аллергены и аллергоиды из пчелиного яда

Формула изобретения

1. Аллергены для иммунотерапии на основе пчелиного яда, отличающиеся тем, что указанные аллергены получены диализом нативного пчелиного яда с использованием мембраны с границей пропускания 10 кДа и представляют собой пчелиный яд, по существу, не содержащий меллитин.

2. Аллергоиды для иммунотерапии на основе пчелиного яда, отличающиеся тем, что указанные аллергоиды получены путем карбамилирования, или тиокарбамилирования, или обработки с образованием групп гуанидинового типа первичных аминогрупп белковых частей меллитинистощенного пчелиного яда по п.1.

3. Аллергоиды по п.2, где указанные первичные аминогруппы представляют собой концевые аминогруппы и/или -амино остатки лизина.

4. Аллергоиды по п.2, отличающиеся тем, что все или часть первичных аминогрупп белковых компонентов указанного меллитинистощенного пчелиного яда имеют следующую структуру (I):



где Х представляет О, S или NR₂ , где R₂ представляет собой H, алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, фенил или CN, a R₁ представляет Н, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, фенил или арилалкил, содержащий до 8 атомов углерода, или алкил, содержащий гетероциклическое кольцо.

5. Аллергоиды по п.4, где указанные аллергоиды являются водорастворимыми.

6. Аллергоиды по п.4, где среднее процентное содержание модифицированных первичных аминогрупп составляет более 75%.

7. Аллергоиды по п.6, в котором среднее процентное содержание модифицированных первичных аминогрупп составляет приблизительно 90%.

8. Аллергоиды по п.2, полученные обработкой указанного меллитинистощенного пчелиного яда щелочным цианатом, таким как KCNO или NaCNO, или органическими изоцианатами или изотиоцианатами при pH от 7 до 11.

9. Аллергоиды по п.8, где указанную обработку проводят при pH от 9 до 9,6.

10. Аллергоиды по п.8, где указанную обработку проводят с использованием щелочного цианата при температуре от 20 до 50°C или от 35 до 40°C, и в течение времени реакции от 12 до 36 ч или от 16 до 24 ч.

11. Аллергоиды по п.8, где указанную обработку проводят с использованием твердого KCNO таким образом, что конечная концентрация составляет от 0,05 до 1 М, или от 0,3 до 0,7 М, или приблизительно 0,5 М.

12. Аллергоиды по п.8, где по завершении реакции меллитинистощенный пчелиный яд, модифицированный таким образом, подвергают гель-фильтрации для удаления избытка реагента и уравновешивают с соответствующим солевым раствором.

13. Фармацевтическая композиция для иммунотерапии на основе пчелиного яда, содержащая эффективную иммунотерапевтическую дозу аллергена по п.1 или аллергоида по любому из пп.2-12, совместно с фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

14. Аллергены по п.1, предназначенные для использования в специфической иммунотерапии, где указанный аллергены обладают иммуногенным действием, по существу, равным нативному пчелиному яду, но со сниженной IgE-связывающей активностью.

15. Применение аллергенов по п.1 или аллергоидов по любому из пп.2-12 для получения лекарственного средства для специфической иммунотерапии, где указанные аллергены обладают иммуногенным действием, по существу, равным нативному пчелиному яду, но со сниженной IgE-связывающей активностью.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к аллергенам, очищенным из пчелиного яда, и аллергоидам, происходящим из него, для десенсибилизации (иммунотерапии) лиц, страдающих специфичными аллергическими реакциями.

Случаи возникновения системных реакций от укусов перепончатокрылых насекомых в общей популяции составляет от 0,4 до 5%. Каждый год по меньшей мере 40 смертельных случаев регистрируется в США, 10 в Германии и 5 в Великобритании. Некоторые особенно подверженные категории, такие как пчеловоды и их семьи, жители сельской местности, и те, кто либо по работе, либо занимаясь в качестве хобби, находятся на открытом воздухе, страдают наиболее часто.

Среди пчеловодов преобладание сенсибилизации выше, от 15 до 40%, и риск аллергической реакции зачастую обратно пропорционален количеству укусов, полученных в год. Было показано, что у лиц, с количеством укусов в год, превышающим 200, реакции отсутствуют (развивается тип «спонтанной» десенсибилизации), тогда как у тех лиц, у которых менее 25 укусов в год, демонстрируется возникновение системной реакции 45%. Наиболее часто встречающиеся укусы вызваны пчелами (Apis mellifera) и осами (Vespula germanica); последующие общие системные симптомы варьируют и включают приливы жара к лицу, крапивницу, зуд, затрудненное глотание, затрудненное дыхание (бронхоспазм), головокружение, ощущение потери сознания, потливость, бледность, опухание (отек), поражающие лицо, глаза, язык и дыхательные пути, и могут присутствовать с различной степенью тяжести и в различном сочетании симптомов. Опухание и зуд являются основными симптомами, в особенности если появляются рано (в течение нескольких минут), поскольку они могут представлять сигнал предстоящего проявления реакции определенной тяжести.

Тяжесть симптомов также зависит от количества укусов, полученных человеком; в случае многочисленных укусов (порядка нескольких десятков) доза введенного яда даже может быть летальной вследствие токсических эффектов, оказываемых различными компонентами, находящимися в яде. Было подсчитано, что LD₅₀, т.е. доза, требуемая для уничтожения половины популяции, составляет 2,8 мг яда на кг массы тела ужаленного человека, для взрослого мужчины, и, следовательно, 600 укусов могут быть смертельными для человека. К счастью, вероятность стать жертвой таких многочисленных укусов не велика. С другой стороны, риск, представленный анафилактическим шоком, случай, который может привести к смерти человека, страдающего аллергическими реакциями, как следствие даже одного укуса, является более значительным и вызывающим беспокойство.

В частности, пчелы жалят только один раз, поскольку их жало, которое имеет маленькие зубчики на конце, отрывается от тела, когда пчела пытается вытащить его. Следовательно, улетев, насекомое умирает, также оставляя ядовитые мешочки, содержащие яд, в месте укуса. Только самки способны жалить, поскольку, в отличие от самцов, у них есть жало.

