способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале

Формула изобретения

Способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект двукратно по 30 мин обрабатывают этилацетатом, этилацетатные извлечения объединяют, этилацетат испаряют, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°С в токе воздуха, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей, хроматографируют в макроколонке с силикагелем L 40/100 µ, используя подвижную фазу, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют при 18-22°С в токе воздуха, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм, содержащей неподвижную фазу, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл/мин, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, температура инжектора составляет 280°С, температура интерфейса 260°С, температура квадруполя 150°С, температура источника ионов 230°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика, отличающийся тем, что после испарения этилацетата остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителя, перед хроматографированием в макроколонке остаток растворяют в смеси растворителей гексан-диэтиловый эфир, взятых в соотношении 6:4 по объему, подвижной фазой для хроматографирования в макроколонке является смесь растворителей гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, при хромато-масс-спектрометрическом определении неподвижной фазой капиллярной колонки является (5%-фенил)-метилполисилоксан, начальная температура колонки составляет 50°С, температура программируется от 50 до 200°С со скоростью 10°С/мин.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале, и может быть использовано в практике санэпидстанций, химико-токсикологических, экспертно-криминалистических и ветеринарных лабораторий. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения алкилзамещенных гидроксибензола (4-метилгидроксибензола) в моче, заключающийся в том, что анализируемую пробу подкисляют серной кислотой, перегоняют с водяным паром, полученный дистиллят обрабатывают 65% азотной кислотой, выдерживают при 37°C в течение 24 часов, нейтрализуют 20% раствором гидроксида натрия, прибавляют к реакционной смеси буферный раствор с рН 12 и проводят полярографическое определение (Гадаскина И.Д., Филов В.А. Превращения и определение промышленных ядов в организме. - Л.: Медицина, 1970. - С.204).

Способ характеризуется длительностью выполнения, недостаточно высокой чувствительностью, не может обеспечить селективное определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в присутствии близких по структуре гидроксипроизводных бензола.

Известен способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале (крови), путем двукратного по 30 минут настаивания с этилацетатом, отделения этилацетатных извлечений, их объединения, упаривания объединенного извлечения вначале в токе воздуха до незначительного объема, а затем в токе азота до полного испарения растворителя, растворения остатка в смеси растворителей ацетон-вода, взятых в соотношении 5:5 по объему, хроматографирования в макроколонке с сорбентом Силасорб C-18 с использованием подвижной фазы ацетон-вода в соотношении 5:5 по объему, объединения фракций элюата, содержащих 2 метокси-4-аллилгидроксибензол, разбавления буферным раствором с рН 2-3, неоднократного экстрагирования этилацетатом, объединения отдельных экстрактов, упаривания вначале в токе воздуха до незначительного объема, затем в токе азота до полного испарения растворителя, растворения остатка в гексане с последующим хроматографированием методом ВЭЖХ в колонке с сорбентом «Силасорб 600» с использованием подвижной фазы гексан-диоксан-пропанол-2 в соотношении 15:5:1 по объему (Сухомлинова Е.А., Шорманов В.К. Определение эвгенола в биологических жидкостях. // Фармация.-2008. - Т.57, № 1. - С.7-9).

Способ характеризуется недостаточно высокой чувствительностью.

Наиболее близким является способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале, который заключается в том, что биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают этилацетатом, этилацетатные извлечения объединяют, обезвоживают, этилацетат испаряют вначале в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают при 18-22°С в токе воздуха, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан - диоксан - пропанол-2, взятых в соотношении 40:5:1 по объему, хроматографируют в макроколонке с силикагелем L 40/100 µ с использованием подвижной фазы гексан - диоксан-пропанол-2 в соотношении 40:5:1 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой, содержащей полиэтиленгликоль и силоксан в массовом отношении 95:5, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл в минуту, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 50°С, температура программируется от 50°С до 150°С со скоростью 50°С в минуту, от 150°С до 290°С со скоростью 20°С в минуту с выдержкой при конечной температуре 8 минут, температура инжектора составляет 280°С, температура интерфейса - 260°С, температура квадруполя - 150°С, температура источника ионов - 230°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика. (Патент 2395081 Российская Федерация, МПК G01N 33/15; G01N 33/50; G01N 30/00 / Способ определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в биологическом материале. / Шорманов В.К., Сухомлинова Е.А., Елизарова М.К., Сипливая Л.Е., Сипливый Г.В.; заявители и патентообладатели: В.К.Шорманов, Е.А.Сухомлинова, М.К.Елизарова. - № 2008138004; Заяв. 23.09.2008; Опуб. 20.07.2010 // Изобретения (Заявки и патенты). - 2010. - № 20. - 9 с).

