способ получения рекомбинантного инсулина гларгина

Формула изобретения

1. Способ получения рекомбинантного инсулина гларгина, характеризующегося чистотой по меньшей мере 96% и содержанием гликозилированных примесей по большей мере 1%, посредством экспрессирующей системы на основе дрожжей, включающий:

стадию культивирования дрожжей, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную формулой Х-В-Y-А, кодирующей предшественника инсулина гларгина, в которой

Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту,

В представляет собой В1-В30 последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина гларгина,

Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты,

А представляет собой А1-А21 последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина гларгина,

стадию выделения экспрессирующегося предшественника инсулина гларгина, включающую отделение указанного предшественника инсулина гларгина от дрожжей с получением препарата выделенного предшественника инсулина гларгина,

стадию кристаллизации выделенного предшественника инсулина гларгина,

стадию проведения ферментативной конверсии кристаллов предшественника инсулина гларгина при рН от приблизительно 8 до приблизительно 10 в присутствии трипсина или трипсиноподобного фермента и водорастворимых органических растворителей в соотношении от приблизительно 40% до приблизительно 60% реакционной смеси с образованием инсулина гларгина, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь,

стадию очистки ОФ-ВЭЖХ инсулина гларгина, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь, включающую контактирование указанного инсулина гларгина с хроматографической матрицей, с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты, в которой сначала уравновешивают матрикс приблизительно 10%-ным ацетонитрилом в приблизительно 250 мМ уксусной кислоты с последующей элюцией указанного инсулина гларгина в указанном ацетонитриле, затем повторно уравновешивают матрикс приблизительно 10%-ным ацетонитрилом в буфере на основе органической кислоты в концентрации от приблизительно 20 мМ до приблизительно 200 мМ при рН от приблизительно 3 до приблизительно 8,5 с последующей элюцией указанного инсулина гларгина в указанном ацетонитриле, и далее повторно уравновешивают матрикс приблизительно 6%-ным этанолом в буфере на основе органической кислоты в концентрации от приблизительно 10 мМ до приблизительно 50 мМ с последующей элюцией указанного инсулина гларгина в указанном этаноле, и

стадию осаждения очищенного инсулина гларгина с чистотой по меньшей мере 96% и содержанием гликозилированных примесей по большей мере 1% посредством добавления буфера на основе лимонной кислоты и хлорида цинка при рН от приблизительно 6 до приблизительно 8.

2. Способ по п.1, в котором линкерный пептид представляет собой последовательность, содержащую по меньшей мере две аминокислоты, при условии, что первые две аминокислоты представляют собой "RR".

3. Способ по п.1, в котором предшественник инсулина гларгина, определенный SEQ ID No:1 или SEQ ID No:2, клонируют в рамке считывания с сигнальным пептидом.

4. Способ по п.3, в котором предшественник инсулина гларгина, определенный SEQ ID No:1 или SEQ ID No:2, клонируют в рамке считывания с сигнальным пептидом mat- .

5. Способ по п.1, в котором дрожжи представляют собой Pichia pastoris штамма GS115.

6. Способ по п.1, включающий стадию инокуляции водной ферментационной среды трансформантом штамма дрожжей, несущим экспрессирующий вектор, который направляет экспрессию указанного инсулина гларгина, и стадию выращивания трансформированного штамма в ферментационной среде в условиях, эффективных для экспрессии указанного инсулина гларгина.

7. Способ по п.1, в котором предшественник инсулина гларгина выделяют с использованием катионообменной хроматографии.

8. Способ по п.1, в котором стадию кристаллизации предшественника инсулина гларгина осуществляют посредством добавления 4% раствора хлорида цинка и фенола в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,5% при рН от приблизительно 3 до приблизительно 8, предпочтительно рН от приблизительно 3,5 до приблизительно 5,5 и температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 30°С.

9. Способ п.1, в котором стадию ферментативной конверсии осуществляют в присутствии трипсина в водорастворимом органическом растворителе при рН от приблизительно 8 до приблизительно 10 и температуре от приблизительно 2°С до приблизительно 25°С.

10. Способ по п.9, в котором водорастворимый органический растворитель выбирают из группы, включающей ДМСО, ДМФ, этанол, ацетон, ацетонитрил, этилацетат или их смеси.

11. Способ по п.1, в котором полярный органический буферный растворитель представляет собой ацетонитрил.

12. Способ по п.1, в котором буфер на основе органической кислоты выбирают из группы, включающей лимонную кислоту, уксусную кислоту, борную кислоту, муравьиную кислоту, хлористоводородную кислоту и фосфорную кислоту.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам отделения и/или очистки примесей, дающим очищенный продукт гетерологичного белка, свободный от родственных примесей или с практически минимальными количествами данных гликозилированных примесей. Более конкретно изобретение относится к идентификации гликозилированных форм аналогов инсулина, таких как примеси гларгина, характеризующиеся постэкспрессией в системах на основе дрожжей, таких как Pichia pastoris. Изобретение также относится к способам, используемым для клонирования гена, кодирующего белок инсулина гларгина; инсерции соответствующего гена в подходящие дрожжи-хозяин; получения культуры рекомбинантного штамма, стимуляции экспрессии гетерологичного полипептида, его секреции и очистки после ферментации и соответствующих ферментных конверсий.

Уровень техники

Рекомбинантные формы инсулина, аналоги и/или производные инсулина получены в различных микробных экспрессирующих системах. В настоящее время такие организмы, как E.coli, S.cerevisiae, используют для коммерческого получения рекомбинантного человеческого инсулина и его производных. Вследствие ряда недостатков данных систем, таких как низкие уровни экспрессии, трудности последующей очистки и т.п., предпочтительно использование метилотрофных дрожжей Pichia pastoris в качестве системы экспрессии белка. Экспрессирующая система дает ряд преимуществ, например высокий уровень экспрессии, простая обработка, низкая стоимость производства, культура высокой плотности (US 6800606).

Дрожжевые экспрессирующие системы популярны, поскольку их легко выращивать, они быстро развиваются и масштабируются; однако некоторые дрожжевые экспрессирующие системы дают нестабильные результаты, и иногда трудно достигнуть высоких выходов. Одной из дрожжевых экспрессирующих систем, которая демонстрирует высокую перспективность, является метилотрофная Pichia pastoris. По сравнению с другими эукариотическими экспрессирующими системами Pichia дает много преимуществ, поскольку у нее отсутствует проблема эндотоксина, связанная с бактериями, или проблема заражения вирусами, характерная для белков, образуемых в культурах клеток животных (см. статью Cino, Am Biotech Lab, May 1999). Скорость продуктивного роста Pichia делает ее легко масштабируемой для широкомасштабного производства, хотя проблемы масштабирования включают контроль рН, ограничение кислорода, ограничение питательных веществ, колебания температуры и другие вопросы безопасности (см. статью Gottschalk, 2003, BioProcess IntI 1(4):54-61; Cino Am Biotech Lab, май 1999).

Хотя с экспрессирующими системами на основе дрожжей, таких как Pichia pastoris, связывают различные преимущества, одним из основных недостатков данной системы является посттрансляционная модификация полученных в результате белков, которые затем присутствуют в качестве примесей в конечном продукте, который трудно очистить. Несмотря на то, что известен ряд посттрасляционных модификаций белков, наиболее распространенной формой посттрансляционной модификации является гликозилирование (см. статью Hart G.W, Glycosylation, Curr. Opin. Cell. Biol 1992; 4:1017). Гликозилирование может быть либо N-связанным, либо O-связанным в зависимости от экспрессирующей системы (см. статью Gemmill TR et al., Overview of N- and O- linked oligosaccharide structures found in various yeast species (Обзор N- и O-связанных олигосахаридных структур, обнаруженных в различных видах дрожжей), Biochemica et Biophysica Acta, 1999; 1426:227). Гликозилирование влияет на стабильность конформации белка, иммуногенность, скорость выведения, защиту от протеолиза и повышает растворимость белка (см. статью Walsh G, Biopharmaceutical benchmarks 2006, Nature Biotechnology, 2006; 24:769).

Несмотря на большие успехи в усовершенствовании биотехнологического производства, не существует никаких общих решений для каждого белка. Способ производства специфического терапевтического белка требует новых и инновационных решений проблем, которые могут быть специфическими для данного белка или семейства белков. Аналогично удачные варианты коммерческого применения часто основаны на сочетании специфических свойств белка или семейства белков и способов получения, используемых для производства данного белка или семейства белков в качестве фармацевтических продуктов.

Настоящее изобретение относится к идентификации различных гликоформ аналогов инсулина, более конкретно инсулина гларгина, посредством химических способов идентификации, связанных с методами масс-спектрометрии, таких как электроспрей ионизация и ионизация путем матричной лазерной десорбции. Таким образом изобретение будет давать возможность избирательной очистки продукта от вышеуказанных примесей с помощью оптимизированных дальнейших способов очистки, связанных с более глубоким пониманием природы примесей, присутствующих в конечном продукте. Конечный продукт, очищенный таким образом, будет в существенной степени свободен от примесей, описанных в данном изобретении.

US 4444683 и родственные ей заявки раскрывают гликозилированные инсулины, в которых глюкоза или манноза, которые связаны с инсулином через спейсерную группу, получены из дикарбоновых кислот, ангидридов кислот или фениламинов либо их комбинаций.

WO 90/10645, в частности, раскрывает гликозилированный инсулин, содержащий одну или более моносахаридных групп либо одну или более олигосахаридных групп, содержащих до трех сахарных групп. Описаны моногликозилированные или тригликозилированные инсулины в положениях А1, В1 или В29.

WO 99/52934 заявляет способ отделения гликозилированных белков от негликозилированных белков путем хроматогрфической обработки раствора, содержащего гликозилированные и негликозилированные белки, с использованием содержащего Са++ элюента и получения фракции, содержащей негликозилированные белки, причем указанная фракция в существенной степени свободна от гликозилированных белков.