Очень часто, жертвы таких укусов не могут определить насекомое, которое их ужалило. В таких ситуациях доступность подходящих диагностических инструментов является необходимым и важным обязательным условием для идентификации видов насекомых, ответственных за аллергическую реакцию. В настоящее время аллергия на укус пчелы может быть диагностирована либо путем использования in vivo инъекционных кожных проб, либо путем определения in vitro сывороточных уровней специфических антител IgE. Оба теста, в свою очередь, предусматривают применение специальных водных препаратов (экстрактов), полученных из самого яда. У индивидуумов с подтвержденной аллергией единственным путем избежать риска анафилактической реакции, которая могла бы оказаться фатальной, если они ужалены снова насекомыми тех же видов, является десенсибилизационная терапия или специфическая иммунотерапия (SIT). SIT сохраняет только форму этиологической терапии для аллергических патологических состояний, т.е. способна вмешиваться в механизмы, лежащие в их основе, и, в то же время, давать пациенту специфический тип иммунологической защиты, при повторении в течение определенного количества лет (по меньшей мере трех). SIT основана на введении повышенных доз упомянутых выше экстрактов, до достижения так называемой поддерживающей дозы. К сожалению, хотя SIT является терапевтически эффективным способом в отношении аллергической реакции на пчелиный яд, она не лишена рисков и побочных эффектов такой степени тяжести, что заставляет пациента прервать лечение. Например, нежелательные реакции в некоторой степени наблюдались у 15% пациентов, которые подвергались воздействию возрастающих доз пчелиного яда. Эти причины, дающие начало таким нежелательным реакциям, остаются не выясненными. В прошлом многочисленные исследования проводились для характеристики состава пчелиного яда, в попытке понять возможные причины этого феномена.

Таким образом, было показано, что указанный выше яд состоит из сложной смеси гликопротеинов, многие из которых обладают ферментативной активностью с расщепляющим действием в отношении тканей, а другие компоненты (вазоактивные амины, полипептиды, и т.д.) обладают свойственными им фармакологическими эффектами. Однако у пациентов с аллергическими реакциями IgE ответ преимущественно направлен только на определенные из упомянутых выше гликопротеины. Из них фосфолипаза A2 (PLA2) является наиболее значительным аллергеном с клинической точки зрения, поскольку она распознается сывороточным IgE почти у всех индивидуумов с аллергическими реакциями. Несмотря на это менее важные, чем фосфолипаза, другие аллергены, такие как гиалуронидаза и кислая фосфатаза, были указаны среди высокомолекулярных компонентов. И наоборот, за исключением меллитина, компоненты с низкой молекулярной массой ( 3 кДа, такие как апамин, допамин, ингибитор протеазы, и так далее) неспособны связываться с IgE и, следовательно, считаются менее клинически релевантными или даже полностью нерелевантными. Различные ферменты и вазоактивные компоненты яда индуцируют локализованное воспаление в области укуса. «Нормальная» реакция представлена опухшей и покрасневшей областью кожи приблизительно 10 см, которая может сохраняться в течение нескольких дней. Условно, системные реакции на укусы насекомых классифицируют на 4 степени в соответствии с классификацией Mueller:

- степень I. Генерализованная крапивница, зуд, беспокойство, тревожное состояние

- степень II. Некоторые ранее упомянутые реакции плюс две или более из следующего: ангиоотек (II степень, даже если этот симптом присутствует один), чувство сдавливания в груди, тошнота, рвота, диарея, абдоминальные боли, головокружение.

- степень III. Некоторые из ранее упомянутых симптомов, плюс два или более из следующих: одышка, дыхательная недостаточность, легочный стридор, дисфагия, слабость, афония, спутанность сознания, чувство приближающейся смерти.

- степень IV. Некоторые из ранее упомянутых симптомов, плюс два или более из следующих: гипотензия, сердечно-сосудистая недостаточность, потеря сознания, недержание мочи и кала, цианоз.

Приблизительно в течение 50 лет экстракт, полученный из целых тел, использовали для лечения аллергических реакций на укус пчелы. Примерно в конце 1970-х серия контролируемых исследований показала, что экстракты, полученные из ядовитых мешочков, в поддерживающей дозе 100 мкг белка яда, способны оказывать защитное действие более чем у 80% пациентов, и были в любом случае более эффективными, чем SIT, основанная на применении экстракта целого тела. Совсем недавно было обнаружено, что лечение пациентов, страдающих аллергическими реакциями на укусы пчел пептидами, «реакционноспособными в отношении Т-лимфоцитов», полученными из фосфолипазы, могут индуцировать такие же эффекты (эпитоп-специфичную анергию и повышенное соотношение антител IgG/IgE), наблюдаемые у пациентов, которых успешно лечили с использованием традиционной SIT. Это наблюдение, наряду с многочисленными другими наблюдениями, относящимися к другим специфическим аллергическим реакциям, по-видимому, демонстрируют, что указанные выше основные аллергены, преимущественно полученные в рекомбинантной форме, могут представлять возможные варианты для SIT.

Одна область настоящего изобретения относится к препарату для десенсибилизации к пчелиному яду, обладающему высокой толерантностью и, в частности, сводящему к минимуму возможные нежелательные эффекты, однако без уменьшения десенсибилизирующего эффекта традиционной терапии аллергенами.

Настоящее изобретение относится к препарату, полученному, начиная с пчелиного яда, без меллитина. Настоящее изобретение основано на результатах исследования, проводившегося авторами настоящего изобретения, в котором было сделано наблюдение, что в отличие от существующего на сегодняшний день мнения меллитин не оказывает специфического действия в качестве аллергена, но, однако, может потенциально действовать в качестве сенсибилизирующего агента после продолжительного противоаллергического лечения с использованием цельного пчелиного яда. Препарат по настоящему изобретению, главным образом состоящий из компонентов пчелиного яда с высокой молекулярной массой, преимущественно фосфолипазы A2 (давно и безусловно клинически наиболее значимого аллергена) и гиалуронидазы, может, следовательно, составлять более безопасную вакцину, используемую для SIT, у пациентов, страдающих аллергическими реакциями на пчелиный яд, или в качестве диагностического средства.

Пчелиный яд, не содержащий меллитина, может быть получен в водной форме, как описано ниже. Для применения в SIT препарат, составляющий предмет настоящего изобретения, можно вводить парентерально, назально, сублингвально, через слизистую полости рта, перорально или бронхиально, с помощью соответствующего устройства для введения. Препарат по настоящему изобретению также может быть получен в лиофилизированной форме, а затем может быть восстановлен и введен как указано для водной формы, или включен в соответствующие системы высвобождения (например, липосомы), или в виде порошка, включенного в инертный эксципиент, например лактозу, для назального или бронхиального введения, с помощью соответствующего устройства для введения, или преобразован в таблетки, возможно для быстрого растворения для подъязычного введения/введения через слизистую ротовой полости, или капсулы, по желанию сделанные гастрорезистентными, с помощью подходящей методики, например, для перорального введения.

Препарат по настоящему изобретению можно вводить парентерально, после абсорбции или ко-преципитации такими веществами, как L-тирозин, гидроксид алюминия или фосфат кальция, или другими задерживающими матрицами, способствующими медленному высвобождению активного ингредиена из места вакцинации.

Препарат по настоящему изобретению также может быть получен в форме масляной суспензии, сиропа, эликсира, с необязательным добавлением эксципиентов или веществ для придания ему приятного вкуса и аромата для подъязычного введения, введения через слизистую ротовой полости или перорального введения.