Техническим результатом настоящего изобретения является повышение чувствительности определения.

Технический результат достигается тем, что биологический объект двукратно по 30 минут обрабатывают этилацетатом, этилацетатные извлечения объединяют, этилацетат испаряют, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения объединяют, упаривают вначале в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°С, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан - диэтиловый эфир, взятых в соотношении 6:4 по объему, хроматографируют в макроколонке с силикагелем L 40/100 µ, с использованием подвижной фазы гексан - диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл в минуту, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 50°С, температура программируется от 50°С до 200°С со скоростью 10°С в минуту, температура инжектора составляет 280°С, температура интерфейса - 260°С, температура квадруполя - 150°С, температура источника ионов - 230°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика.

Способ осуществляется следующим образом: биологический материал, содержащий 2-метокси-4-аллилгидроксибензол, дважды (каждый раз в течение 30 минут) настаивают с этилацетатом при перемешивании, отдельные извлечения отделяют от твердых частиц биологического материала, объединяют, обезвоживают безводным сульфатом натрия, этилацетат испаряют в токе воздуха при 18-22°С, остаток неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновые извлечения отделяют, объединяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°С, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане, экстрагируют буферным раствором с рН 12-13, водно-щелочное извлечение отделяют, подкисляют до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия, экстрагируют диэтиловым эфиром, эфирное извлечение отделяют, обезвоживают, упаривают в токе воздуха при 18-22°С, а затем - в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в смеси растворителей гексан - диэтиловый эфир, взятых в соотношении 6:4 по объему, хроматографируют в макроколонке с силикагелем L 40/100 µ с использованием подвижной фазы гексан - диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему, фракции элюата, содержащие анализируемое вещество, объединяют, элюент испаряют вначале в токе воздуха при температуре 18-22°С, затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в гексане и проводят определение хромато-масс-спектрометрическим методом с применением капиллярной колонки длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм с неподвижной фазой (5%-фенил)-метилполисилоксан, используя газ-носитель гелий, подаваемый со скоростью 1 мл в минуту, и масс-селективный детектор, работающий в режиме электронного удара, начальная температура термостата колонки составляет 50°С, температура программируется от 50°С до 200°С со скоростью 10°С в минуту, температура инжектора составляет 280°С, температура интерфейса - 260°С, температура квадруполя - 150°С, температура источника ионов - 230°С, регистрируют интенсивность сигнала, обусловленного заряженными частицами, образующимися при бомбардировке анализируемого вещества, вышедшего из капиллярной колонки и попавшего в источник ионов, ионизирующим пучком электронов с энергией 70 эВ, регистрируют масс-спектр по полному ионному току и вычисляют количество 2-метокси-4-аллилгидроксибензола по площади хроматографического пика. Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1

Определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в крови К 10 г крови человека прибавляют 10 мг 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этил ацетата и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, этилацетат испаряют в токе воздуха при 18-22°C, остаток трижды по 3 минуты обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, сульфат натрия и фильтр дополнительно промывают 20 мл ацетона, фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с рН 12-13 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия и экстрагируют дважды порциями диэтилового эфира по 20 мл каждая. Эфирные извлечения объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл диэтилового эфира. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан - диэтиловый эфир, взятых в соотношении 6:4 по объему, и вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 µ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан - диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 4 по 7 включительно объединяют, упаривают при 18-22°С вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем - в токе азота до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 25 мл гексана (раствор А). 2,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки гексаном (раствор Б). 2 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies модели 7890 АС с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5975С этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной слоя неподвижной фазы 0,25 мкм. Неподвижная фаза - (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 50°С. Нагрев при данной температуре осуществляется 3 минуты, после чего температура программируется от 50°С до 200°С со скоростью 10°С в минуту. Температура инжектора составляет 280°С, температура интерфейса - 260°С, температура квадруполя - 150°С, температура источника ионов - 230°С.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 10 минут. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Ток детектора 1500.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 13,48 мин соответствует 2-метокси-4-аллилгидроксибензолу. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 55, 65, 77, 91, 103, 121, 131, 137, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 164, интенсивность которой принимается за 100%.

2-метокси-4-аллилгидроксибензол идентифицируют по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

В ряд мерных колб вместимостью 25 мл вносят 0,025, 0,125, 0,5, 1,25, 2,5, 7,5 и 12,5 мл 0,005% раствора 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в гексане и доводят объем содержимого каждой колбы до метки гексаном. 2 мкл каждого из полученных растворов вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies 7890 АС с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5975С этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной слоя неподвижной фазы 0,25 мкм. Неподвижная фаза - (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 50°С. Нагрев при данной температуре осуществляется 3 минуты, после чего температура программируется от 50°С до 200°С со скоростью 10°С в минуту. Температура инжектора составляет 280°С, интерфейса - 260°C, температура квадруполя - 150°C, температура источника ионов - 230°C.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 10 минут. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Ток детектора 1500.

