средство для повышения целлюлазной активности

Формула изобретения

Средство для повышения целлюлазной активности, представляющее собой -(3',5'-дитрет-бутил-4'-гидроксифенил)пропионовую кислоту (фенозан-кислота) или ее калиевую соль (фенозан-К).

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для повышения эффективности ферментативного расщепления целлюлозосодержащих субстратов в технологиях переработки целлюлозосодержащих отходов, в спиртовой, пищевой, целлюлозно-бумажной отраслях промышленности, в кормопроизводстве, в технологиях обработки тканей из природных растительных волокон и др.

Повышение эффективности гидролиза целлюлозы имеет важное практическое значение, поскольку позволяет увеличить выход целевого продукта и снизить расход дорогостоящих ферментных препаратов в процессе получения глюкозы из целлюлозосодержащих субстратов (ЦСС).

Один из путей повышения эффективности расщепления ЦСС - создание с помощью методов мутационной селекции и генной инженерии новых штаммов, продуцирующих целлюлазные комплексы с улучшенными свойствами, например, изобретения [RU 2303065 С1, 20.07.2007], [WO 2008139641 А1, 20.11.2008] и др. Эти работы требуют значительных затрат времени и ресурсов, получаемые препараты имеют высокую стоимость. Поэтому актуальным является поиск способов повышения эффективности уже известных, применяемых в настоящее время ферментных препаратов.

Например, известен способ повышения целлюлазной активности в процессе обработки текстильных материалов путем повышения ионной силы содержащего фермент водного раствора до величин, превышающих 20 mM [WO 9929821 А1, 17.06.1999]. Описан способ повышения активности некоторых ферментов, в том числе целлюлаз, путем очистки исходных ферментсодержащих растворов с использованием активированного угля [с.а. 2518056 А1, 23.09.2004, US 2004259219 А1, 23.12.2004]. Однако эти подходы адаптированы к решению конкретных технологических задач и не могут рассматриваться в качестве универсальных способов повышения активности целлюлаз.

Повышения целлюлазной активности можно достичь, исключив или уменьшив влияние ингибиторов, которые могут присутствовать в реакционной среде. По данным, приведенным в описании к изобретению [US 4912056 А, 27.03.1990], к числу ингибиторов целлюлаз относятся ионы тяжелых металлов - меди, цинка, хрома, ртути, свинца, марганца, а также ионы серебра и их соединения, для нейтрализации которых используют хелатирующие и осаждающие агенты, например силикат или сульфат магния. В качестве ингибиторов могут также выступать целлобиоза, глюкоза, глюконолактон, а также соли высших жирных кислот и катионные ПАВ. Если совместного присутствия этих веществ и целлюлаз избежать нельзя, необходимо предотвратить непосредственный контакт путем таблетирования или капсулирования. Предложенная в заявке целлюлазосодержащая композиция для технологической обработки джинсовой ткани может содержать в качестве активаторов металлы (кобальт, магний, кальций, калий, натрий) и их соли, а также моносахариды (маннозу и ксилозу).

В изобретении [RU 2292734 С2, 10.02.2007] описан способ повышения эффективности целлюлолитического препарата целловиридина Г20х, включенного в дефицитный по меди рацион цыплят-бройлеров, содержащий медь в количестве менее 8 мг/кг. Способ предусматривает дополнительное включение меди в рацион в дозировке 4-6 мг/кг корма. Повышение эффективности действия целловиридина оценивали косвенно по увеличению прироста живой массы птицы. Не исключено, что на увеличение массы птицы влияли и другие не учтенные в эксперименте факторы.

Известна композиция для улучшения усвоения пищевых компонентов, включающая, наряду с другими ферментами, комплекс целлюлаз и кофакторов, усиливающих их активность [US 20030099626 А1, 29.05.2003, US 20080014623 A1, 17.01.2008]. В качестве кофакторов композиция включает по отдельности или в смеси соли марганца (цитрат, глюконат), а также хелатные комплексы марганца и аминокислот в количестве около 1 мг на каждые 3-400 ед. целлюлазной активности.

Как видно из приведенных источников, влияние добавок металлов на активность целлюлаз неоднозначно и, по-видимому, зависит от множества дополнительных, не всегда учитываемых факторов.

Известна композиция для очистки контактных линз [US 4710313, 01.12.1987], содержащая, по крайней мере, одну гликозидазу, выбранную из группы: амилаза, целлюлаза, пектиназа, гемицеллюлаза, альгиназа, гепариназа и декстраназа, и, по крайней мере, один активирующий агент, выбранный из группы: мочевина, тиомочевина, соли гуанидина, аминокислоты и их соли, тиопроизводные глицерина и других полиатомных спиртов. При этом количественное содержание компонентов составляет (вес.%): гликозидаза 0,005-10, активирующий агент 0,01-20.

Использование относительно больших количеств активатора может иметь негативные последствия, особенно в тех случаях, когда композиция предназначена для использования в составе кормовой или пищевой добавки. Если целевой продукт предназначен для дальнейшей биотехнологической обработки, например для получения биоэтанола, то наличие в реакционной системе большого количества органических или неорганических добавок может потребовать стадий дополнительной очистки, что приведет к усложнению и удорожанию процесса.