Препарат по настоящему изобретению аналогично может быть объединен или смешан с веществами, известными для экспрессии Th1 или Treg типа адъювантной активности, например такими как CpG, полученными из бактерий, микобактерий, микоплазм, нейссерий, вирусов или простейших, в том числе, неметилированными CpG, липопротеинами или триацилированными липопептидами, полисахаридами и их производными, также синтетического происхождения, синтезированными веществами, такими как имиквимод, резиквимод, поли (I:C).

Композиция по настоящему изобретению в основном может содержать различные эксципиенты и/или носители, адаптированные для выбранного типа введения, в соответствии с компетенцией специалистов в данной области, и как сообщается, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., USA, 17 ^th edition, 1985.

Во всех указанных выше фармацевтических композициях препарат по настоящему изобретению может находиться в количествах, содержащих от 0,05 мкг (минимальная доза) до 50 мкг (поддерживающая доза), в соответствии со стандартными дозами для специфической иммунотерапии.

Получение пчелиного яда, не содержащего меллитина, может осуществляться с помощью различных способов. Способ, описанный в настоящем изобретении, предусматривает диализ нативного пчелиного яда против изотонического солевого раствора, используя мембрану с границей пропускания 10 кДа, в течение периода времени, достаточного для истощения меллитина в яде. В основном, рекомендуемое время диализа составляет по меньшей мере 48 часов, более предпочтительно, приблизительно 72 часа. Диализ предпочтительно будет проводиться при температуре, составляющей от 0°C до 10°C.

В любом случае удаление меллитина из препарата может осуществляться с помощью других способов, например гель-фильтрацией или аффинной хроматографией с моноклональными антителами против меллитина.

В качестве неограничивающего примера, настоящее изобретение теперь будет описано посредством следующего препаративного примера и экспериментальных тестов, демонстрирующих эффективность препарата по изобретению.

Краткое описание фигур

Фигура 1: Иммуноблоттинг с сывороткой пациентов, страдающих аллергией на пчелиный яд;

Фигура 2: Профиль SDS-PAGE: действие длительности диализа с границей пропускания 10 кДа на выведение меллитина из пчелиного яда;

Фигура 3: Определение IgE реактивности пчелиного яда, прошедшего диализ с границей пропускания 10 кДа, и того же яда, модифицированного с использованием 0,005 M и 0,5 M цианата калия, с помощью EAST-ингибирования;

Фигура 4: Определение уровней специфичных IgG в пуле сыворотки от мышей, иммунизированных пчелиным ядом, прошедшим диализ с границей пропускания 10 кДа, и модифицированным;

Фигура 5: Прямой ELISA; сравнение IgE реактивности сывороток от пациентов, страдающих аллергическими реакциями на пчелиный яд, по сравнению с ядом, прошедшим диализ с границей пропускания 3,5 кДа или 10 кДа;

Фигура 6: Профиль SDS-PAGE нативного и модифицированного пчелиного яда, прошедшего диализ с границей пропускания 10 кДа.

ПРИМЕР 1. МЕТОДИКА ПОЛУЧЕНИЯ ПЧЕЛИНОГО ЯДА, НЕ СОДЕРЖАЩЕГО МЕЛЛИТИНА.

50 мг лиофилизированного пчелиного яда (Latoxan, Valence, France) растворяют в 10 мл изотонического физиологического раствора (0,9% NaCl в дистиллированной воде) и оставляют перемешиваться в течение десяти минут или около того. Этот раствор затем пропускают через фильтр 0,45 мкм (Puradisc 25 AS, Whatman, Biomap, Agrate Brianza, Milan, Italy) и разделяют на две аликвоты по 25 мл каждая, затем подвергают диализу, одну аликвоту с мембраной с границей пропускания 3,5 кДа, а другую с границей пропускания 10 кДа (Spectra/Por 7, Spectrumlabs, Prodotti Gianni, Italy). Диализ проводят исчерпывающе против изотонического солевого раствора при 4°C, с помощью магнитной мешалки, контролируя его протекание с помощью SDS-PAGE, с тем, чтобы установить исчезновение полосы, связанной с меллитином, для образца, подвергнутого диализу с мембраной, имеющей границу пропускания 10 кДа. Указанный мониторинг можно даже проводить, используя другие способы, например такие как масс-спектрометрия. Диализ против изотонического солевого раствора в течение 72 часов может быть эффективным, как продемонстрировано профилем SDS-PAGE (Фиг.2).

Сравнение между IgE-связывающей реактивностью пчелиного яда, прошедшего диализ с использованием мембраны с границей пропускания 3,5 кДа, по сравнению с границей пропускания 10 кДа, т.е. с истощением меллитина, проводили с использованием как in vitro (прямого ELISA) способа, так и in vivo (инъекционного) способа, в соответствии с методиками, описанными ниже.

SDS-PAGE (способ)

Равные количества (5 мкг) пчелиного яда 3,5 кДа (время 0) и его образцы, подвергнутые диализу с границей пропускания 10 кДа (время 24, 48 и 72 часов) анализировали с помощью электрофореза на 10% полиакриламидных гелях (гели промышленного производства Nupage Bis-Tris, Novex, Prodotti Gianni, Milan, Italy) как описано ранее (Asero R., Mistrello G. et al. Int. Arch. Allergy Immunol. 2007;144,57-63). Электрофорез проводят в специальном устройстве (Mighty Small II, Hoefer, Milan, Italy) при 180 мА в течение 1 часа. Компоненты, разделенные таким образом, окрашивают красителем кумасси бриллиантовым синим (набор для окрашивания Colloidal Blue staining kit, Amersham, Milan, Italy) и впоследствии обесцвечивают в воде. Результаты, показанные на Фиг.2, указывают на то, что диализ в течение 72 часов позволяет более или менее полно выводить меллитин из образца.

Прямой ELISA

Тридцать сывороток, выбранных случайным образом, от лиц, которые, согласно REAST (способ описан ниже), являются позитивными в отношении пчелиного яда, использовали для сравнения пчелиного яда, прошедшего диализ с границами пропускания 3,5 кДа или 10 кДа. С этой целью лунки полистирольных планшетов покрывали 0,1 мкг (доза в соответствии с BioRad) пчелиного яда, прошедшего диализ с использованием мембраны с границей пропускания 10 кДа, или 0,1 мкг пчелиного яда, прошедшего диализ с использованием мембраны с границей пропускания 3,5 кДа, в 50 мМ карбонат/бикарбонатном буфере pH 9,6, путем инкубирования при 4°C в течение 16 часов. Лунки промывали, используя промывочный раствор (60 мМ фосфатный буфер pH 6,5, содержащий 0,05% Tween-20) и свободные сайты блокировали путем инкубирования с 200 мкл раствора для разведения (2% BSA, 0,01% Thiomersal в 150 мМ фосфатном буфере pH 7,4) в течение одного часа при комнатной температуре. Равные количества (100 мкл) каждой из 20 случайно выбранных сывороток человека добавляют в каждую лунку, а затем инкубируют при 25°C в течение 2 часов. После промывания три раза добавляют антисыворотку кролика против конъюгированных с пероксидазой IgE человека (Biospacific, Emekryville, CA, USA), разведенную 1:1500 в растворе для разведения, и инкубируют при 25°C в течение 1,5 часов. После промывания три раза развитие колориметрической реакции получают добавлением 100 мкл реактива TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубированием в течение 15 минут при 25°C. Реакцию гасят добавлением 100 мкл 1 н. HCl, и результаты оценивают с помощью спектрометрии при 450 нм (Shimadzu, Mod. UV 1700, Milan, Italy).