Гликоформы гларгина не раскрыты ни в одном из материалов, соответствующих предшествующему уровню техники. В изобретении обсуждают способы очистки аналогов инсулина, таких как инсулин гларгин с пониженными уровнями данных охарактеризованных гликозилированных примесей, для получения продукта гларгина 100% чистоты после ферментации с помощью экспрессирующих систем на основе дрожжей.

Раскрытие изобретения

Основной целью настоящего изобретения является разработка способа получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в дрожжевой экспрессирующей системе, отличающегося тем, что указанный очищенный белок свободен от или содержит практически минимальные количества гликозилированных побочных продуктов.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессируемого в клетке-хозяине.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа получения очищенного биологически активного гетерологичного белка.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного биологически активного продукта гетерологичного белка с чистотой по меньшей мере 96%.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного биологически активного продукта гетерологичного белка с чистотой, лежащей в интервале 97-100%.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного инсулина гларгина с чистотой по меньшей мере 96%.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного инсулина гларгина, содержащего меньше чем 1% гликозилированных примесей.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного инсулина гларгина, свободного от гликозилированных примесей.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного инсулина гларгина, свободного от гликозилированных примесей, причем гликозилированная форма белка может быть моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.

Соответственно, настоящее изобретение относится: к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в дрожжевой экспрессирующей системе, отличающемуся тем, что указанный очищенный белок свободен или содержит практически минимальные количества гликозилированных побочных продуктов; способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в клетке-хозяине, причем способ включает стадии: а) культивирования клеток-хозяев, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную формулой I, кодирующей гетерологичный белок, в условиях, подходящих для экспрессии белка; b) выделения экспрессирующегося белка, включающего выделение указанного белка из клеток-хозяев для получения препарата выделенного белка; с) обработки белка, выделенного на стадии (b), на стадии кристаллизации; d) проведение стадии ферментной конверсии в присутствии трипсина или фермента, подобного трипсину; е) очистку указанного белка, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь, включающую контактирование указанной смеси белков с хроматографической матрицей, причем очистку проводят с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты; и f) осаждение элюированного белка; способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка по п.9, который предусматривает: а) инокуляцию водной ферментационной среды трансформантом штамма дрожжей, несущим экспрессирующий вектор, который направляет экспрессию указанного белка; и b) выращивание трансформированного штамма в ферментационной среде в условиях, эффективных в плане экспрессии указанного белка; к очищенному биологически активному гетерологичному белку с чистотой по меньшей мере 96%; очищенному биологически активному продукту гетерологичного белка с чистотой, лежащей в интервале 97-100%; очищенному инсулину гларгину с чистотой по меньшей мере 96%; очищенному инсулину гларгину, содержащему меньше чем 1% гликозилированных примесей; очищенному инсулину гларгину, свободному от гликозилированных примесей; и очищенному инсулину гларгину, причем гликозилированная форма белка может быть моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.

Настоящее изобретение относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в дрожжевой экспрессирующей системе, отличающемуся тем, что указанный очищенный белок свободен или содержит практически минимальные количества гликозилированных побочных продуктов.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ДНК, кодирующая гетерологичный белок, представлена формулой I

Х-В-Y-А,

в которой

Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту;

В представляет собой последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов;

Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты;

А представляет собой последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов и А- и В-цепь могут быть модифицированы заменой, делецией и/или добавлениями аминокислот.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения линкерный пептид может представлять собой любую последовательность, содержащую по меньшей мере две аминокислоты, при условии, что первые две аминокислоты представляют собой "RR".

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный белок определен SEQ ID:1 или SEQ ID:2.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин дрожжевой экспрессирующей системы выбрана из Pichia sp.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин дрожжевой экспрессирующей системы выбрана из группы, включающей Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, Schisosaccharomyces pombe, Yarrovia lipolitica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения гликозилированная форма белка может быть моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный очищенный белок содержит меньше чем 1% гликозилированных примесей.

Настоящее изобретение также относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в клетке-хозяине, причем способ предусматривает стадии:

a) культивирования клеток-хозяев, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную формулой I, кодирующей гетерологичный белок в условиях, подходящих для экспрессии белка;

b) выделения экспрессированного белка, включающего отделение указанного белка от клеток-хозяев с целью получения препарата выделенного белка;

c) воздействия на выделенный белок, соответствующий стадии (b), для проведения стадии кристаллизации;

d) проведения стадии ферментной конверсии в присутствии трипсина или фермента, подобного трипсину;

e) очистки указанного белка, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь, предусматривающей контактирование указанной смеси белков с хроматографической матрицей, причем очистку осуществляют с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты, и

f) осаждения элюированного белка.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ДНК, кодирующая гетерологичный белок, представлена формулой I

Х-B-Y-A

в которой

Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту;

В представляет собой последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов;

Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты;

А представляет собой последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов, и А- и В-цепь могут быть модифицированы заменой, делецией и/или добавлениями аминокислот.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения линкерный пептид может представлять собой любую последовательность, содержащую по меньшей мере две аминокислоты, при условии, что первые две аминокислоты представляют собой "RR".

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения ген, определенный SEQ ID 1 или 2, клонирован в рамке считывания с сигнальным пептидом.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения ген, определенный SEQ ID 1 или 2, клонирован в рамке считывания с сигнальным пептидом mat-or.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана Pichia sp.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана из группы, содержащей Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, Schisosaccharomyces pombe, Yarrovia lipolitica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой Pichia pastoris.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой GS115.

Настоящее изобретение также относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, который предусматривает:

a) инокуляцию водной ферментационной среды трансформантом штамма дрожжей, несущим экспрессирующий вектор, который направляет экспрессию указанного белка, и

b) выращивание трансформированного штамма в ферментационной среде в условиях, эффективных для экспрессии указанного белка.

Настоящее изобретение также относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, причем экспрессирующийся белок выделяют из ферментационного бульона с использованием ионообменной хроматографии.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ содержит стадию кристаллизации белка путем добавления хлорида цинка и фенола.

Настоящее изобретение также относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, причем указанный способ предусматривает стадию ферментной конверсии, осуществляемую в присутствии трипсина в смешивающемся с водой органическом растворителе.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения смешивающийся с водой органический растворитель выбран из группы, включающей ДМСО (диметилсульфоксид), ДМФ (диметилформамид), этанол, ацетон, ацетонитрил, этилацетат или их смеси.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ предусматривает стадию очистки ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовой ВЭЖХ) смеси белков, содержащей по меньшей мере одну родственную примесь, путем контактирования указанной смеси белков с матрицей хроматографической смолы, причем очистку проводят с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полярный буферный растворитель представляет собой ацетонитрил.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения буфер на основе органической кислоты выбран из группы, содержащей лимонную кислоту, уксусную кислоту, борную кислоту, муравьиную кислоту, хлористоводородную кислоту и фосфорную кислоту.

Настоящее изобретение также относится к продукту очищенного биологически активного гетерологичного белка, полученному согласно любому из предшествующих пунктов формулы, с чистотой по меньшей мере 96%.

Настоящее изобретение также относится к способу получения продукта очищенного, биологически активного гетерологичного белка с чистотой, лежащей в интервале 97-100%.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен очищенный инсулин гларгин с чистотой по меньшей мере 96%.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен очищенный инсулин гларгин, содержащий меньше чем 1% гликозилированных примесей.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения очищенный инсулин гларгин не содержит гликозилированных примесей.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен очищенный инсулин гларгин, причем гликозилированная форма белка может быть моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.

Теперь будет сделана подробная ссылка на представленные в настоящее время предпочтительные варианты осуществления изобретения, которые вместе со следующим примером служат для объяснения принципов изобретения.

Нижеследующие примеры приведены, чтобы помочь в понимании изобретения, но они не предназначены и их не следует истолковывать как ограничивающие его объем каким-либо образом. Примеры не включают детальные описания принятых способов, используемых для конструирования векторов, инсерции генов, кодирующих полипептиды, в данные векторы или интродукции полученных в результате плазмид в хозяев. Кроме того, примеры не включают детальное описание принятых способов, используемых для анализа полипептидов, продуцируемых данными векторными системами хозяина. Данные способы хорошо известны обычным специалистам в области техники и описаны в многочисленных публикациях, включенных в виде примеров.

Согласно одному из аспектов изобретения представлен способ получения очищенного, биологически активного гетерологичного белок, рекомбинантно экспрессирующегося в клетке-хозяин, причем способ включает стадии:

a) культивирования клеток-хозяев, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную SEQ ID 1 или 2, кодирующей гетерологичный белок в условиях, подходящих для экспрессии белка;

b) выделения экспрессирующегося белка, включающего отделение указанного белка от клеток-хозяев с целью получения препарата выделенного белка;

c) воздействия на выделенный белок, соответствующий стадии (b), для проведения стадии кристаллизации;

d) проведения стадии ферментной конверсии в присутствии трипсина или фермента, подобного трипсину;

е) очистки указанного белка, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь, предусматривающей контактирование указанной смеси белков с хроматографической матрицей, причем очистку осуществляют с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты,

f) осаждения элюированного белка.

Определения:

Термины "клетки" или "культуры клеток" или "рекомбинантные клетки-хозяева" или "клетки-хозяева" часто используют взаимозаменяемо, как будет ясно из контекста. Данные термины включают непосредственную данную клетку, которая экспрессирует требуемый белок, соответствующий настоящему изобретению, и, конечно, их потомство. Следует понимать, что не все потомство абсолютно идентично родительской клетке вследствие случайных мутаций или различий в окружающей среде. Однако данное измененное потомство включено в данные термины до тех пор, пока потомство сохраняет характеристики, соответствующие тем, которые присущи исходной трансформированной клетке.

Как используют в данном контексте, термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин "экспрессирующий вектор" включает плазмиды, космиды или фаги, способные синтезировать данные белки, кодируемые соответствующими им рекомбинантными генами, переносимыми вектором. Предпочтительными векторами являются векторы, способные к автономной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны. В настоящей заявке термины "плазмида" и "вектор" используют взаимозаменяемо, поскольку плазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора. Более того, изобретение предусматривает включение данных других форм экспрессирующих векторов, которые выполняют эквивалентные функции и которые станут известны в области техники после появления данного материала.