Задачей настоящего изобретения является поиск средства (активатора), способного в малых и сверхмалых концентрациях повышать активность ферментативного расщепления целлюлозосодержащих субстратов.

Поставленная задача решается тем, что в качестве средства для повышения целлюлазной активности (активатора) применяют фенозан-кислоту - -(3',5'-дитрет-бутил-4'-гидроксифенил)пропионовую кислоту или ее соль, преимущественно калиевую соль - фенозан-К.

Следует отметить, что в условиях ферментации в кислой среде заявляемый активатор существует в форме фенозан-кислоты, независимо от того, в какой форме -кислоты или соли, было взято исходное соединение. Таким образом, действующим началом заявляемого активатора является фенозан-кислота.

Фенозан-кислота и ее производные (эфиры, соли) относятся к классу экранированных фенолов и известны как активные антиоксиданты - ингибиторы процессов свободно-радикального окисления.

Фенозан-кислота и ее производные производятся в промышленных масштабах и благодаря высокой антиоксидантной активности находят применение в качестве стабилизаторов полимеров [RU 2017764 С1, 15.08.1994], в качестве субстанций для лекарственных и косметических средств [RU 2201226 С1, 27.03.2003, RU 2063743 С1, 20.07.1996], в качестве кормовой добавки [RU 2073459 С1, 20.02.1997].

В основе настоящего изобретения лежит обнаруженная нами впервые способность фенозансодержащих соединений - фенозан-кислоты и ее солей, в частности калиевой соли фенозан-К, оказывать активирующее действие по отношению к ферментам, обладающим целлюлазной активностью. Эта способность проявляется в широком диапазоне концентраций - от «обычных» (под «обычными» концентрациями понимают интервал концентраций, в котором обычно проявляется антиоксидантная активность производных фенозан-кислоты) до сверхнизких, соответствующих концентрациям, меньшим чем 10^-11 М.

Технический результат заявляемого изобретения - увеличение скорости образования и выхода целевого продукта расщепления целлюлозы - глюкозы под действием комплекса целлюлолитических ферментов в присутствии в реакционной системе заявляемого активатора и, как следствие, возможность уменьшения расхода ферментного препарата и сокращения времени инкубирования.

Для демонстрации возможности получения указанного технического результата использован ферментный препарат целловиридин ГЗХ, продуцируемый грибом Trichoderma Viride. Целловиридин ГЗХ содержит комплекс ферментов, катализирующих расщепление целлюлозы до олиго-, ди- и моносахаридов - эндоглюканазу, целлобиогидролазу и -глюкозидазу.

Для измерений использованы два образца целловиридина ГЗХ производства ОАО (БК) «Восток», взятые из разных партий препарата (образец ЦВ-1 и образец ЦВ-2), обнаружившие различный уровень целлюлолитической активности, которую оценивали по скорости накопления общих сахаров с помощью фенол-серного метода [Пустовалова Л.М. Практикум по биохимии / Ростов-на-Дону.: Феникс, 1999. 542 с.].

Для освобождения от нерастворимых в водной среде компонентов и получения образцов, содержащих комплекс растворимых в водной среде целлюлаз, «кашицу» из исходного порошка целловиридина в ацетатном буфере рН 4,5 центрифугируют, а надосадочную жидкость используют для исследования.

В качестве ферментного субстрата используют микрокристаллическую целлюлозу (МКЦ) производства фирмы Merck.

Реакцию ферментативного расщепления МКЦ проводят при перемешивании в ацетатном буфере рН 4,5, содержащем 50 мг/мл МКЦ и предусмотренные условиями эксперимента количества водорастворимых белков целловиридина и активатора. Температура инкубирования 40°С, время инкубирования 30 и 120 минут.

Исходный раствор фенозана-К с концентрацией 10 ^-3 М готовят растворением навески препарата в ацетатном буфере. Более низкие концентрации получают последовательным 100-кратным разбавлением исходного раствора ацетатным буфером. В качестве контроля используют образцы, содержащие вместо раствора фенозана-К указанный ацетатный буфер. Аналогично готовят растворы фенозан-кислоты, однако, учитывая ее более низкую растворимость в воде, исходный раствор фенозан-кислоты готовят с добавлением небольшого количества этилового спирта, а для дальнейшего разбавления исходного раствора используют ацетатный буфер. С практической точки зрения более удобно использовать фенозан-К, однако, как было сказано выше, фенозан-кислота и ее соли, в частности фенозан-К, обладают одинаковым активирующим действием по отношению к ферментному комплексу.