Результаты экспериментов, приведенные на Фигуре 5, показывают, что образец пчелиного яда, прошедшего диализ с использованием мембраны с границей пропускания 10 кДа, сохраняет, или даже улучшает, IgE-связывающую активность, что дает возможность предположить, что вклад меллитина в отношении общей IgE-связывающей активности пчелиного яда является незначительным.

Инъекционные кожные пробы у пациентов с аллергическими реакциями с использованием пчелиного яда, прошедшего диализ с границей пропускания 3,5 кДа и 10 кДа

У восьми пациентов с аллергической реакцией на пчелиный яд в анамнезе и двух нормальных пациентов (отрицательный контроль) проводили инъекционные кожные пробы, сравнивали два раствора яда (прошедших диализ с границей пропускания 3,5 кДа или 10 кДа), предварительно разбавленные 1/50 с использованием разбавителя для инъекций (0,68% NaCl, 0,275% NaHCO₃ , 50% глицерин, 0,4% фенол). С этой целью каплю раствора, прошедшего диализ с границей пропускания 3,5 кДа, помещали на кожу одного предплечья до прокалывания области, соответствующей капле, специальной одноразовой иглой, удерживаемой перпендикулярно повехности кожи. Ту же операцию затем повторяют на коже другого предплечья после помещения капли раствора, прошедшего диализ с границей пропускания 10 кДа. Раствор гистамина (10 мг/мл) используют в качестве положительного контроля, а раствор разбавителя используют в качестве отрицательного контроля. Для реакции, считающейся положительной, размеры волдыря (рубца) должны быть на 3 мм больше, чем вызвано раствором разбавителя. В среднем, для этого раствора, кожная реакция была приблизительно 1 мм; в случае гистамина (положительный контроль) средние размеры волдыря составили 12 мм.

Затронутый участок кожи проверяют через 15-20 минут, и в случае волдырной реакции диаметр этого участка очерчивают, используя разметочный карандаш. Поверхность кожи затем закрывают листом клейкой бумаги, перенося, таким образом, на нее контур волдыря. Затем измеряют волдырь суммированием размера наибольшего диаметра с размером наименьшего диаметра и делением на два.

Результаты показаны в таблице 1. Эти данные также подтверждают, что аллергическая реактивность in vivo пчелиного яда, лишенного меллитина, полностью сопоставима с аллергической реактивностью, выраженной пчелиным ядом, содержащим меллитин.

Таблица 1 Инъекционная кожная проба у пациентов с аллергическими реакциями на пчелиный яд с использованием образцов 3,5 кДа и 10 кДа
Пациент	Пчелиный яд, прошедший диализ с границей пропускания 3,5 кДа	Пчелиный яд, прошедший диализ с границей пропускания 10 кДа
	Средний диаметр волдыря (мм)*	Средний диаметр волдыря (мм)*
1	5,8	5,7
2	4,3	4,8
3	5,2	5,4
4	6,2	5,9
5	4,9	5,2
6	5,4	5,0
7	4,2	4,7
8	4,8	5,6
Среднее	5,10±0,69	5,28±0,43

Оба приведенных выше результата (прямой ELISA и инъекционная кожная проба) дают возможность предположить, что вклад меллитина в IgE-связывающую активность, как определено с помощью как in vitro, так и in vivo способов, является совершенно ничтожным.

Тест для оценки аллергической значимости компонентов пчелиного яда

Для установления эффективной клинической значимости различных аллергенов, присутствующих в пчелином яде, авторы изобретения провели серию тестов, оценивая специфическую реакцию IgE относительно отдельных аллергенов, легко доступных на рынке, высокой степени чистоты. Аллергенами, на которых авторы изобретения сосредоточили внимание, являются меллитин, фосфолипаза A2 и гиалуронидаза.

Для упомянутых выше тестов, 98 сывороток от пациентов, страдающих аллергическими реакциями на пчелиный яд, идентифицированных исходя из положительной инъекционной кожной пробы (SPT), подврегали REAST анализу в соответствии с ранее описанным способом (Falagiani P, Mistrello G et al. Allergology International 1999,48:199-20), для оценки наличия специфических IgE против цельного пчелиного яда, фосфолипазы и меллитина в сыворотке.

REAST анализ предусматривает применение аллергенов, конъюгированных с биотином в соответствии со способом, описанным ниже.

Получение биотинилированных аллергенов

Аликвоты по 1 мг цельного пчелиного яда, фосфолипазы и меллитина (Sigma, Milan, Italy) подвергали диализу против 0,1 M NaHCO ₃ pH 8,4 в течение 16 часов при 4°C, используя диализную мембрану с границей пропускания 3,5 кДа. С одной стороны, был подготовлен раствор N-гидрокси-сукцинимидил-биотина (1 мг/мл) в диметилсульфоксиде (DMSO).

Аликвоты этого раствора по 454 мл добавляют к биотинилируемому белку и оставляют для инкубирования в течение 4 часов при комнатной температуре, при постоянном перемешивании. По завершении несвязанный биотин выводится диализом против фосфатного буфера.

Рабочее разведение очищенных аллергенов определяют, проводя вариант REAST теста, как описано ниже. Аликвоты по 50 мкл смешанной сывортки от пациентов с аллергическими реакциями на пчелиный яд (позитивный пул) или здоровых людей (негативный пул) инкубируют в течение 1 часа в лунках полистирольных планшетов, на которых предварительно была адсорбирована сыворотка против IgE человека (0,3 мкг/лунку; Bethyl, Prodotti Gianni, Milan, Italy). После трех промываний промывочным раствором (60 мМ фосфатный буфер pH 6,5, содержащий 0,05% Tween-20), 100 мкл серийных разведений (от 1:100 до 1:6400) различных биотинилированных аллергенов добавляют в лунки. По завершении инкубирования в течение одного часа и трех промываний промывочным буфером инкубирование проводят со 100 мкл раствора (0,1 мкг/мл) стрептавидин-конъюгированной пероксидазы (Pierce, Milan, Italy). После промывания три раза развитие колориметрической реакции получают путем добавления 100 мкл реактива TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубирования в течение 15 минут при 25°C. Реакцию гасили добавлением 100 мкл 1 н. HCl и результаты оценивали с помощью спектрофотометрии при 450 нм (Vmax microplate reader, Molecular Device, BioSpa, Milan, Italy).

Рабочее разведение различных биотинилированных аллергенов будет таким, которое в описанном ниже REAST способе дает максимальное значение оптической плотности для позитивного пула, соответствующее значению оптической плотности <0,05 AU для негативного пула.