Имеют в виду, что полипептиды, на которые ссылаются в данном контексте, как на обладающие активностью инсулина гларгина, например, представляют собой инсулин гларгин, имеют последовательность аминокислот с двумя изменениями структуры человеческого инсулина: замену аминокислотой глицином нативного аспарагина в положении А21 А-цепи человеческого инсулина и добавление двух молекул аргинина в NH2-концевую часть В-цепи человеческого инсулина, полученного технологией рекомбинантной ДНК. Первичным действием любого инсулина, включая инсулин гларгин, является регуляция метаболизма глюкозы. Инсулин и его аналоги снижают уровни глюкозы в крови путем стимуляции периферического поглощения глюкозы, особенно в скелетной мускулатуре и жире, и путем ингибирования образования глюкозы в печени.

ДНК, кодирующая гетерологичный белок, представлена формулой I

Х-В-Y-A

в которой

Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту;

В представляет собой последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов;

Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты;

А представляет собой последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов, и А- и В-цепь могут быть модифицированы заменой, делецией и/или добавлениями аминокислот.

Термин "С-пептид" или "линкерный пептид", как используют в данном контексте, включает все формы С-пептида инсулина, включая нативные или синтетические пептиды. Данные С-пептиды инсулина могут представлять собой человеческие пептиды или могут быть выделены у других видов и родов животных, предпочительно млекопитающих. Таким образом варианты и модификации нативного С-пептида инсулина включены до тех пор, пока они сохраняют активность С-пептида инсулина. В области техники известно, что можно модифицировать последовательности белков или пептидов, пока сохраняется их полезная активность, и этого можно достигнуть при использовании способов, которые являются стандартными в области техники и широко описаны в литературе, например, ненаправленный или сайт-направленный мутагенез, расщепление и лигирование нуклеиновых кислот и т.п. Таким образом, функционально эквивалентные варианты или производные нативных последовательностей С-пептида инсулина могут быть легко получены согласно способам, хорошо известным в области техники, и включают последовательности пептидов, обладающих функциональной, например биологической, активностью нативного С-пептида инсулина. Все данные аналоги, варианты, производные или фрагменты С-пептида инсулина, в частности, включены в объем данного изобретения и объединены под термином "С-пептид инсулина".

Линкерная последовательность может представлять собой любую последовательность, имеющую по меньшей мере две аминокислоты. Линкерный участок может включать от 2 до 25, от 2 до 15, от 2 до 12 или от 2 до 10 аминокислотных остатков, хотя длина не является важной и может быть подобрана для удобства или согласно необходимости.

Линкерный пептид может представлять собой любую последовательность, содержащую по меньшей мере две аминокислоты при условии, что первые две аминокислоты представляют собой "RR". Более того, как правило, будут иметь в виду, что в некоторых случаях будет полезным получить гомологи форм данного белка инсулина гларгина, которые представляют собой либо агонисты, либо антагонисты только подгруппы биологических активностей данного белка. Таким образом можно получить специфические биологические эффекты путем лечения гомологом ограниченной функции и с меньшими побочными эффектами.

В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, соответствующая изобретению, кодирует полипептид, который представляет собой либо агонист, либо антагонист белка человеческого инсулина гларгина и содержит последовательность аминокислот, представленную SEQ ID No:2. Предпочтительные нуклеиновые кислоты кодируют пептид, обладающий активностью белка инсулина гларгина и по меньшей мере на 90% гомологичный, более предпочтительно на 95% гомологичный и наиболее предпочтительно на 97% гомологичный последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID No:2. Нуклеиновые кислоты, которые кодируют агонистические или антагонистические формы белка инсулина гларгина и имеют гомологию по меньшей мере приблизительно 98-99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID No:2, также входят в объем изобретения. Предпочтительно, когда нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК, содержащую по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности, кодирующей белок инсулина гларгина, приведенный в SEQ ID No.1.

Термин "функциональные элементы", как обсуждают в данном контексте, включает по меньшей мере один промотор, по меньшей мере один оператор, по меньшей мере одну лидерную последовательность, по меньшей мере одну последовательность Шайна-Дальгарно, по меньшей мере один кодон терминатора и любые другие последовательности ДНК, необходимые или предпочтительные для правильной транскрипции и последующей трансляции векторной ДНК. В частности, предусматривают, что данные векторы будут содержать по меньшей мере один ориджин репликации, распознаваемый микроорганизмом-хозяином, вместе с по меньшей мере одним выбираемым маркером и по меньшей мере одной промоторной последовательностью, способной инициировать транскрипцию синтетической последовательности ДНК. Кроме того, предпочтительно, когда вектор в одном варианте осуществления содержит ряд последовательностей ДНК, способных действовать как регуляторы, и другие последовательности ДНК, способные кодировать регуляторный белок. Данные регуляторы в одном из вариантов осуществления служат для предупреждения экспрессии последовательности ДНК при некоторых условиях окружающей среды, а при других условиях окружающей среды дают возможность транскрипции и последующей экспрессии белка, кодируемого последовательностью ДНК.

Кроме того, предпочтительно, когда присутствует соответствующая секреторная лидерная последовательность либо в векторе, либо на 5'-конце последовательности ДНК. Лидерная последовательность находится в положении, которое позволяет лидерной последовательности непосредственно прилегать к начальной части нуклеотидной последовательности, способной направлять экспрессию ингибитора требуемого белка без какого-либо нарушения сигналов терминации трансляции. Присутствие лидерной последовательности требуется отчасти по одной или более из следующих причин:

1) присутствие лидерной последовательности может облегчать процессинг хозяином исходного продукта с получением продукта зрелого рекомбинантного белка;

2) присутствие лидерной последовательности может облегчать очистку продукта рекомбинантного белка, направляя ингибитор протеазы из цитоплазмы клетки;

3) присутствие лидерной последовательности может действовать на способность продукта рекомбинантного белка укладываться в свою активную структуру, направляя белок из цитоплазмы клетки.

Термин "последовательность регуляции транскрипции" является генетическим термином, используемым на протяжении описания в отношении последовательностей ДНК, таких как сигналы инициации, энхансеры и промоторы, которые индуцируют или контролируют транскрипцию последовательностей, кодирующих белок, с которыми они функционально связаны. В предпочтительных вариантах осуществления транскрипция гена рекомбинантного инсулина гларгина находится под контролем промоторной последовательности (или другой последовательности регуляции транскрипции), которая контролирует экспрессию рекомбинантного гена в типе клеток, в котором планируют осуществить экспрессию.

Термин "контролирующие последовательности" относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контролирующие последовательности, которые подходят для прокариот, например, включают промотор, необязательно последовательность оператора, сайт связывания рибосом и, возможно, другие, пока еще недостаточно понятные последовательности. Эукариотические клетки, как известно, используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Термин "трансформация" означает интродукцию ДНК в организм, так что ДНК реплицируется либо как внехромосомный элемент, либо путем интеграции в хромосому. В зависимости от используемой клетки-хозяина трансформацию осуществляют с использованием стандартных способов, подходящих для данных клеток. Основные аспекты трансформаций системы клеток млекопитающих-хозяев описаны Axel в патенте США No.4399216, выданном 16 августа 1983 г. Трансформации в дрожжах, как правило, проводят согласно способу, описанному в статьях Van Solingen, P., et al., J. Bad, 130: 946 (1977) и Hsiao, С.L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 3829 (1979).

Рекомбинантную экспрессирующую систему выбирают из прокариотических и эукариотических хозяев. Эукариотические хозяева включают дрожжевые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris), клетки млекопитающих или клетки растений. Бактериальные и эукариотические клетки доступны для компетентных специалистов в области техники в ряде различных источников, включая коммерческие источники, например, Американскую коллекцию типовых культур (АТСС; Rockville, Md.). Коммерческие источники клеток, используемых для экспрессии рекомбинантных белков, представляют также инструкции по использованию клеток. Выбор экспрессирующей системы зависит от свойств, необходимых для экспрессируемого полипептида.

Следовательно, целью настоящего изобретения является экспрессирующая система или кассета, которая является функциональной в клетке, выделенной из дрожжей, выбранных из группы, состоящей из штамма Pichia, особенно выбранных из группы, состоящей из Pichia pastoris, Pichia methanolica и Schizosaccharomyces pombe, и дающей возможность экспрессии требуемого полипептида, кодирующего фрагменты его белка, помещенная под контроль элементов, необходимых для его экспрессии.

Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте для описания белка или полипептида, означает полипептид, образованный путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте в отношении клеток, означает клетки, которые могут быть или были использованы в качестве реципиентов для рекомбинантных векторов или другого переноса ДНК, и включает потомство исходной клетки, которая была трансфицирована. Следует понимать, что потомство одной родительской клетки может не быть полностью идентичным исходному родителю по морфологии или комплементу геномной либо общей ДНК вследствие случайной или направленной мутации. Потомство родительской клетки, которое достаточно близко родителю, характеризуемое соответствующим свойством, таким как присутствие нуклеотидной последовательности, кодирующей требуемый полипептид, также считают потомством.

"Ген, представляющий интерес" (далее ГПИ), является любой последовательностью нуклеиновой кислоты, повышенная транскрипционная экспрессия которой необходима. ГПИ может кодировать функциональную молекулу нуклеиновой кислоты (например, РНК, такую как антисмысловая молекула РНК) или, более типично, кодирует пептид, полипептид или белок, повышенная продукция которого необходима. Векторы, соответствующие изобретению, можно использовать для экспрессии "гетерологичного" белка. Как используют в данном контексте, термин "гетерологичный" означает последовательность нуклеиновой кислоты или полипептид, которые происходят из других видов или которые в значительной степени модифицированы относительно их исходной формы, если они происходят от одного и того же вида. Более того, модифицированные или немодифицированные последовательности нуклеиновой кислоты или полипептид, которые в норме не экспрессируются в клетке, считают гетерологичными. Векторы, соответствующие изобретению, могут иметь один или более ГПИ, введенные в один и тот же или различные сайты инсерции, причем каждый ГПИ функционально связан с регуляторной последовательностью нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает возможность экспрессии ГПИ.