По результатам измерений на хромато-масс-спектрометре строят график зависимости площади пика от концентрации определяемого вещества. График линеен в интервале концентраций 2·10 ^-10-1·10^-7 г.

Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид:

S=186262·C-6576,

где S - площадь хроматографического пика; C-концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг.

Результаты количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в крови представлены в таблице 1.

Пример 2

Определение 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в ткани печени

К 10 г ткани свежей трупной печени человека прибавляют 10 мг 2-метокси-4-аллилгидроксибензола, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на 1,5 часа при температуре 18-22°C. По истечении указанного времени смесь заливают 20 мл этилацетата и оставляют на 30 минут при перемешивании. Извлечение отделяют, операцию настаивания повторяют в вышеописанных условиях. Вытяжки объединяют, этилацетат испаряют в токе воздуха при 18-22°C, остаток трижды по 3 минуты обрабатывают порциями ацетона по 15 мл каждая при энергичном перемешивании, извлечения отделяют, объединяют, встряхивают с 7 г безводного сульфата натрия, фильтруют через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, сульфат натрия и фильтр промывают 20 мл ацетона, фильтрат и промывную жидкость объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя, остаток растворяют в 10 мл гексана, экстрагируют дважды порциями буферного раствора с рН 12-13 по 10 мл каждая. Отдельные водно-щелочные экстракты объединяют, подкисляют 24%-ным раствором хлороводородной кислоты до рН 2-3, насыщают сульфатом натрия и экстрагируют дважды порциями диэтилового эфира по 20 мл каждая. Эфирные извлечения объединяют, пропускают через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1-1,5 см, фильтр дополнительно промывают 20 мл диэтилового эфира. Отдельные фильтраты объединяют, упаривают в токе воздуха при 18-22°C до объема 0,5-1,0 мл, а затем в токе азота до полного удаления растворителя. Остаток растворяют в 2-3 мл смеси растворителей гексан -диэтиловый эфир, взятых в соотношении 6:4 по объему, и вносят в хроматографическую макроколонку размерами 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100µ. Хроматографируют, используя подвижную фазу гексан-диэтиловый эфир в соотношении 6:4 по объему. Элюат собирают отдельными фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 4 по 7 включительно объединяют, упаривают при 18-22°C вначале в токе воздуха до объема 0,5-1 мл, а затем - в токе азота до полного испарения растворителя. Остаток растворяют в 25 мл гексана (раствор А). 2,5 мл раствора А вносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят до метки гексаном (раствор Б). 2 мкл раствора Б вводят в хромато-масс-спектрометр.

Определение проводят, используя газовый хроматограф фирмы Agilent Technologies модели 7890 АС с квадрупольным масс-селективным детектором модели 5975С этой же фирмы.

Хроматографирование осуществляют в капиллярной колонке длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной слоя неподвижной фазы 0,25 мкм. Неподвижная фаза - (5%-фенил)-метилполисилоксан.

Начальная температура термостата колонки составляет 50°С. Нагрев при данной температуре осуществляется 3 минуты, после чего температура программируется от 50°С до 200°С со скоростью 10°С в минуту. Температура инжектора составляет 280°С, температура интерфейса - 260°С, температура квадруполя - 150°С, температура источника ионов - 230°С.

В качестве газа-носителя используется гелий. Подача газа-носителя производится со скоростью 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 минута. Масс-селективный детектор работает в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводится по полному ионному току с задержкой 10 минут. Диапазон сканирования составляет 40-550 m/z. Ток детектора 1500.

Пик на хроматограмме с временем удерживания 13,48 мин соответствует 2-метокси-4-аллилгидроксибензолу. В масс-спектре данного соединения, снятому по полному ионному току, обнаруживаются сигналы ряда характеристических заряженных частиц с массовыми числами 55, 65, 77, 91, 103, 121, 131, 137, 164. Наиболее интенсивной является частица с массовым числом 164, интенсивность которой принимается за 100%.

2-метокси-4-аллилгидроксибензол идентифицируют по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика, полученного при регистрации интенсивности по полному ионному току, определяют количественное содержание анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывают на навеску анализируемого вещества, внесенную в биологический материал.

Построение градуировочного графика

Процесс построения градуировочного графика и его уравнение приведены выше в примере 1.

Результаты количественного определения 2-метокси-4-аллилгидроксибензола в ткани печени представлены в таблице 2.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом в 5 раз повышает чувствительность определения в хроматографируемой пробе и в 2,5 раза - в биологическом материале.

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в таблице 3.