REAST (Reverse Enzyme Allergo Sorbent Test)

Равные аликвоты (50 мкл) 98 сывороток от пациентов с аллергическими реакциями на пчелиный яд, или сыворотку с известным титром IgE (от 0,5 до 100 кЕд/л, стандартная кривая), инкубируют в течение 1 часа в лунках полистирольных планшетов, на которых предварительно была адсорбирована сыворотка, содержащая антитела против IgE человека (0,3 мкг/лунку). После трех промываний промывочным раствором (60 мМ фосфатный буфер pH 6,5, содержащий 0,05% Tween-20), 100 мкл биотинилированного пчелиного яда или фосфолипазы, или меллитина, в предварительно определенных разведениях, добавляют в лунки, относящиеся к тестируемым сывороткам. В то же время 100 мкл сыворотки, содержащей биотинилированные антитела против IgE, человека добавляют в лунки, относящиеся к стандартной кривой. По завершении одночасового инкубирования и трех промываний промывочным буфером инкубирование проводят со 100 мкл раствора (0,1 мкг/мл) конъюгированной со стрептавидином пероксидазы. После промывания три раза, развитие колориметрической реакции получают путем добавления 100 мкл реактива TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубирования в течение 15 минут при 25°C. Реакцию гасят путем добавления 100 мкл 1 н. HCl и результаты оценивают с помощью спектрофотометрии при 450 нм. Значения (в кЕд/л) IgE, специфичных в отношении трех аллергенов в тестируемых сыворотках, определяют путем интерполяции релевантных OD на стандартную кривую.

Иммуноблоттинг (IB)

Компоненты цельного пчелиного яда, прошедшие диализ с границей пропускания 3,5 кДа, разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и впоследствии переносят на нитроцеллюлозную мембрану путем электроблоттинга, в соответствии с теорией, описанной Towbin (Towbin J., Staehelin T., Gordon J., (1979): Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications . Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 4350-4354).

Мембрану инкубируют в течение одного часа в TBS-T (TBS, 0,05% Tween-20), содержащем 5% сухого молока, а затем в течение ночи с индивидуальными сыворотками от пациентов с аллергическими реакциями на пчелиный яд (20 выбраны из тех, у которых уровень специфичных IgE >5 кЕд/л, REAST класс 3 или выше), разведенных 1:2 в TBS-T, 5% сухого молока. После трех промываний с использованием TBS-T антитела, связанные с мембраной, обнаруживают путем инкубирования в течение одного часа с сывороткой, содержащей антитела против IgE человека, конъюгированные с пероксидазой, и после дополнительных промываний, используя хемилюминесцентную систему обнаружения реакцией с люминолом в качесте субстрата пероксидазы (ECL, Amersham).

Результаты экспериментов IB представлены на Фиг.1.

К большому удивлению авторов изобретения указанные выше тесты подчеркнули, что меллитин, пептид, не содержащий серу, состоящий из 26 аминокислот, представляющий приблизительно 50% сухой массы пчелиного яда, но присутствующий во всех экстрактах, используемых для терапевтических целей до настоящего времени, в отличие от общепринятой концепции, не является клинически значимым аллергеном, ни коим образом. Действительно, для определения в качестве такового, аллерген должен быть признан по показателям специфических IgE, по меньшей мере на 60% сывороток от пациентов, позитивных в отношении этого заданного вещества (в данном конкретном случае, пчелиного яда). В отношении профиля IB можно наблюдать, что фосфолипаза распознается всеми тестируемыми сыворотками, некоторые из которых также распознают гиалуронидазу, тогда как меллитин либо не распознается, либо даже когда распознается, соответствующий сигнал всегда очень слабый. Следовательно, исходя из полученных результатов меллитин следует рассматривать скорее как минорный аллерген, поскольку он распознается только минимальным количеством сывороток. Кроме того, это распознавание всегда связано с присутствием антител IgE, специфичных в отношении других аллергенов в сыворотке, прежде всего фосфолипазы A2, упомянутый выше IgE-ответ на которую всегда наблюдается как гораздо более интенсивный. В единицах кЕд/л IgE среднее значение меллитина составляет 1,25 (класс 1), тогда как значение для фосфолипазы составляет 16,9 (класс 3).

Эти результаты привели авторов изобретения к предположению, что меллитин не является клинически значимым аллергеном, и что именно по этой причине он может быть удален из препарата, с тем, чтобы получить новую более безопасную и эффективную вакцину для лечения пациентов страдающих аллергией на укусы пчел. Этот продукт также может быть использован в SIT у тех пациентов, которые были вынуждены прервать лечение цельным экстрактом вследствие появления нежелательных реакций, они были бы больше подвергнуты риску анафилактических реакций в этом случае, когда они, к несчастью, были жертвами последующих укусов пчел.

Удаление меллитина в новом экстракте также имело бы преимущество во избежание риска сенсибилизации пациентов на протяжении курса SIT, поскольку экстракты, используемые в настоящее время, содержат значительные количества меллитина и нельзя исключить, что последующие побочные реакции на упомянутую выше SIT вызваны именно сенсибилизацией на упомянутый выше компонент, как следствие лечения специфической вакциной. Для того чтобы получить дополнительную демонстрацию недостаточной клинической значимости меллитина, была проведена серия дополнительных экспериментов по сравнению IgE-связывающей активности препарата яда, содержащего меллитин (после диализа с использованием мембраны с границей пропускания 3,5 кДа) или без меллитина (после диализа с границей пропускания 10 кДа). Поскольку очищенная форма не доступна на рынке, для оценки IgE ответа на гиалуронидазу, было невозможно провести ни REAST, ни прямые RAST-тесты, и поэтому авторы изобретения сослались на эксперименты иммуноблоттинга. Присутствие гиалуронидазы в образце было показано путем мониторинга специфической ферментативной активности.

Дополнительной областью применения настоящего изобретения является разработка другого препарата, начиная с меллитин-истощенного пчелиного яда, в котором присутствуют основные аллергены, представленные фосфолипазой А2 и гиалуронидазой, химически модифицированные, с тем, чтобы уменьшить их IgE-связывающую реактивность (риск побочных эффектов связан с указанной реактивностью), сохраняя их иммуногенную эффективность (понимаемую как способность индуцировать специфические антитела класса IgG, как известно, обладающие защитным действием). Это может достигаться тем, что меллитин-истощенный пчелиный яд подвергают реакциям карбамилирования (или тиокарбамилирования), или реакциям образования групп гуанидинового типа на первичных аминогруппах белковых частей, в частности на концевых аминогруппах и -амино остатках лизина. Карбамилирование белков, известный тип реакции, может действовать на другие аминокислотные остатки (например, гидроксильную группу тирозина, имидазольную группу гистидина), но все эти производные являются нестабильными в условиях физиологического pH, тогда как продукты реакции карбамилирования альфа и эпсилон аминогрупп являются очень стабильными.