Термин "очистка" пептида из композиции, содержащей пептид и одну или более примесей, означает повышение, таким образом, степени чистоты пептида в композиции путем снижения содержания по меньшей мере одной примеси из композиции пептидов. Более конкретно способ очистки, соответствующий настоящему изобретению, дает в результате биологически активный гетерологичный белок, рекомбинантно экспрессирующийся в дрожжевой экспрессирующей системе, отличается тем, что указанный очищенный белок свободен или содержит практически минимальные количества гликозилированных побочных продуктов.

Помимо гликозилированных форм, с помощью MALDI (m/Z: 6089) подтверждают наличие неполярных примесей. Присутствие данной неполярной примеси варьирует в интервале 0-0,5% в конечном продукте, который получают во время процессинга гларгина. Разница в массе между гларгином (m/z: 6063) и неполярными примесями (m/z: 6089) составляет 26 единиц. Химическая идентичность, основанная на молекулярной массе, указывает на вероятность потери воды в одной из аминокислот и ацетилирование.

Термин "хроматография" относится к способу, которым представляющее интерес растворенное вещество в смеси отделяют от других растворенных веществ в смеси в результате различий в скоростях, с которыми индивидуальные растворимые вещества смеси проходят через стационарную среду под воздействием подвижной фазы, или в процессах связывания и элюции.

Термин "высокоэффективная жидкостная хроматография", как используют в данном контексте, относится к такой хроматографической процедуре, в которой частицы (стационарная фаза), используемые в упаковке колонки, маленькие (от 3 до 50 мк) и правильной формы с незначительными отклонениями от выбранного размера. В данной хроматографии, как правило, используют относительно высокое (приблизительно 3,45÷24,13 МПа (500-3500 psi)) давление на входе.

После выбора организма-хозяина вектор переносят в организм-хозяин, используя способы, как правило, известные обычному специалисту в области техники. Примеры данных способов можно найти в монографии R.W.Davis et. al. Advanced Bacterial Genetics (Успехи бактериальной генетики), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (1980), которая специально включена в данном контексте в виде ссылки. В одном варианте осуществления предпочтительно, когда трансформация происходит при низких температурах, причем регуляцию температуры рассматривают как средство регуляции экспрессии генов посредством использования функциональных элементов, как представлено.

Микроорганизмы-хозяева культивируют в условиях, подходящих для экспрессии предшественника инсулина гларгина. Данные условия, как правило, специфичны для организма-хозяина, и обычный специалист в области техники легко установит их в свете опубликованной литературы, имеющей отношение к условиям роста данных организмов, например, монографии Bergey Manual of Determinative Bacteriology (Справочник по определениям в бактериологии), 8 изд., Williams &Wilkins Company, Baltimore, Md., которая специально включена в данном контексте в виде ссылки.

Таким образом, выражение кодирующая последовательность, "функционально связанная" с контролирующими последовательностями, относится к конфигурации, в которой кодирующая последовательность может экспрессироваться под контролем данных последовательностей и в которой связанные последовательности ДНК следуют друг за другом и, в случае секреторного лидера, следуют друг за другом и находятся в фазе считывания.

Согласно одному аспекту изобретения предшественник инсулина гларгина формулы Х-В-цепь гларгина [В1-В30]-Y-А-цепь гларгина [А1-А21], где Х представляет собой лидерную последовательность, В-цепь представляет собой последовательность В-цепи гларгина В1-В30, Y представляет собой линкерную пептидную последовательность между В-цепью и А-цепью, А-цепь представляет собой А-цепь гларгина. Предшественник GIP-А можно получить путем экспрессии в экспрессирующей системе хозяина, не включая бактерии, отличные от Е. coli, дрожжи, такие как Saccharomyces и Kluvyeromyces, способы, предназначенные для которых, известны компетентным специалистам в области техники (см. Methods in Enzymology (Методы в энзимологии), т.194), и грибы, такие как Aspergillus, Neurospora и Trichoderma, способы, предназначенные для которых, известны компетентным специалистам в области техники, как описано в монографии Applied Molecular Genetics of Fungi (Прикладная молекулярная генетика грибов), под ред. Peberdy, Caten, Ogden и Bennett (Cambridge University Press, N.Y. 1991), многие из которых можно получить в Американской коллекции типовых культур, Rockville, Md., которые рутинно используют данные специалисты в области техники. Предпочтительно, когда штамм-хозяин выбран из группы, содержащей дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae, Schisosaccharomyces pombe, Yarrovia lipolitica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis, Pichia methanolica и Pichia pastoris, которые способны экспрессировать высокие уровни рекомбинантного белка. Еще более предпочтительно, когда штамм-хозяин представляет собой Pichia pastoris.

В частности, настоящее изобретение предусматривает способ получения белка инсулина гларгина, включающий процесс ферментации, процесс выделения и процесс очистки. Способ, предусматриваемый в данном контексте, включает процесс ферментации, в котором вышеуказанный белок продуцируется в Pichia pastoris, имеющей по меньшей мере одну последовательность, кодирующую указанный белок, интегрированную в геном, причем процесс ферментации включает ферментацию посевного материала для выращивания клеток-хозяев до требуемой густоты клеток и процесс ферментации с образованием продукта, включающий периодическую ферментацию на глицерине, ферментацию с индукцией метанолом и конечную продукцию.

Затем предшественник гларгина захватывают из ферментационного бульона, используя катионообменную хроматографию. Процесс выделения, предусматриваемый в данном контексте, обеспечивает связывание предшественника гларгина и удаление клеток и клеточного дебриса, причем процесс выделения, предусматриваемый в данном контексте, дает выход 95%. Альтернативно компетентный специалист в области техники может протестировать и оценить альтернативные способы связывания требуемого белкового продукта и удаления клеток и клеточного дебриса, включая, но без ограничения перечисленным, различные другие хроматографические способы, центрифугирование, фильтрование, дифференцированное осаждение и другие способы, которые будут определены.

Предшественник гларгина, захваченный из ферментационного бульона, далее подвергают кристаллизации для удаления окрашивания и хранения. Осаждение предшественника в кристаллической форме удобно проводить в водном носителе при рН, лежащем в интервале от 3,0 до 8,0, предпочтительно 4,0-6,0, наиболее предпочтительно при рН 4,0-5,0, причем концентрация белка в водном носителе лежит в интервале от 1 до 80 г/л, предпочтительно от 2 до 50 г/л, наиболее предпочтительно от 8 до 14 г/л. Процесс кристаллизации можно проводить при температуре от 2 до 30°С. Кристаллы предшественника можно выделить из супернатанта либо центрифугированием, декантацией, либо фильтрованием.

Кристаллизация предшественника гларгина GIP-A удаляет примеси, принесенные из ферментационного бульона в объединенные фракции, полученные при элюции с катионообменной смолы, а также соль ацетат аммония, которую используют для элюции продукта при хроматографии. Чистый кристаллический предшественник также помогает снизить стоимость последующих стадий и повысить эффективность реакции. Кристаллическую форму можно заморозить и хранить, что впоследствии делает ее стабильной в течение многих дней при хранении при -20°С.

Гларгин можно получить из предшественника гларгина путем ферментной конверсии. Конверсию осуществляют в присутствии трипсина или ферментов, подобных трипсину, растительной, животной или микробной природы. Реакцию проводят предпочтительно в присутствии смешивающихся с водой органических растворителей, таких как ДМСО (диметилсульфоксид), ДМФ (диметилформамид), этанол, ацетон, ацетонитрил или этилацетат, особенно ДМФ и ДМСО. Предпочтительное соотношение органического растворителя составляет приблизительно 0-65%, в частности приблизительно 40-60% от реакционной смеси.

Гларгин получают путем обработки предшественника GIP-A трипсином. Лидер (если он присутствует) будет отщеплен от предшественника трипсином. Реакцию трипсина контролируют таким образом, чтобы расщепление по С-концу "RR" С-пептида было максимальным. Однако реакция на может исключить нежелательное расщепления трипсином в других центрах расщепления трипсина. Возможные другие центры расщепления трипсина находятся между "RR" и С-концом В-22 (Arg).

Обоснование для использования органических растворителей следует установить по растворимости исходных материалов, тенденции ферментов к денатурации и их активности гидролиза. Как может иметь в виду компетентный специалист, можно также использовать смеси органических растворителей. Добавление органических растворителей снижает концентрацию воды в реакционной смеси, приводя в результате к предупреждению гидролиза продукта и, кроме того, значительно повышает растворимость продуктов.

Концентрация предшественника, как правило, составляет приблизительно 5-50 г/л. Реакцию проводят при рН приблизительно 5-12, предпочтительно рН приблизительно 8-10. Температура реакции составляет приблизительно 0-40°С предпочтительно приблизительно 2-25°С. Можно использовать трисгидроксиметиламинометан (ТРИС) или другие буферные системы при различных значениях ионной силы для поддержания требуемого значения рН. Время реакции варьирует, и на него влияют другие условия реакции. Реакцию можно продолжать до тех пор, пока чистота продукта не начинает снижаться вследствие гидролиза продукта. Она занимает, как правило, приблизительно от 30 минут до 24 часов и в большинстве случаев составляет приблизительно 4-10 часов.

Концентрацию фермента определяют в зависимости от концентрации субстратов и активности фермента. Например, кристаллический трипсин, имеющийся в продаже, используют предпочтительно в концентрации приблизительно 10-100 мг/л реакционной смеси.

Способ очистки предусматривает обработку образца инсулина гларгина на стадии очистки путем обращенно-фазовой хроматографии, содержащей матрицу из смолы на полимерной основе в хроматографических условиях, достаточных для получения указанного пептида чистоты приблизительно 98-99%, предпочтительно чистоты 100%.

