажную массу помещают в условия затрудненного доступа кислорода (например, запаянные полиэтиленовые пакеты) и проводят твердофазную ферментацию субстрата в течение 5-48 часов. В качестве монокультуры бактерий, использующейся для получения биологически активной кормовой добавки, применена бацилла В.subtilis B-8130. Введение в комбикорм сухой пивной дробины, обогащенной препаратом, содержащим клетки В.subtilis 8130 (препарат Пробиоцел), и скармливание корма поросятам позволяет увеличить привесы животных за счет повышения усвояемости корма, снизить затраты комбикорма на 1 кг прироста живой массы поросят (6). Однако использование указанной дозы посевного материала В.subtilis 8130 для твердофазной ферментации растительного субстрата в факультативно-анаэробных условиях не вызывает накопления большого числа клеток бациллы Поэтому для обеспечения поступления в организм животного эффективного количества клеток пробиотика необходимо вводить в рацион животных относительно большое количество препарата (5% на тонну комбикорма). Это делает производство препарата крупнотоннажным и вызывает ряд трудностей: увеличение производственных площадей, обеспечение механизмами для подъема и транспортировки грузов, увеличение площади складских помещений, что удорожает стоимость препарата.

Для усиления биологической эффективности продуктов твердофазной ферментации при затрудненном доступе кислорода и увеличения численности клеток пробиотика в препарате, разработан способ получения биологически активной кормовой добавки, включающий две стадии ее получения глубинное аэробное культивирование пробиотических бактерий вида Bacillus subtilis с целлюлолитическими свойствами (к числу которых относится штамм В subtilis B-8130) для накопления биомассы клеток (первая стадия), и последующая твердофазная ферментация растительного сырья при затрудненном доступе кислорода (вторая стадия). Процесс осуществляют в присутствии бикарбоната натрия (NaHCO₃) для связывания ацетил-КоА и нейтрализации кислых продуктов ферментации, тем самым применяют метод метаболитной ловушки по Нейбергу для дрожжевого брожения.

Техническим результатом изобретения является стабильное улучшение пищеварения, повышение привесов и продуктивности животных, уменьшение падежа молодняка и увеличение сохранности поголовья.

При создании изобретения решается задача разработки биологически активной добавки, обладающей свойствами пробиотических препаратов, способствующей нормализации и активизации микробиоценоза кишечника, стимулирующей пищеварение, что способствует повышению усвояемости кормов и увеличивает привесы и продуктивность животных.

Для достижения технического результата при приготовлении биологически активной кормовой добавки на основе растительного сырья и целлюлолитической культуры В.subtilis В-8130 проводят аэробное глубинное культивирование бактерии до получения титра вегетативных клеток не менее 10 ⁹ КОЕ/мл, при этом осуществляют контроль на отсутствие спор в клетках бациллы, затем смешивают полученную жидкую культуру с растительным сырьем в весовом соотношении, обеспечивающем получение 45-70% влажности массы, к смеси добавляют бикарбонат натрия до достижения рН среды 7,0-7,5, и осуществляют процесс твердофазной ферментации при затрудненном доступе кислорода в течение 2-4 суток до получения конечного продукта с общей численностью клеток бациллы - не менее 10⁹ КОЕ/г. Аэробное глубинное культивирование бациллы В.subtilis B-8130 осуществляют, например, на глюкозо-пептонной питательной среде, состава, г/л глюкоза - 20.0, пептон - 4.0, дрожжевой экстракт - 1.5, (NH ₄)₂HPO₄ - 1.5, MgSO₄ - 0.5, рН 7.2-7.4, что не ограничивает применения других целлюлолитических штаммов бактерий вида В.subtilis, и питательных сред иного состава. В качестве растительного сырья для твердофазной ферментации используют сухие клетчатковые субстраты (облепиховый, шиповниковый, подсолнечниковый шрот или жмых, отходы мукомольного производства, производства круп, в том числе, рисовую шелуху, шелуху гречихи, и т.п.).

Ниже приведены примеры получения биологически активной кормовой добавки.