Как показано в настоящем описании ниже, указанные карбамилат и тиокарбамилат производные меллитин-истощенного пчелиного яда, а также производные гуанидинового типа показали значительно сниженную IgE-связывающую активность, тогда как при парентеральном введении их способность индуцировать специфические IgG антитела, также способные распознавать немодифицированный меллитин-истощенный пчелиный яд, остается неизменной. Указанный продукт, таким образом, представляет более безопасный и эффективный вариант для SIT у пациентов со специфическими аллергическими реакциями.

Следовательно, дополнительным объектом настоящего изобретения является препарат, содержащий модифицированную форму меллитин-истощенного пчелиного яда, отличающийся тем, что все или часть первичных аминогрупп белковых компонентов, присутствующих в нем, принимают следующую структуру (I):

где X представляет O, S или NR2, где R2 представляет собой H, алкил, содержащий 1-6 атомов углерода, фенил или CN, а R1 представляет H, алкил, содержащий 1-8 атомов углерода, фенил или арилалкил, содержащий до 8 атомов углерода, или алкил, содержащий гетероциклическое кольцо, где указанный препарат является водорастворимым.

Среднее процентное содержание модифицированных первичных аминогрупп должно составлять от 75% до 100%, предпочтительно около 90%.

Белки пчелиного яда могут быть модифицированы в соответствии с настоящим изобретением путем обработки щелочным цианатом (KCNO или NaCNO) или органическими изоцианатами или тиоцианатами. Эта реакция должна проводиться при pH, составляющем от 7 до 11, предпочтительно от 9 до 9,6, тогда как температура в случае обработки щелочным цианатом может составлять от 20°C до 50°C, предпочтительно от 35°C до 40°C, и время реакции может варьироваться между 12 и 36 часами, предпочтительно между 16 и 24 часами.

В случае обработки цианатом можно добавлять, например, твердый KCNO (возможно свежекристаллизованный), так чтобы конечная концентрация составляла от 0,05 M до 1 M, предпочтительно от 0,3 до 0,7 M, более предпочтительно около 0,5 M. pH этого раствора поддерживается на желаемом уровне путем добавления, например, 0,1 M тетрабората натрия и установления рН путем добавления 1M NaOH.

В случае органических изоцианатов или изотиоцианатов, поскольку в некоторых случаях такие соединения плохо растворимы в водном окружении, может быть предусмотрено применение совместимого органического растворителя.

По завершении реакции меллитин-истощенный пчелиный яд, модифицированный таким образом, подвергают гель-фильтрации для удаления избытка реагента и уравновешивают с соответствующим солевым раствором. В случае небольшой преципитации, имеющей место после модификации (вследствие присутствия следов меллитина, который, взаимодействуя с цианатом, дает нерастворимое производное), преципитат можно удалить соответствующим центрифугированием.

Химическая модификация, образующая предмет настоящего изобретения, также может быть выполнена на очищенных отдельных аллергенах (например, фосфолипазе), давая производное с теми же характеристиками, что и меллитин-истощенный пчелиный яд, т.е. снижением IgE-связывающей активности и сохранением иммуногенных свойств.

Степень замещения NH₂ групп модифицированного, меллитин-истощенного пчелиного яда по сравнению с ядом до модификации можно определить путем дозирования с тринитробензолсульфоновой кислотой (Habeeb, Anal. Bioch. 14, 328, 1966) или путем анализа исчезновения остатков лизина и появления гомоцитруллина с помощью соответствующих способов, известных специалистам в данной области.

Химически модифицированный, меллитин-истощенный пчелиный яд в соответствии с описанным способом может быть получен в водной форме и может быть введен парентерально, подъязычно, через слизистую ротовой полости, перорально, назально или бронхиально, последнее с помощью подходящих устройств доставки. Описанный выше продукт также может быть получен в лиофилизированной форме, а затем может быть восстановлен и введен как указано для водной формы или включен в системы высвобождения (например, липосомы) или в виде порошка, включенного в инертный эксципиент, например, лактозу, вводимого назально или бронхиально с помощью соответствующих устройств доставки, или преобразован в таблетки, возможно для быстрого растворения, для подъязычного введения/введения через слизистую ротовой полости, или преобразован в капсулы, необязательно изготовленные гастрорезистентными с помощью подходящего способа, для перорального введения.

Упомянутый выше продукт можно вводить парентерально, после абсорбции или копреципитации такими веществами, как L-тирозин, гидроксид алюминия или фосфат кальция, или с другими матрицами «замедленного высвобождения», способствующими медленному высвобождению активного ингредиента из места вакцинации.

Упомянутый выше продукт также может быть получен в форме масляной суспензии, сиропа, эликсира, с необязательным добавлением эксципиентов или веществ, для придания приятного вкуса для подъязычного введения, введения через слизистую ротовой полости или перорального введения.

Упомянутый выше продукт аналогичным образом может быть объединен или комбинирован с веществами, которые, как известно, экспрессируют Th1 или Treg тип адъювантной активности, например, такими как CpG, полученный из бактерий, микобактерий, микоплазм, нейссерий, вирусов или простейших, в том числе, неметилированным CpG, липопротеинами или триацилированными липопептидами, полисахаридами и их производными, также синтетического происхождения, синтезированными веществами, такими как имиквимод, резиквимод, поли (I:C).

Композиция по настоящему изобретению в основном может содержать различные эксципиенты и/или носители, адаптированные к выбранному типу введения, в соответствии с компетенцией специалистов в данной области, и как сообщается, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., N.Y., USA, 17^th edition, 1985.

Во всех приведенных выше фармацевтических композициях препарат по изобретению может находиться в количествах, составляющих от 0,1-0,2 мкг (начальная доза) до 100-200 мкг (поддерживающая доза), в соответствии с дозами, которые будут, таким образом, в целом выше, чем дозы, характерные для специфической иммунотерапии.

Препарат и иммуногенная активность модифицированного меллитин-истощенного пчелиного яда по настоящему изобретению теперь будут описаны посредством неограничивающих примеров.

ПРИМЕР 2. СПОСОБ ХИМИЧЕСКОЙ МОДИФИКАЦИИ ПЧЕЛИНОГО ЯДА, НЕ СОДЕРЖАЩЕГО МЕЛЛИТИНА

20 мл меллитин-истощенного пчелиного яда (в концентрации 2 мг/мл), полученного как описано в примере 1, подвергают карбамилированию путем добавления цианата калия и тетрабората натрия декагидрата, в твердой форме и в таких количествах, чтобы получить молярность 0,05 M или 0,5 M цианата и 0,1 M тетрабората. Добавленные соли растворяют перемешиванием и pH доводят до 9,3 добавлением 1 M NaOH. Всю смесь затем выдерживают при медленном перемешивании в течение 18 часов на термостатичесокй бане при 40°C в контейнере, герметично закрытом соответствующим образом, контролируя рН и поддерживая постоянным. По завершении реакции полученный в результате раствор подвергают гель-фильтрации через колонку Sephadex G-25 (Pharmacia, Milan, Italy) для удаления избытка цианата и уравновешивают с изотоническим солевым раствором, перед фильтрованием через 0,22 мкм мембрану и хранят при 4°C для последующих тестов. Предварительно колонка была соответственно калибрована для получения исключенного пика.