Таким образом, образуются нежелательные родственные продукту примеси, которые очищают с помощью последовательной обращенно-фазовой хроматографии с целью получения чистого гларгина. Гликозилированные (моно- и три-) примеси можно обнаружить только после первых стадий очистки. Вследствие этого особое внимание обращают на очистку гликозилированных примесей на 2-й стадии очистки ОФ-ВЭЖХ. Гликозилированные примеси, генерированные во время ферментации, полностью характеризуют и в конечном счете очищают из конечного продукта в максимальной степени.

Изобретение предусматривает в существенном аспекте способ очистки белка, причем способ, включающий стадии обработки данного белка на колонке для обращенно-фазовой хроматографии и элюции образца, который включает пептид, органическим растворителем в условиях, которые позволяют соединению связываться со смолой, и отмывание органического растворителя из смолы водным буферным раствором. Эффективное осуществление настоящего изобретения требует индивидуализации правильного сочетания хроматографической матрицы, предназначенной для использования, значения рН и ионной силы буфера для эффективной очистки.

Любое свойство хроматографического способа играет важную роль в получении требуемого белкового продукта. Подходящей матрицей, используемой в хроматографической колонке, является С8 Daisogel.

Согласно одному из аспектов изобретения выход очищенного продукта инсулина гларгина составляет 75%-80%, согласно другому аспекту изобретения выход очищенного продукта инсулина гларгина составляет 80%-85%, согласно еще одному аспекту изобретения выход очищенного продукта инсулина гларгина составляет 85%-90%, согласно еще одному аспекту изобретения выход очищенного продукта инсулина гларгина составляет 90%-95%, согласно еще одному следующему аспекту изобретения выход очищенного продукта инсулина гларгина составляет 95%-100%.

Согласно одному из аспектов изобретения очищенный продукт инсулина гларгина свободен или содержит практически минимальные количества гликозилированных побочных продуктов. Согласно одному из аспектов изобретения чистота очищенного продукта инсулина гларгина составляет по меньшей мере 96%, согласно другому аспекту изобретения чистота очищенного продукта инсулина гларгина составляет по меньшей мере 97%, согласно еще одному аспекту изобретения чистота очищенного продукта инсулина гларгина составляет по меньшей мере 98%, согласно еще одному аспекту изобретения чистота очищенного продукта инсулина гларгина составляет по меньшей мере 99%, согласно еще одному аспекту изобретения чистота очищенного продукта инсулина гларгина составляет 100%.

Краткое описание чертежей

Фиг.1: График % выхода относительно времени (час) трипсинизированного инсулина гларгина и реакция при различных концентрациях.

Фиг.2: Аналитическая хроматограмма реакции в различных точках времени до и после обработки ферментом.

Фиг.3: Профиль ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии) инсулина гларгина.

Фиг.4: Сравнение времени удерживания выделенных примесей и конечного продукта.

Фиг.5: Профиль обращенно-фазовой ВЭЖХ конечного продукта инсулина-гларгина.

Фиг.6: Профиль эксклюзионной ВЭЖХ конечного продукта инсулина-гларгина.

Фиг.7: Масс-спектры, полученные при электроспрей-ионизации гларгина, моногликозилированного (mGIG) и тригликозилированного (tGIG) инсулина гларгина.

Фиг.8: Масс-спектр, полученный при ионизации путем матричной лазерной десорбции моногликозилированного инсулина гларгина (mGIG).

Фиг.9: Масс-спектр, полученный при ионизации путем матричной лазерной десорбции тригликозилированного гларгина (tGIG).

Осуществление изобретения

Изобретение, также, конкретизировано с помощью следующих примеров. Однако данные примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем изобретения.

Примеры

Пример 1:

GIP-A представляет собой предшественник гларгина формулы Х-[В-цепь гларгина (В1-В30)]-Y-[А-цепь гларгина (А1-А21)], где Х представляет собой последовательность лидерного пептида, В-цепь представляет собой последовательность В-цепи гларгина В1-В30, Y представляет собой последовательность линкерного пептида между В-цепью и А-цепью, А-цепь представляет собой А-цепь гларгина. Последовательность может не иметь лидера или другого лидерного пептида. Линкерный пептид Y может быть любым из представленных в примере RR, RRDADDR. Предшественник GIP-A можно получить с помощью любой подходящей экспрессирующей системы, такой как Escherichia coli, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, клетки СНО (яичников китайского хомячка) и т.п.

Предшественник GIP-A клонируют в рамке считывания с сигнальным пептидом mat- в экспрессирующий вектор Pichia, pPIC9K. Штамм-хозяин Pichia pastoris GS115 трансформируют рекомбинантной плазмидой для получения клона, экспрессирующего предшественник гларгина. Секретируемый предшественник обрабатывают трипсином для получения гларгина и других родственных продукту примесей. Гларгин очищают с использованием обращенно-фазовой хроматографии.

SEQ ID 1 представляет собой последовательность предшественника гларгина, имеющую заданную молекулярную массу 6045 Да и приблизительно определенное значение pI 6,88. Последовательность имеет 159 нуклеотидов и 53 аминокислоты.

SEQ ID 2 представляет собой последовательность для экспрессии в Pichia pastoris с заданной молекулярной массой 6428,4 Да и приблизительно определенным значением pI 7,78. Последовательность имеет 171 нуклеотид и 57 аминокислот.

Предшественник гларгина GIP-A секретируется Pichia pastoris в культуральную среду. Бульон центрифугируют и клетки выделяют из супернатанта. Существует множество возможностей, доступных для захвата предшественника GIP-A, в том числе ионообменная хроматография и гидрофобная хроматография. В данном изобретении катионообменную хроматографию и HIC (хроматографию гидрофобного взаимодействия) используют для связывания GIP-A.

Пример 2:

Конструирование рекомбинантного вектора, несущего ген предшественника инсулина гларгина

Предшественник инсулина гларгина (GIP-A) клонируют в рамке считывания с сигнальным пептидом mat- в экспрессирующий вектор Pichia pastoris, pPIC9K. Рекомбинантную плазмиду используют для трансформации штамма-хозяина Pichia GS115, и секретируемый GIP-A представляет собой предшественник инсулина гларгина, который подвергают последующему процессу очистки для получения конечного продукта.

Трансформация Pichia-хозяина рекомбинантыми векторами, несущими ген предшественника инсулина гларгина:

Клон pPIC9K/IGP-A, несущий рекомбинантную плазмидную ДНК, разрезают с помощью BgI II и используют для трансформации электрокомпетентных клеток Р. pastoris GS115 (his4)-хозяев. Руководство фирмы Invitrogen представляет детальный протокол процедуры трансформации.

Скрининг многокопийных интегрантов:

Приблизительно 2000 трансформантов инокулируют бульон YPD в 384-луночных планшетах для микротитрования наряду с соответствующими контролями. Планшеты инкубируют при 30°С в течение 24 часов и затем делают отпечатки на чашках с агаром YPD, содержащих 0,5 мг/мл геницитина (G418). Отбирают 49 клонов, отпечатки которых затем делают на чашках с 1, 2 и 3 мг/мл G418 для второго цикла скрининга. Наконец, отбирают семь клонов, устойчивых к 1-3 мг/мл G418, и используют в исследованиях экспрессии.

Подтверждение интеграции гена в геном посредством ПЦР:

Геномную ДНК из отобранных рекомбинантных клонов Pichia подвергают ПЦР с использованием геноспецифических праймеров с целью подтверждения интеграции GIP-A в геном.

Исследования экспрессии Р. pastoris в малом масштабе

Исследования экспрессии Р. pastoris в малом масштабе осуществляют согласно протоколу, представленному в руководстве фирмы Invitrogen. Вкратце, клоны выращивают при 30°С в BMGY с последующей индукцией метанолом в BMMY при 24°С. Индукцию метанолом проводят в целом в течение 3 суток.

Пример 3:

Способ ферментации

Способ ферментации рекомбинантного инсулина-гларгина оптимизирован в лабораторном масштабе. Ниже представлено краткое описание способа.

Получение посевного материала

Среда для посевного материала содержит следующие ингредиенты: дрожжи как источник азота, сульфат аммония, глицерин, дигидрофосфат калия, гидрофосфат калия и D-биотин.

Для инокуляции посевной колбы используют один флакон из морозильной камеры. Флаконы оттаивают до комнатной температуры перед инокуляцией в стерильных условиях. Инокулюм распределяют в минимальной глицериновой среде (MGY) асептическим образом.

Количество, добавляемое в каждую колбу, определяют таким образом, чтобы исходная OD (оптическая плотность) 600 в предпосевной колбе составляла от 0,1 до 0,2. Затем колбы инкубируют в течение 20-24 час на качалке при 30°С со скоростью 230 об/мин.

Условия загрузки ферментера

Способ ферментации имеет две стадии, фазу роста (для накопления биомассы) с последующей фазой индукции. Продукт образуется и секретируется в бульон во время фазы подпитки загрузки метанолом. Ферментацию проводят в ферментере, стерилизуемом in situ. Ферментационная среда содержит ортофосфорную кислоту, сульфат калия, гидроксид калия, сульфат магния, сульфат кальция и глицерин. Данные химические вещества растворяют в питьевой воде в емкости ферментера и стерилизуют при установленной точке 121°С в течение определенного периода. Исходный раствор солей микроэлементов и биотина готовят отдельно, стерилизуют фильтрованием и добавляют асептически в ферментер после стерилизации среды и подведения рН до 5,0 гидроксидом аммония.

Способ продукции/ферментации принимают. Ферментер инокулируют 5% посевным инокулюмом из посевных качалочных колб. В начале ферментации устанавливают следующие параметры: рН 5,0, температура 30°С, DO2 30%.

Пример 4:

Родственные превращения и способ очистки

Предшественник инсулина гларгина, который получают при ферментации Pichia pastoris, подвергают очистке, стадии которой включенные в способ очистки, являются следующими.

Колонку, упакованную матрицей для быстрого потока SP Sepharose (GE Biosciences) уравновешивают 50 мМ уксусной кислотой. Бесклеточный супернатант с рН, доведенным до 3,8 с использованием ортофосфорной кислоты, нагружают на катионообменную колонку. Нагрузка на колонку составляет менее 50 г/л. Элюцию осуществляют с использованием ацетата аммония. Выделение на стадии составляет 95% при нагрузке менее 50 г/л.