В качестве меры целлюлазной активности исследованных образцов целловиридина 3ГХ использована концентрация глюкозы, образовавшейся за фиксированный промежуток времени при расщеплении МКЦ, содержащейся в реакционной системе в концентрации 50 мг/мл, под действием ферментного препарата, взятого в определенной концентрации, в присутствии активатора или без него (контроль). Концентрацию белка определяют методом Лоури [Lowry О.Н., Rosebrough N.J., Fare A.L., Randall R.J / J.Biol. Chem. 1951. V.193. N1. p.265-275]. Концентрацию глюкозы определяют глюкозооксидазным методом [Клесов А.А., Рабинович М.Л., Синицын А.П., Чурилова И.В., Григораш С.Ю. // Биоорган химия. 1980. Т.6. № 8. С.1225-1242] с использованием набора реактивов «Новоглюк-К, М».

В таблице приведены примеры, показывающие влияние различных концентраций фенозана-К на концентрацию целевого продукта - глюкозы - в процессе расщепления МКЦ препаратом целловиридина 3ГХ (образец ЦВ-1).

Влияние различных концентраций фенозана-К на изменение концентрации глюкозы (относительно контроля) в процессе расщепления МКЦ целловиридином 3ГХ (образец ЦВ-1, концентрация белка 0,62 мг/мл, концентрация МКЦ 50 мг/мл). Время инкубации 30 мин. и 120 мин
Концентрация фенозана-К в реакционной среде, М	Изменение концентрации глюкозы в реакционной среде по отношению к контролю
30 мин	120 мин
0 (контроль)	1,0	1,0
5×10 -5	2,05	1,13
10-5	1,43	1,32
5×10-7	1,19	1,18
5×10 -9	0,86	1,20
5×10-11	1,97	1,17
5×10-13	1,93	1,78
5×10 -15	1,29	2,27
5×10-17	1,91	1,75

Данные таблицы показывают, что введение в реакционную среду добавок фенозана-К влияет на ферментативную активность целлюлазного комплекса, оцениваемую по накоплению целевого продукта - глюкозы. В зависимости от концентрации добавки это влияние носит волнообразный характер, что свойственно известному характеру проявления свойств веществ в сверхмалых концентрациях [Е.Б.Бурлакова, Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.3-11].

При 30-минутной инкубации максимальной активации целлюлазного комплекса достигают при использовании фенозана-К в «обычной» концентрации 5×10^-5 М, позволяющей удвоить выход глюкозы по отношению к контролю. Второй максимум приходится на диапазон сверхнизких концентраций 5×10^-11-5×10^-17 М, при этом рост целлюлазной активности ферментного комплекса, как и в присутствии «обычной» концентрации активатора, достигает почти 100%.

При проведении ферментации в течение 120 минут максимальное, в среднем двукратное увеличение выхода целевого продукта получают в присутствии сверхмалых концентраций фенозана-К 5×10^-13-5×10^-17 М.

Таким образом, данные таблицы показывают, что заявляемое средство оказывает активирующее действие по отношению к целлюлазному ферментному комплексу в широком концентрационном диапазоне 10^-5 -10^-17 М. Принимая во внимание известный характер проявления свойств веществ в сверхмалых дозах (СМД) [Е.Б.Бурлакова, Российский химический журнал, 1999, т.18, № 5, с.3-11], нельзя исключить, что заявляемая добавка будет проявлять активирующее действие и в еще более низких концентрациях.

На чертеже показано: А - зависимость начальной скорости ферментативного гидролиза МКЦ от концентрации целловиридина 3ГХ при добавлении фенозана-К в «обычной» и сверхнизких концентрациях; Б - зависимость выхода глюкозы от концентрации целловиридина при добавлении фенозана-К в «обычной» и сверхнизких концентрациях. Время реакции 2 часа. Данные получены для целловиридина 3ГХ (образец ЦВ-2) в диапазоне концентраций по белку 0,15-0,62 мг/мл.

Как видно из чертежа, А, введение заявляемого активатора в реакционную систему, содержащую 0,15-0,62 мг/мл комплекса целлюлаз, в концентрациях, соответствующих его максимальному активирующему действию, приводит к возрастанию начальной скорости расщепления МКЦ в 1,3-1,5 раза, причем этот эффект мало зависит от концентрации ферментного комплекса. Для достижения одинаковой с контролем начальной скорости образования глюкозы в присутствии активатора требуется примерно вдвое меньшее количество ферментного комплекса, чем в его отсутствии (контроль). Из чертежа видно, что для получения одинакового с контролем выхода глюкозы в присутствии заявляемого активатора, в том числе в сверхнизких концентрациях, требуется в 1,3-1,5 раза меньше ферментного препарата.

Таким образом, приведенные данные показывают, что введение фенозан-кислоты (в форме фенозана-К) в качестве добавки, активирующей целлюлазную активность, в том числе и в сверхнизких концентрациях, позволяет ускорить процесс ферментативного расщепления целлюлозосодержащего субстрата, значительно снизить расход ферментного препарата и значительно повысить выход целевого продукта.

Поскольку целлюлазные комплексы, получаемые из разных микроорганизмов, работают по сходным механизмам, можно ожидать, что активирующее действие фенозан-кислоты и ее производных будет проявляться также по отношению к целлюлазным комплексам, продуцируемым другими микроорганизмами.