Полученный в результате продукт обладает следующими характеристиками:

- сниженной IgE-связывающей активностью, как показано с помощью экспериментов с EAST-ингибированием

- сохранением иммуногенной активности, как показано экспериментами с ELISA IgG на сыворотках мышей, иммунизированных модифицированным меллитин-истощенным пчелиным ядом

- сохранением молекулярных размеров, как показано экспериментами с использованием SDS-PAGE (фигура 6).

Помимо указанных выше химико-биологических характеристик, модифицированный меллитин-истощенный пчелиный яд, как описано, неожиданно демонстрирует снижение ферментативных активностей, связанных с фосфолипазой A2 и гиалуронидазой, как показано экспериментами с иммунодиффузией на агарозном геле (описаны ниже), с использованием лецитина и гиалуроната натрия соответственно в качестве субстратов. Это наблюдение может вносить вклад в дальнейшее улучшение безопасности продукта, поскольку, в любом случае, указанные выше ферментные компоненты обладают своей собственной фармакологической активностью. Как хорошо известно, фосфолипаза может вызывать повреждение клеточной мембраны (цитолиз), а гиалуронидаза действует как «фактор диффузии яда» путем растворения гиалуроновой кислоты, вещества, находящегося в соединительной ткани, и которое соединяет клетки вместе. Весьма вероятно, в отличие от IgE-связывающей активности, фармакологическое действие, выраженное фосфолипазой и гиалуронидазой, также ингибировано, предпочтительно придавая модифицированному продукту большую безопасность. Действительно, терапевтическое действие пчелиного яда в SIT предполагает активацию иммунологических механизмов и, следовательно, полностью отличается от применения его в противовоспалительной терапии (лечение пчелиным ядом).

Экспериментальные тесты

EAST-ингибирование

Для этой цели активированные глутаральдегидом полистирольные сферы покрывали пчелиным ядом, прошедшим диализ с границей пропускания 10 кДа, в количестве 1 мкг на сферу.

Одновременно получают пул сывороток человека, выбранных от пациентов с аллергическими реакциями на пчелиный яд, с помощью REAST (IgE >20 кЕд/л).

30 мкл серийных разведений тестируемых образцов (немодифицированный пчелиный яд 10 кДа, пчелиный яд 10 кДа, модифицированный 0,05 M цианатом и пчелиный яд 10 кДа, модифицированный 0,5 M цианатом) в PBS-2% BSA (разбавитель) помещают в лунки планшета для ELISA вместе с 20 мкл пула сывороток и смесь оставляют в течение 2 часов при комнатной температуре при встряхивании. Одновременно получают образцы положительного контроля, в которых ингибитор заменен разбавителем. По прошествии двух часов в каждую лунку добавляют одну белок-связанную сферу и 50 мкл PBS-2% BSA и встряхивание планшета продолжают в течение ночи при комнатной температуре. Затем сферы промывают и в каждую лунку добавляют 100 мкл раствора конъюгированных с пероксидазой антител против IgE человека, и планшет инкубируют при встряхивании в течение 2 часов. После промывания три раза развитие колориметрической реакции получают добавлением 100 мкл реагента TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубированием в течение 15 минут при 25°C. Реакцию гасят добавлением 50 мкл 1 н. HCl, и 100 мкл смеси из каждой лунки переносят в новый планшет и интенсивность развившейся цветовой окраски оценивают путем снятия спектрофотометрических показаний при 450 нм.

Измеренные оптические плотности преобразуют в значения процента ингибирования относительно положительного контроля и строят график с процентом ингибирования по оси Y и log₁₀ объема используемого образца в тесте по оси X. По полученным точками строили линию линейной регрессии, на которой измерено значение IC₅₀, которое представляет объем образца в микролитрах, необходимый для ингибирования 50% IgE связывания со сферой.

Эти результаты, показанные на Фиг.3, демонстрируют, что добавление соответствующих концентраций цианата калия в раствор пчелиного яда, не содержащего меллитина, вызывает снижение аллергенной активности самого яда и, в частности, снижение приблизительно в 10 раз (0,070 по сравнению с 0,68 мкл) для 0,05 M цианата и приблизительно в 500 раз (0,070 по сравнению с 32,82 мкл) для 0,5 M цианата.

Протокол иммунизации мышей

Иммунизировали группу мышей, состоящую из четырех самок Balb/c (Charles River), подкожно, с использованием 200 мкл эмульсии, состоящей из 100 мкл полного адъюванта Фрейнда и 20 мкг меллитин-истощенного пчелиного яда, модифицированного 0,5 M KCNO с последующим диализом с границей пропускания 10 кДа, в 100 мкл изотонического солевого раствора. В дальнейшем три повторные инъекции проводили с двухнедельными интервалами, с неполным адъювантом вместо полного. Через семь дней после последней иммунизации у мышей из хвостов брали кровь и проверяли с помощью ELISA специфический IgG ответ в отношении иммуногена (модифицированного меллитин-истощенного пчелиного яда), точно также, как способность распознавать белок дикого типа (меллитин-истощенный пчелиный яд).

IgG ELISA сывороток мышей, иммунизированных модифицированным меллитин-истощенным пчелиным ядом

Равные количества (0,25 мкг) меллитин-истощенного пчелиного яда, в 50 мМ карбонат/бикарбонатном буфере pH 9,6, адсорбировали на лунки полистирольных аналитических планшетов для ELISA путем инкубирования при 4°C в течение 16 часов. Затем лунки промывали промывочным раствором (60 мМ фосфатный буфер pH 6,5, содержащий 0,05% Tween-20), и свободные сайты блокировали раствором разбавителя (25% лошадиной сыворотки, 1 мМ EDTA, 0,05% Tween 20, 0,01% тиомерсала в 150 мМ фосфатном буфере pH 7,4). Равные аликвоты (100 мкл) серийных разведений сыворотки от каждой мыши в буфере для разведения добавляют в каждую лунку и оставляют для инкубирования при 25°C в течение 2 часов. После трех промываний и добавления сыворотки, содержащей антитела против IgG мыши, конъюгированные с пероксидазой, разведенной 1:2000 в буфере для разведения, инкубирование продолжают при 25°C в течение 1,5 часов. После промывания три раза развитие колориметрической реакции получают путем добавления 100 мкл реагента TMB (BioFX Laboratories, Owings Mills, MD) и инкубирования в течение 15 минут при 25°C. Реакцию гасят добавлением 100 мкл 1 н. HCl, и результаты оценивают с помощью спектрофотометрии при 450 нм.