Кристаллизация предшественника

Предшественник гларгина, захваченный из ферментационного бульона при использовании стадии катионообменной хроматографии, кристаллизуют с целью удаления окрашивания и для хранения. Кристаллизацию проводят так, что концентрация предшественника в начале кристаллизации составляет приблизительно 2-20 г/л, предпочтительно 8-14 г/л. Кристаллизацию проводят путем добавления ZnCl₂ и фенола с последующим доведением рН до 3,0-8,0, предпочтительно 3,5-5,5. Фенол может быть добавлен в концентрации 0,1-0,5% объема, собранного при элюции CIEX (катионообменная хроматография). 4% раствор ZnCl ₂ может быть добавлен в концентрации 3-15% объема, собранного при элюции CIEX. рН можно доводить, используя любые щелочи, предпочтительно NaOH или ТРИС. Процесс кристаллизации можно осуществить при температуре от 2 до 30°С, и суспензию хранят в течение некоторого времени, так чтобы кристаллы полностью сформировались. Кристаллы предшественника можно отделить от супернатанта либо центрифугированием, либо декантацией.

Пример 4а: берут 463 мл полученного элюата (ПЭ) (концентрация предшественника 13,8 г/л) и добавляют 2,315 мл фенола (0,5% объема ПЭ) после надлежащего оттаивания. После этого следует добавление 57,875 мл 4% раствора ZnCl ₂ (12,5% объема ПЭ). рН на данной стадии составляет 4,08, и его доводят до 4,8 добавлением 420 мл 2,5 н. NaOH. Исходный раствор поддерживают в условиях медленного перемешивания в течение 15 минут и затем переносят в холодное помещение (2-8°С), где держат в течение ночи. Затем всю смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 минут в центрифуге Beckman Coulter Avanti J-26 XP. Потеря супернатанта составляет 1,55%.

Пример 4b: берут 500 мл полученного элюата (концентрация предшественника 2,9 г/л) и добавляют 0,625 мл фенола (0,125% объема ПЭ) после надлежащего оттаивания. После этого следует добавление 15,625 мл 4% раствора ZnCl₂ (3,125% объема ПЭ). рН на данной стадии составляет 4,08, и его доводят до 4,8 добавлением 315 мл 2,5 н. NaOH. Исходный раствор поддерживают в условиях медленного перемешивания в течение 15 минут и затем переносят в холодное помещение (2-8°С), где держат в течение 5 часов. Затем супернатант отделяют центрифугированием. Потеря супернатанта составляет 4%.

Оптимизированные условия кристаллизации предшественника с выходом:

Элюат, полученный при элюции с SP-Sepharose, охлаждают до 20°±5°С, добавляют 5 мл (0,5% об./об.) фенола на каждый литр полученного элюата. Требуемое количество фенола добавляют в аликвоте объема, полученного при элюции, и его в конечном счете добавляют в основной резервуар для надлежащего перерастворения. После добавления фенола перемешивание продолжают в течение некоторого времени перед добавлением следующего реагента для надлежащего перерастворения. Затем добавляют 12,5% объема 40 г/л хлорида цинка (4% масс./об.) для индукции кристаллизации. Затем доводят рН до 4,8±0,1, используя 2,5 н. NaOH (приблизительно 85-90% объема SP-ПЭ). Данную смесь целиком перемешивают в течение 30 минут для обеспечения однородности и затем поддерживают при 2-8°С в течение по меньшей мере 8 часов до центрифугирования.

Основываясь на потере супернатанта, выход на данной стадии составляет приблизительно 90%.

Пример 5:

Трипсинизация

Гларгин получают из предшественника гларгина путем ферментной конверсии. Конверсию осуществляют посредством присутствия трипсина или ферментов, подобных трипсину, растительной, животной или микробной природы. Предпочтительно, когда реакцию проводят в присутствии смешивающихся с водой органических растворителей, например ДМСО, ДМФ, этанола, ацетона, ацетонитрила, этилацетата и т.п., особенно ДМФ и ДМСО. Предпочтительное соотношение органического растворителя составляет 0-65%, в частности приблизительно 40-60% реакционной смеси.

Соотношение органического растворителя определяют по растворимости исходных материалов, тенденции ферментов к денатурации и их активности гидролиза. Можно также использовать смеси органических растворителей. Добавление органических растворителей снижает концентрацию воды в реакционной смеси, приводя в результате к предупреждению гидролиза продукта, а также значительно повышает растворимость продуктов.

Концентрация предшественника, как правило, составляет приблизительно от 5 до 50 г/л. Реакцию проводят при рН приблизительно 5-12, предпочтительно рН приблизительно 8-10. Температура реакции составляет приблизительно 0-40°С, предпочтительно приблизительно 2-25°С. Трисгидроксиметиламинометан (ТРИС) или другие буферные системы используют при различных значениях ионной силы для поддержания требуемого значения рН. Время реакции варьирует, и на него влияют другие условия реакции. Реакцию продолжают до тех пор, пока чистота продукта не начинает снижаться вследствие гидролиза продукта. Она занимает, как правило, приблизительно от 30 минут до 24 часов и в большинстве случаев составляет приблизительно 4-10 часов.

Концентрацию фермента определяют в зависимости от концентрации субстратов и активности фермента. Например, кристаллический трипсин, имеющийся в продаже, используют предпочтительно в концентрации приблизительно 10-100 мг/л.

Пример 5а: 1 г предшественника гларгина растворяют в 1,5 мл 1 М раствора ТРИС.1 мл каждого из данных растворов отбирают в две пробирки, помеченные как образец А и образец В. К образцу А добавляют 3 мл воды и 166,6 мг ТРИС. К образцу В добавляют 2 мл ДМФ, 1 мл воды и 166,6 мг ТРИС. Каждый образец делят на четыре части подведением рН до четырех различных значений рН. Реакцию проводят во всех образцах посредством добавления коровьего трипсина в концентрации 50 мкг/мл. Исследованные условия приводят в таблице 1 следующим образом.

Таблица 1
Образец	Растворитель, %	рН	Концентрация ТРИС (М)	Концентрация трипсина (м кг/мл)	Концентрация предшественника (мг/мл)
А1	0%	9,2	0,5	50	15,5
А2		8,2
A3		7,0
А4		6,2
В1	50%	8,9
В2		8,0
В3		7,0
В4		6,3

Все условия дают продукт в различных соотношениях. Образец В1 дает наилучшую конверсию на уровне приблизительно 40%, тогда как условия А1, А2, A3 и А4 дают уровень конверсии меньше чем 15%. Уровень конверсии в гларгин в других образцах лежит в интервале от 15% до 40%.

Пример 5b: 1,6 г предшественника гларгина растворяют в 2 мл 1 М раствора ТРИС. 1 мл каждого из данных растворов отбирают в три пробирки, помеченные образец А, образец В и образец С. К образцу А добавляют 1,8 мл воды, 1,2 мл ДМФ и 161 мг ТРИС. К образцу В добавляют 0,6 мл воды, 2,4 мл ДМФ и 161 мг ТРИС. К образцу С добавляют 1 мл воды, 2,0 мл ДМФ и 161 мг ТРИС. Оба образца, А и В, делят на четыре части, а образец С - на две части подведением до различных значений рН. Реакцию проводят во всех образцах посредством добавления коровьего трипсина в концентрации 50 мкг/мл. Исследованные условия приводят в таблице 2 следующим образом.

Все условия дают продукт в различных соотношениях. Образец С1 и С2 дает наилучшую конверсию на уровне приблизительно 40%, тогда как другие условия дают уровень конверсии меньше чем 15%.

Пример 5 с: 1,5 г предшественника гларгина растворяют в 2 мл 1 М раствора ТРИС. 0,75 мл каждого из данных растворов отбирают в три пробирки, помеченные образец А, образец В и образец С. К образцу А добавляют 0,75 мл воды, 1,5 мл этанола и 106 мг ТРИС. К образцу В добавляют 0,75 мл воды, 1,5 мл ДМФ и 106 мг ТРИС. К образцу С добавляют 0,75 мл воды, 1,5 мл ДМФ и 106 мг ТРИС. Оба образца, А и В, делят на две части подведением до двух различных значений рН. Образец С доводят до рН 9,0. Реакцию проводят во всех образцах посредством добавления коровьего трипсина в концентрации 50 мкг/мл. Исследованные условия приводят в таблице 3 следующим образом.

Все условия дают продукт в различных соотношениях. Образец С 1 дает наилучшую конверсию на уровне приблизительно 40%, за ним следует В1 (~30%), тогда как другие условия дают уровень конверсии меньше чем 15%.

Пример 5d: 1,5 г предшественника гларгина растворяют в 2 мл 1 М раствора ТРИС. Берут 0,75 мл раствора и добавляют к нему 0,75 мл воды, 1,5 мл этанола и 106 мг ТРИС. Затем рН доводят до 9,0. Затем раствор делят на два образца - А и В. Для образца А реакцию проводят при комнатной температуре (20-25°С), тогда как для образца В реакцию осуществляют при 2-8°С. Реакцию начинают добавлением коровьего трипсина в концентрации 50 м кг/мл.

Оба образца дают уровень конверсии приблизительно 40%. Реакция при более низкой температуре (образец В) продолжается дольше, но демонстрирует несколько более высокий выход.

Пример 5е: 1 г предшественника гларгина растворяют в 1 мл 1 М раствора ТРИС. 0,75 мл каждого из данных растворов отбирают в две пробирки, помеченные как образец А и образец В. К образцу А добавляют 0,75 мл воды, 1,5 мл ДМФ и 130 мг ТРИС. К образцу В добавляют 0,75 мл воды, 1,5 мл ДМСО и 130 мг ТРИС. Оба образца, А и В, делят на две части после подведения рН до 8,7. Реакцию проводят во всех четырех образцах добавлением коровьего трипсина в концентрации 50 мкг/мл. Реакции, каждую в одной аликвоте из образцов А и В, проводят при 2-8°С. Исследованные условия приводят в таблице 4 следующим образом.