Пример 1

Для получения препарата в количестве, необходимом для введения в 1 тонну комбикорма, проводят аэробное глубинное культивирование бациллы В.subtilis 8130 в 0.5 л глюкозопептонной питательной среды до достижения титра клеток 1.2×10⁹ КОЕ/мл. Осуществляют контроль на отсутствие спор в клетках и определяют эндоглюканазную активность (вискозиметрическим способом), которая составляет 7.0-14.0 ед./мл, протеазу, активность которой составляет до 120 ед./мл по методу Ансона. Полученные 0.5 л жидкой культуры смешивают с 0.6 кг подсолнечникового шрота для достижения влажности массы 45% и добавляют бикарбонат натрия (сода питьевая) до рН 7,0-7.2. Растительное сырье предварительно стерилизуют сухим жаром при 120°С, с помощью УФ-излучения или автоклавированием.

Сырую массу помещают в емкость в условия затрудненного доступа кислорода и проводят твердофазную ферментацию в течение 2 суток. Для ограничения доступа кислорода массу помещают высоким слоем в специальное оборудование типа закрытого смесителя с регулируемым нагревом, или ею заполняют до верха бочки или полиэтиленовые пакеты мешки, которые закрывают крышками, или плотно завязывают и помещают в термокамеру. Продукт ферментации представляет собой биотрансформированное растительное сырье, содержит общее количество клеток 10⁹ КОЕ/г, низкомолекулярные метаболиты (производные пропионовой и масляной кислот, низкомолекулярные амины, ароматические спирты, кислоты эфиры).

Пример 2

Проводят глубинное культивирование В.subtilis 8130, как в примере 1, до получения жидкой культуры с титром вегетативных клеток бациллы 1.5×10⁹ КОЕ/мл. Осуществляют микробиологический контроль в пробе на отсутствие в клетках спор. Затем проводят смешивание полученной жидкой культуры (0,5 л) с воздушно-сухим облепиховым шротом (п.2 формулы) в количестве 0.4 кг шрота, влажность полученной массы 70%. К смеси добавляют бикарбонат натрия в количестве, обеспечивающем достижение в смеси рН 7,5. Затем осуществляют процесс твердофазной ферментации при затрудненном доступе кислорода в течение 4 суток до получения конечного продукта с общим количеством клеток бациллы 5×10 ⁹ КОЕ/г. В конечном продукте присутствуют уксусная, пропионовая, масляная, гексановая кислоты.

Пример 3

Осуществляют, как в примере 1, глубинное культивирование бациллы В.subtilis 8130 до получения вегетативных клеток - 1.4×10 ⁹ КОЕ/мл. Смешивание жидкой культуры В.subtilis 8130 в количестве 0.5 л проводят с измельченной кожурой семян гречихи (п.2 формулы) в количестве 0.45 кг (влажность полученной сырой массы 60%), добавляют бикарбонат натрия в количестве, необходимом до достижения рН 7,3 и ведут твердофазную ферментацию в полностью заполненных и запаянных полиэтиленовых пакетах в течение 3 суток до получения конечного продукта с общим количеством клеток бациллы 2×10⁹ КОЕ/г.

В качестве растительного субстрата возможно использовать облепиховый, подсолнечниковый, шиповниковый шрот, измельченную кожуру семян гречихи и др. (см. п.2 ф-лы).

Подбор вышеуказанных параметров обусловлен оптимальными режимами для накопления клеток и активации выделения клетками биологически активных метаболитов.

Предложенные параметры при осуществлении заявленного способа получения биологически активной кормовой добавки для сельскохозяйственных животных являются оптимальными для получения высокоэффективной добавки - стимулятора пищеварения у животных и способствуют увеличению усвояемости корма, что увеличивает продуктивность, прирост живой массы животных при введении 0.25-0.5 кг добавки на тонну комбикорма (0.025-0.05%), т.е. при производстве кормовой добавки заявленным способом достигается технический результат изобретения.