На Фигуре 4 показана IgG реактивность сывороток от животных, иммунизированных пчелиным ядом, модифицированным с использованием 0,5 M цианата относительно белков нативного или цианат-модифицированного меллитин-истощенного пчелиного яда.

Тот факт, что IgG ответ указанных сывороток направлен не только на модифицированный яд (меллитин-истощенный), а также способен распознавать нативный яд (меллитин-истощенный), т.е. немодифицированный яд, демонстрирует, что иммуногенная способность модифицированного яда более или менее неизменна. Это является чрезвычайно важным исходя из терапевтической перспективности, поскольку индукция специфических IgG считается определяющим фактором в проявлении клинической эффективности SIT (Flicker S, Valenta R.; Int. Arch. Allergy Immunol. 2003; 132(1):13-24).

SDS-PAGE

Равные количества (5 мг) пчелиного яда, прошедшего диализ с использованием мембраны с границей пропускания 10 кДа и его образцы, подвергнутые химической модификации с использованием 0,05 или 0,5 M цианата, анализировали с помощью электрофореза на 10% полиакриламидных гелях (гели промышленного производства Nupage Bis-Tris, Novex, Prodotti Gianni, Milan, Italy) как описано ранее (Asero R., Mistrello G. et al. Int. Arch. Allergy Immunol. 2007;144,57-63). Электрофорез проводят в специальном устройстве (Mighty Small II, Hoefer, Milan, Italy) при 180 мА в течение 1 часа. Разделенные таким образом компоненты окрашивают кумасси бриллиантовым синим (набор для окрашивания Colloidal Blue staining kit, Amersham, Milan, Italy), и затем обесцвечивают в воде. Результаты, представленные на Фиг.6, ясно показывают, что использованный процесс химической модификации, существенно не изменяет молекулярные размеры присутствующих компонентов. Этот заключительный элемент является чрезвычайно важным для применения продукта с терапевтическими целями, особенно в случае введения его подъязычно/через слизистую ротовой полости.

Измерение ферментативной активности аллергена фосфолипазы A2

Наличие и количество фосфолипазы A2 (PLA2) в пчелином яде было подчернуто анализом ее ферментативной активности в агарозном геле, содержащем природный субстрат этого фермента (лецитин).

С этой целью было приготовлено 50 мл 2% раствора агарозы в 40 мМ Tris pH 8, 0,1% NaN₃ . После растворения агарозы путем кипячения раствора и последующего охлаждения его приблизительно до 56°C, его добавляют с 50 мл 3% эмульсии соевого фосфатидилхолина (соевый лецитин, Sigma, Milan) в тот же буфер. В конце, после добавления 1 мл 10 мМ CaCl ₂, и распределения 15 мл этой смеси по 100 мм диаметру чашек Петри и оставления их для охлаждения до отверждения геля, чашки оставляют при 4°C в течение ночи. После этого в геле проделывают лунки с диаметром примерно 4 мм и готовят анализируемые растворы, стандарт нативной или модифицированной PLA2 (500, 20 и 1 Ед/мл) или нативного или модифицированного пчелиного яда (с использованием 0,05 M или 0,5 M KCNO) в 1 M NaCl, 0,1% BSA, 0,1% NaN₃.

После пипетирования 10 мкл каждого раствора в лунки (с каждым анализируемым образцом в двух повторах), чашки помещали во влажную камеру при 37°C приблизительно на 20 часов. Наконец, ферментативную активность анализировали путем измерения диаметра прозрачного ареола, который образуется вокруг лунок вследствие гидролиза лецитина. Размер каждого ареола прямо пропорционален ферментативной активности, присутствующей в образце. Размеры ареолов для различных концентраций стандартов фосфолипазы позволяют построить стандартную кривую, из которой значения, полученные для тестируемых образцов, могут быть экстраполированы. Из этого анализа очевидно, что пчелиный яд, прошедший диализ с границей пропускания 10 кДа, имел концентрацию фосфолипазы 76 Ед/мг лиофилизированного яда; после модификации с использованием 0,05 M или 0,5 M KCNO эта активность падала до 57 и 0,8 Ед/мг, соответственно.

Измерение ферментативной активности гиалуронидазного аллергена

Наличие и количество гиалуронидазы в пчелином яде было подчеркнуто анализом ее ферментативной активности в агарозном геле, содержащем природный субстрат этого фермента (гиалуроновую кислоту или гиалуронат натрия).

С этой целью готовили 50 мл раствора гиалуроната натрия в 0,1 M цитрат/NaCl буфере pH 5,3 и, одновременно, 10 мл 3% раствора агарозы в том же буфере. После растворения агарозы путем кипячения раствора и после последующего охлаждения его приблизительно до 60°C два раствора перемешивали и смесь распределяли по 100 мм диаметру чашек Петри. После охлаждения до комнатной температуры до отверждения геля чашки оставляли при 4°C на 2 часа. После этого в геле были проделаны лунки диаметром 4 мм и приготовлены анализируемые растворы, стандарт гиалуронидазы (1000, 500 и 250 Ед/мл) или нативного меллитин-истощенного пчелиного яда или яда, модифицированного с использованием 0,5 M KCNO (два последних в концентрации 50 мкг/мл).

После пипетирования 10 мкл каждого раствора в лунки (с каждым анализируемым образцом в двух повторах), чашки помещали во влажную камеру при 37°C приблизительно на 20 часов. Наконец, ферментативную активность визуализировали, наливая 30 мл 10% цетилпиридиния в H₂O на чашку поверх геля, и анализировали, измеряя диаметр прозрачного ареола, который образуется вокруг лунок на непрозрачном фоне чашки. Размер каждого ареола прямо пропорционален ферментативной активности, присутствующей в образце. Размеры ареолов для различных концентраций старндарта гиалуронидазы позволили построить стандартную кривую, из которой могут быть экстраполированы значения, полученные для тестируемых образцов. Из этого анализа очевидно, что пчелиный яд, прошедший диализ с использованием мембраны с границей пропускания 10 кДа, имел концентрацию гиалуронидазы 9550 Ед/мг лиофилизированного яда; тогда как после модификации с использованием 0,5 M KCNO указанная активность больше не обнаруживалась.

Заключение

Полученный продукт (называемый мономерным аллергоидом для того, чтобы отличить его от других аллергоидов, полученных взаимодействием с альдегидами, формальдегидом или глутаральдегидом, где компоненты принимают очень большие молекулярные размеры, приводя к названию полимерного типа) может представлять идеальный вариант для SIT с использованием введения специфической вакцины, даже путями, отличными от парентерального.

Целью модификации является снижение IgE-связывающей активности (с которой связан риск неблагоприятных побочных реакций) и сохранение иммуногенной способности (понимаемой как способность индуцировать антитела IgG, с которыми связана возможность клинической эффективности) более безопасного препарата пчелиного яда, используемого в SIT у пациентов с аллергическими реакциями на пчелиный яд. Сниженная ферментативная активность мономерного аллергоида по сравнению с немодифицированным аллергеном повышает безопасность его использования.