Все образцы дают близкие уровни конверсии (-40%). Реакция в образцах при комнатной температуре проходит в течение одного часа, тогда как реакции в холодном помещении идут более 5-6 часов.

Пример 5f: 2 г предшественника гларгина растворяют в растворе, содержащем 0,5 г ТРИС, 2 мл воды и 2 мл ДМФ. Из данного раствора получают 6 образцов по 3,08 мл, так что каждый из них содержит 50% ДМФ и 0,5 М ТРИС, при рН 8,7. Концентрация предшественника варьирует среди данных образцов от 10 г/л до 60 г/л. Реакцию начинают в каждом образце добавлением 5 мг трипсина/г предшественника. Все образцы находятся при 2-8°С во время реакции. Исследованные условия приводят в таблице 5 следующим образом.

Все образцы показывают конверсию, но образцы с более низкой концентрацией дают ускоренную реакцию. Условие В считают наилучшим. Максимальный выход, полученный в каждом случае, составляет приблизительно 40-45%. Результаты представляют на Фиг.1.

Оптимизированные условия процесса с выходом и чистотой:

Пример 5g:

Влажные кристаллы предшественника хранят при -20°С в камере глубокого замораживания и вынимают перед растворением. Данные кристаллы растворяют введением их в раствор ТРИС (ТРИС - 50% масс./масс. кристаллов предшественника и воды - 2 л/кг кристаллов предшественника) в условиях перемешивания. Например, 1 кг кристаллов предшественника добавляют в 2 л раствора ТРИС, содержащего 500 г ТРИС. После этого следует добавление ДМФ (2 л/кг кристаллов предшественника). Всю смесь полностью солюбилизируют, и данный раствор обрабатывают как тест-раствор. Полученный в результате тест-раствор анализируют на содержание продукта, используя способ С18 симметричной аналитической ОФ-ВЭЖХ.

В соответствии с содержанием продукта в тест-растворе готовят контрольный раствор для реакции трипсинизации так, чтобы концентрация рекомбинантного предшественника инсулина гларгина составляла 10 г/л реакционной смеси. Для получения контрольного раствора добавляют необходимое количество ТРИС в воде для поддержания конечной концентрации ТРИС в реакционной смеси 500 мМ. Затем следует добавление ДМФ так, чтобы конечная концентрация ДМФ составляла 50%. Затем температуру данного раствора снижают до 6°С±2°С и затем доводят рН до 8,7 с помощью ледяной уксусной кислоты (приблизительно 2% от общего объема) в условиях слабого перемешивания. Данный раствор обрабатывают как контрольный раствор.

Реакционную смесь поддерживают при 6°С±2°С при очень низкой скорости мешалки. После окончания перемешивания добавляют 50 мг/л трипсина для инициации реакции. Ферментная реакция начинается после того, как трипсин хорошо растворится при перемешивании.

Ферментативную реакцию проводят при 6°С±2°С при очень низкой скорости мешалки. Развитие реакции мониторируют проверкой каждый час доли рекомбинантного инсулина гларгина и непрореагировавшего предшественника, используя способ С18 симметричной аналитической ОФ-ВЭЖХ. Ферментативная реакция, как правило, завершается меньше чем за 10 часов. Реакцию останавливают доведением рН реакционной смеси до 5,0, используя ледяную уксусную кислоту, когда доля непрореагировавшего предшественника составляет меньше чем 5%. Выход реакции, как ожидают, составляет приблизительно 40% рекомбинантного инсулина гларгина, и полученная чистота составляет приблизительно 35-50%.

Аналитическая хроматограмма реакции в различных точках времени представлена на Фиг.2 и 3.

Пример 6: Очистка с помощью ОФ-ВЭЖХ:

Пример 6а:

Предшественник инсулина гларгина, полученный при ферментации Pichia pastoris, подвергают очистке со следующими стадиями, включенными в процесс:

Колонку, упакованную матрицей для быстрого потока SP Sepharose (GE Biosciences), уравновешивают 50 мМ уксусной кислотой. Бесклеточный супернатант, подведенный до рН 3,8 с использованием ортофосфорной кислоты, нагружают на катионообменную колонку. Нагрузка на колонку составляет менее 50 г/л. Элюцию осуществляют с использованием ацетата аммония. Выделение на стадии составляет 95% при нагрузке менее 50 г/л. Объем, полученный при элюции, кристаллизуют. Кристаллы используют для трипсинизации. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 250 мМ уксусной кислоте (буфер А). Нагрузку в конце трипсинизации проводят с разведением 1:5 с использованием воды. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 75% с чистотой 94,5% при нагрузке менее 10 г/л. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 200 мМ ацетате натрия рН 5,0 (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с таким разведением, чтобы он содержал 10% ацетонитрил. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 80% с чистотой 98,5% и содержанием гликозилированных примесей 0,29%. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 6% этанолом (буфер В) в 50 мМ уксусной кислоте (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с разведением 1:3 водой. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 85% с чистотой 99,4% при нагрузке 35 г/л.

Пример 6b:

Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 250 мМ уксусной кислоте (буфер А). Нагрузку в конце трипсинизации проводят с разведением 1:5 с использованием воды. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 75% с чистотой 94,5% при нагрузке менее 10 г/л. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 200 мМ ацетате натрия рН 5,0 (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с таким разведением, чтобы она содержала 10% ацетонитрил. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 80% с чистотой 98,5% и содержанием гликозилированных примесей 0,29%. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 6% этанолом (буфер В) в 10 мМ лимонной кислоте (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с разведением 1:3 водой. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 79,2% с чистотой 98,5% при нагрузке 35 г/л.

Пример 6с:

Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 250 мМ уксусной кислоте (буфер А). Нагрузку в конце трипсинизации проводят с разведением 1:5 с использованием воды. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 75% с чистотой 94,5% при нагрузке менее 10 г/л. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 100 мМ Tris+20 мМ CaCl₂, рН 8,5 (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с таким разведением, чтобы она содержала 10% ацетонитрил. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 71% с чистотой 97,4% и содержанием гликозилированных примесей 0,22%. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 6% этанолом (буфер В) в 10 мМ лимонной кислоте (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с разведением 1:3 водой. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 75,0% с чистотой 98,0% при нагрузке 35 г/л.

Пример 6d:

Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 250 мМ уксусной кислоте (буфер А). Нагрузку в конце трипсинизации проводят с разведением 1:5 с использованием воды. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 75% с чистотой 94,5% при нагрузке менее 10 г/л. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 100 мМ ацетате аммония, рН 5,0 (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с таким разведением, чтобы она содержала 10% ацетонитрил. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 60,7% с чистотой 98,0% и содержанием гликозилированных примесей 0,91%. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 6% этанолом (буфер В) в 10 мМ лимонной кислоте (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с разведением 1:3 водой. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 75,0% с чистотой 98,5% при нагрузке 35 г/л.

Пример 6е:

Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 250 мМ уксусной кислоте (буфер А). Нагрузку в конце трипсинизации проводят с разведением 1:5 с использованием воды. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 75% с чистотой 94,5% при нагрузке менее 10 г/л. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 20 мМ перхлорной кислоте, рН 3,0 (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с таким разведением, чтобы она содержала 10% ацетонитрил. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 37,4% с чистотой 96,2% и содержанием гликозилированных примесей 0,28%. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 6% этанолом (буфер В) в 10 мМ лимонной кислоте (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с разведением 1:3 водой. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 70,0% с чистотой 97,0% при нагрузке 35 г/л.

Пример 6f:

Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 250 мМ уксусной кислоте (буфер А). Нагрузку в конце трипсинизации проводят с разведением 1:5 с использованием воды. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 75% с чистотой 94,5% при нагрузке менее 10 г/л. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 10% ацетонитрилом (буфер В) в 100 мМ боратном буфере, рН 8,5 (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с таким разведением, чтобы она содержала 10% ацетонитрил. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 79,4% с чистотой 98,3% и содержанием гликозилированных примесей 0,11%. Колонку, упакованную смолой для ОФ-ВЭЖХ (С8 Daisogel, поры 120 А, размер частиц 10 мкм), уравновешивают 6% этанолом (буфер В) в 10 мМ лимонной кислоте (буфер А). Проводят нагрузку ОФ элюата, полученного на предшествующей стадии, с разведением 1:3 водой. Линейный градиент буфера В используют для элюции очищенного гларгина при выходе 75,0% с чистотой 98,8% при нагрузке 35 г/л.

Пример 7:

Заключительное осаждение:

Гларгин, очищенный на различных стадиях обращенно-фазовой хроматографии, осаждают добавлением буфера на основе лимонной кислоты и раствора ZnCl ₂ и изменением рН. (Буфер на основе лимонной кислоты содержит 15,4 г/л лимонной кислоты (безводной), 90 г/л буфера на основе ортофосфатадинатрия (безводного), рН доводят до 6,3+0,1, ортофосфорной кислотой). Осаждение проводят при рН, лежащем в интервале 4,0-10,0, предпочтительно 6,0-8,0. Предпочтительно, когда концентрация продукта составляет 2-20 г/л. После осаждения продукт отделяют от прозрачного супернатанта либо центрифугированием, либо декантированием супернатанта, не нарушая лежащий осадок. Осадок, полученный таким образом, промывают охлажденной водой для удаления присутствующих несвязанных ионов.

Выход по всему способу составляет 85-90%, и чистота продукта составляет приблизительно 99%.

Пример 8:

Конечную суспензию декантируют после осаждения и суспензию асептически переносят в поддоны установки для лиофильной сушки. Затем суспензию замораживают для получения сухого порошка инсулина гларгина, который можно хранить и использовать в препаратах далее.