При введении соды в процессе твердофазной ферментации рН реакционной массы не снижается ниже 5.8-5.9, и при этом эндоглюканаза и протеаза расщепляют целлюлозу и растительные пептиды, образуются низкомолекулярные органические кислоты, в том числе уксусная, пропионовая, масляная и гексановая кислоты, которые являются стимуляторами пищеварения. В продуктах ферментации определяются также низкомолекулярные амины, ароматические соединения. Бактериальная ферментация растительного субстрата ведет также к увеличению в продукте ферментации содержания аминокислот, в наибольшей степени - глутаминовой кислоты и гистидина. В препарате на основе облепихового шрота доля глутаминовой кислоты в сумме аминокислот составила 5,2%, гистидина - 0,84%, которые стимулируют обмен веществ, что в комплексе с другими отмеченными низкомолекулярными метаболитами обеспечивает заявленный технический результат.

Пробиотические функции В.subtilis B-8130 в препарате, полученном заявленным способом, могут проявляться в стимуляции развития отдельных видов представителей кишечного микробиоценоза (лактобактерий, руминококков), увеличении эффективности пищеварения, в стимуляции азотистого обмена веществ у животного, что ведет к увеличению мышечной массы.

Для доказательства этого предложения были изучены зоотехнические показатели бройлеров кросса Сибиряк, получавших комбикорм с 0.025% препарата на основе твердофазной ферментации облепихового шрота при затрудненном доступе кислорода в течение 2-х суток заявленным способом по данному изобретению и содержащего общее количество клеток бациллы 1.5×10 ⁹ клеток/г (группа Опытная 1) и бройлеров кросса ИЗА-15, получавших комбикорм с 0.05% препарата на основе твердофазной ферментации облепихового шрота при затрудненном доступе кислорода в течение 3-х суток заявленным способом по данному изобретению и содержащего общее количество клеток бациллы 1.6×10 ⁹ КОЕ/г (группа Опытная 2). Контрольная группа 1 не получала никаких препаратов, контрольная группа 0 получала комбикорм с 5% препарата-аналога с В.subtilis B-8130 (препарат Пробиоцел), контрольная группа 2 получала кормовой антибиотик «Флавомицин». Все группы цыплят получали одинаковый полнорационный корм. Показатели продуктивности откорма приведены в таблице.

Показатели продуктивности откорма бройлеров
Показатель	Бройлеры кросса Сибиряк			Бройлеры кросса ИЗА-15
	Контроль 0	Контроль 1	Опыт 1	Контроль 2	Опыт 2
Число цыплят в группе	40	50	50	24820	28943
Возраст при убое, дни	43	43	43	42	42
Сохранность, %	92.0	91.0	92.5	93.4	93.0
Среднесуточный привес, г	43.1	41.5	44.8	45.4	47.4
Среднесдаточный вес 1 головы, г	1910	1825	1970	1941	2054
Расход корма, кг на кг привеса	-	-	-	1.89	1.89
Конверсия корма, ц.к. ед.	1.98	2.05	1.93	-	-

Как показывают данные таблицы, при экспериментальном кормлении препаратами в течение 42-43-х дней в конце эксперимента увеличилась сохранность поголовья, приближаясь к показателям при введении кормового антибиотика, среднесуточный привес в опытных группах увеличился на 4.5-8%. Среднесдаточный вес 1 головы увеличился на 6-8% по сравнению с контрольными группами 1 и 2. Уменьшение конверсии корма в среднем на 3% на 1 голову свидетельствуют о повышении эффективности пищеварения у опытных бройлеров. Вместе с тем, опытные птицы показали лучшие технические результаты по сравнению с контрольной группой 0 по показателям среднесдаточного веса 1 головы, среднесуточным привесам и конверсии корма, что указывает на преимущества нового способа получения препарата заявленным способом по данному изобретению перед ближайшим аналогом.

Литература

1. RU 2184774 С1, C12N 1/20, 10.07.2002.

2. RU 2140165 С1, A23K 1/00, 27.10.1999.

3. RU 2236147 C2, A23K 1/00, 20.09.2004.

4. RU 2153813 С1, A23K 1/165, 10.08.2000.

5. RU 2202224 C2, A23K 1/165, 20.04.2003 (прототип).

6. RU 2284703 С1, А23К 1/06, 10.10.2006.