Пример 9:

Выделение и характеризация гликозилированной примеси:

Выделение гликоформ гларгина из активного фармацевтического ингредиента, полученного в лаборатории:

Пример 9а:

Для характеризации гликоформ примесей mGIG (моногликозилированный инсулин гларгин) и tGIG (тригликозилированный инсулин гларгин) выделяют полупрепаративной обращенно-фазовой хроматографией. Способ идентификации примесей осуществляют на хроматографической системе Agilent 1100 (СА, USA) с использованием колонки Prochrome С 18 (250×8,0 мм). Растворителями подвижной фазы являются водная 0,1% ТФА (трифторуксусная кислота) (А) и 0,1% ТФА в ацетонитриле (В). Примеси гларгина элюируют, используя программу линейного градиента: 0 мин 25% В; 0-10 мин 27% В; 10-15 мин 29% В; 15-21 мин 30% В; 21-27 мин 33% В и 27-35 мин 25% В при постоянной скорости потока 1,5 мл.мин^-1. Объем введения поддерживают на уровне 20 мкл и температуру колонки поддерживают на уровне 40°С. Элюаты мониторируют при длине волны 214 нм. Хроматографические пики, соответствующие гликозилированным примесям, анализируют в режиме реального времени с помощью масс-спектрометра с ионной ловушкой Agilent 1100 серии LCMSD SL (Agilent Technologies, USA). Масс-спектрометр работает в режиме ESI (электроспрей ионизации). Давление распыляющего газа поддерживают на уровне 0,41 МПа (60 psi), сушащий газ - на уровне 12,0 л.мин^-1 и температуру сушки поддерживают на уровне 350°С. Масс-спектр, полученный с помощью электроспрей ионизации, регистрируют как MS в интервале масс 600-2200 m/z.

Пики, соответствующие mGIG и tGIG, отбирают вручную. Поскольку mGIG (1,0%) и tGIG (0,3%) наблюдают в препаратах на следовом уровне, активный фармацевтический ингредиент гларгин (API), соответствующий данному изобретению, используют в концентрации 100 мг.мл^-1 для очистки примесей, сопутствующих способу.

Характеризация конечного очищенного продукта:

Пример 9b:

Профили ОФ-ВЭЖХ и эксклюзионной ВЭЖХ конечного продукта:

Профиль ОФ-ВЭЖХ и профиль эксклюзионной ВЭЖХ полученного конечного белкового продукта представлены на Фиг.5 и Фиг.6.

Пример 9с:

Масс-спектры электроспрей ионизации гларгина, моногликозилированного инсулина гларгина (mGIG) и триликозилированного инсулина гларгина (tGIG) представлены на Фиг.7, Фиг.8 и Фиг.9 соответственно.

Образец	Время	Площадь	Высота	Ширина	Площадь, %	Симметрия
Загрузка No.1	18,192	190417	399,4	0,9616	100	0,881

Интродукция моносахаридного звена в гларгин уменьшает время удерживания вследствие повышения полярности и увеличения в единицах массы на 162 единиц; аналогично интродукция трех моносахаридов далее повышает полярность и увеличивает массу на 486 единиц. Молекулярные массы гликоформ получают путем деконволюции множества заряженных пиков в ESI-MS (таблица 6).

Таблица 6
Сравнения молекулярной массы, полученной способами электроспрей ионизации и ионизации путем лазерной десорбции с использованием матрицы
	Молекулярная масса
	ESI	MALDI
Инсулин гларгин	6063,2	6063,4
mGIG	6225,7	6225,6
tGIG	6549,4	6549,8

Масс-спектры MALDI, полученные для mGIG и tGIG, показывают молекулярные массы 6225,6 и 6549,8, соответственно. Данные по молекулярной массе, полученные на mGIG и tGIG, согласуются с данными, полученными с помощью ESI-MS. Разница молекулярных масс между IG, mGIG и tGIG показывает кратность 162 единицам массы, позволяя предположить, что гликаны ковалентно присоединены к гларгину.

Фиг.8. Масс-спектр, полученный ионизацией путем матричной лазерной десорбции моногликозилированного инсулина гларгина (mGIG)

Эксперименты по восстановлению и алкилированию осуществляют для идентификации цепи, в которой имеет место гликозилирование. Способ стандартизуют, используя гларгин в качестве стандарта. 1,1 мг гларгина растворяют в 500 мкл 8 М гуанидина HCl, 0,1 М ТРИС и 1 мМ буфере ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты), поддерживаемом при рН 9,0. К смеси добавляют 10 мкл 1 М дитиотрейтола (DTT). Содержимое перемешивают и инкубируют при 37°С в течение 2 часов. Инкубируемые образцы переносят в условия комнатной температуры и добавляют 10 мкл йодоацетамида. Образцы закрывают алюминиевой фольгой для защиты отсвета, инкубируют при 37°С в течение двух часов и анализируют с помощью LCMS (жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии). Аналогичным образом восстанавливают и алкилируют mGIG и tGIG с целью идентификации гликозилирования (таблица 7).

Пример 9d:

Картирование пептида:

Гликоформы гларгина подвергают ферментному разложению для идентификации положения аминокислоты, в котором имеет место гликозилирование. 0,65 мг нативного гларгина растворяют в 200 мкл 1 М ТРИС (рН 9,0). К нему добавляют 50 мкл свежеприготовленного раствора 1 мг.мл^-1 протеазы V 8 (Glu-C) и инкубируют при 37°С в течение двух часов. Продукт трипсинового разложения IG, mGIG и tGIG разделяют на колонке С18 250×4,6 мм, 5 мк, 300° (Waters; symmetry) при скорости потока 0,8 мл.мин ^-1. Температуру колонки поддерживают на уровне 40°С. Используют следующий градиент: 0-60 мин, 5-80% В, 60-65 мин, 80-5% В. Растворитель А=0,1% водная ТФА и растворитель В=ацетонитрил. Вводят 20 мкл образца и элюированные пики мониторируют при длине волны 220 нм. Образцы анализируют в режиме реального времени на приборе Agilent 1100 LCMS для анализа фрагментов GLU-C. Проводят сравнительное исследование IG, mGIG и tGIG для обнаружения разницы во времени удерживания и молекулярных масс (таблица 8).

Краткое изложение сущности изобретения

Целью настоящего изобретения является создание способа получения и очистки рекомбинантного белка, который кодирует полипептид, проявляющий иммунологическую и биологическую активность зрелого инсулина гларгина. Показано, что указанный очищенный белок обладает всеми физиологическими, иммунологическими и биохимическими свойствами, аналогичными зрелому инсулину гларгину.

Другим предпочтительным аспектом настоящего изобретения является характеризация гликозилированных примесей гларгина, полученных в конечном продукте.

Конечной и наиболее важной целью настоящего изобретения является получение белка инсулина гларгина в чистой форме. Изобретение, таким образом, дает возможность крупномасштабного получения и последующей очистки инсулина гларгина.

Вследствие этого объект настоящего изобретения состоит из усовершенствованного способа получения инсулина гларгина в чистой форме.

Согласно первому аспекту изобретения рекомбинантный способ получения инсулина гларгина предусматривает:

(а) Получение последовательности ДНК, способной контролировать образование микроорганизмом-хозяином белка, обладающего активностью инсулина гларгина;

(b) Клонирование указанной последовательности ДНК в вектор, способный к переносу и репликации в микроорганизме-хозяине, причем данный вектор содержит функциональные элементы для последовательности ДНК;

(c) Перенос вектора, содержащего последовательность ДНК и функциональные элементы, в микроорганизм хозяин, способный экспрессировать белок инсулина гларгина;

(d) Культивирование микроорганизма в условиях, подходящих для амплификации вектора и экспрессии белка;

(e) Сбор белка.

Второй аспект изобретения описывает способ конструирования рекомбинантного вектора, несущего ген, представляющий интерес, включающий стадии клонирования гена предшественника инсулина гларгина в рамке считывания с сигнальным пептидом в подходящий экспрессирующий вектор, трансформации клетки-хозяина вектором, несущим рекомбинантный ген, представляющий интерес, скрининга многокопийных интегрантов, селекции рекомбинантных клонов с удачной интеграцией предшественника инсулина гларгина в геном.

Третий аспект изобретения относится к маломасштабной экспрессии предшественника инсулина гларгина для анализа ВЭЖХ с целью определения уровня экспрессии требуемого белка, представляющего интерес.

Четвертый аспект изобретения относится к процессу ферментации, включающему стадии выращивания рекомбинантных клеток в среде для роста, причем клетки представляют собой микроорганизм или клеточную культуру, трансформированную экспрессирующим вектором, содержащим ДНК, кодирующую требуемый белок, который в случае данного изобретения представляет собой инсулин гларгин.

Пятый аспект изобретения направлен на кристаллизацию продукта инсулина гларгина, полученного после ферментации.

Шестой аспект изобретения относится к процессу трипсинизации. Гларгин можно получить из предшественника гларгина путем ферментной конверсии. Конверсию осуществляют в присутствии трипсина или подобных трипсину ферментов растительной, животной или микробной природы.

Существенный аспект настоящего изобретения относится к процессам и процедурам, используемым для очистки выделенного белка, имеющего биологические активности, аналогичные активностям природного белка инсулина гларгина, и, точнее, к способам, в которых используют ОФ-ВЭЖХ или другие хроматографические способы отделения активной пептидной субстанции от других субстанций, которые не имеют данной активности и, таким образом, их можно считать примесями.

Наиболее предпочтительный аспект изобретения относится к идентификации различных гликоформ аналогов инсулина, более конкретно инсулина гларгина, с помощью химических способов, связанных с методиками масс-спектрометрии, такими как электроспрей ионизация и ионизация путем матричной лазерной десорбции, предназначенных для идентификации. Таким образом, изобретение обеспечит избирательную очистку продукта от вышеуказанных примесей посредством оптимизированных последующих способов очистки, обусловленную более ясным пониманием природы примесей, присутствующих в конечном продукте.

Дополнительные цели и преимущества изобретения будут приведены отчасти в описании, которое следует, и отчасти будут очевидны из описания или могут быть выяснены из практического осуществления изобретения. Цели и преимущества могут быть реализованы и достигнуты с помощью оборудования и комбинаций, конкретно указанных в прилагаемой формуле изобретения. Настоящее изобретение относится к способу получения очищенного, биологически активного гетерологичного белка.

Сопровождающие чертежи, которые включены в данном контексте и составляют часть данной заявки, иллюстрируют различные признаки, используемые в данном изобретении, и, вместе с описанием, служат для объяснения принципов изобретения.