рекомбинантная псевдоаденовирусная частица на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, продуцирующая гемагглютинин вируса гриппа штамма a/brisbane/59/2007(h1n1) и способ ее использования

Формула изобретения

1. Рекомбинантная псевдоаденовирусная частица на основе генома аденовируса человека 5 серотипа для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа А субтипов Н1 и Н5, содержащая экспрессирующую кассету со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа,отличающаяся тем, что в качестве гена гемагглютинина вируса гриппа используют ген гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) SEQ ID NO:2, с обеспечением экспрессии гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1).

2. Рекомбинантная псевдоаденовирусная частица по пункту 1, отличающаяся тем, что ген гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) с оптимизированной нуклеотидной последовательностью клонирован в экспрессирующую кассету под контролем промотора и содержащую сигнал полиаденилирования.

3. Рекомбинантная псевдоаденовирусная частица по пункту 2, отличающаяся тем, что промотором является промотор цитомегаловируса.

4. Рекомбинантная псевдоаденовирусная частица по пункту 2, отличающаяся тем, что сигналом полиаденилирования является SV40.

5. Рекомбинантная псевдоаденовирусная частица по пункту 1, отличающаяся тем, что экспрессирующая кассета расположена в области делеции Е1 генома аденовируса человека 5 серотипа.

6. Способ использования рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы по пункту 1 на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, продуцирующей гемагглютинин вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) путем ее введения в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа А субтипов Н1 и Н5.

Описание изобретения к патенту

Рекомбинантная псевдоаденовирусная частица на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, продуцирующая гемагглютинин вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), способ ее использования для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа А субтипов Н1 и Н5.

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии и здравоохранения и касается рекомбинантных векторов, которые могут быть использованы в фармацевтической промышленности для производства вакцинных препаратов, в частности для противогриппозных вакцин.

Предшествующий уровень развития

Вакцинопрофилактика гриппа человека является важнейшим звеном в осуществлении противоэпидемических мероприятий для снижения уровня заболеваемости среди людей во время сезонных вспышек заболевания. Эпидемический мониторинг за циркуляцией вирусов гриппа осуществляется ВОЗ (Всемирной Организацией Здравоохранения), которая объявляет штаммы, рекомендуемые для включения в состав сезонных вакцин от гриппа на определенных территориях (Ресурс доступен: www.who.int).

Для изготовления вакцины требуются наличие высокоиммуногенных антигенов в ее составе. Как правило, аттенуация или инактивация штамма при производстве классических вакцин снижает его иммуногенность. Поэтому на современном этапе развития биотехнологии гораздо более технологически и иммунобиологически эффективным является изготовление генетических вакцин.

На сегодняшний день все антигены, входящие в состав вакцин, по способу получения можно разделить на две основные группы - нативные и рекомбинантные, причем последние в связи с развитием генетической инженерии и биотехнологии начинают вытеснять антигены, полученные классическими методами. Для получения антигенов классическими методами необходимо изначально иметь выделенный от больных гриппом штамм вируса гриппа.

Основой любого вакцинного препарата служат различные антигены патогенов, обязательно обладающие иммуногенными свойствами. Основным специфическим иммуногеном вируса гриппа является его гемагглютинин, это учитывается при разработке иммунобиологических препаратов против гриппа.

Для вакцинопрофилактики гриппа при разработке вакцинных препаратов важным является выделение эпидемически актуального антигенного варианта возбудителя и получение из него производственного штамма. Одним из таких эпидемически значимых штаммов является штамм вируса гриппа А А/Брисбен/59/07, способный вызвать сезонные вспышки гриппа среди людей, был рекомендован ВОЗ для включения в состав вакцин.

На сегодняшний день известен вакцинный штамм вируса гриппа, полученный на основе штамма А/Брисбен/59/07 и предназначенный для производства живой интраназальной противогриппозной вакцины (Патент РФ № 2416641). Данный штамм А/17/Брисбен/07/28 (H1N1) - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Брисбен/59/07 (H1N1) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - донором аттенуации, безвредным для людей. Штамм А/17/Брисбен/07/28 (H1N1) размножается в развивающихся куриных эмбрионах. Штамм характеризуется температурочувствительностью и холодоадаптированностью. Реассортант унаследовал гены, кодирующие поверхностные антигены вируса гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), от эпидемического родительского вируса и шесть генов, кодирующих внутренние негликозилированные белки, от донора аттенуации. Работы по созданию нового вакцинного штамма на основе А/Брисбен/59/07 были обоснованы невозможностью предшествующего его варианта А/17/Новая Каледония/99/145(H1N1) образовывать защиту против вирусов, подобных А/Брисбен/59/07(H1N1). Основными недостатками полученного штамма является необходимость наращивания в куриных эмбрионах, что влечет за собой малую производительность и наличие в препаратах аллергенного белка яйца - овальбумина.

Для решения проблем, связанных с нативными штаммами различных микроорганизмов, предназначенных для производства вакцин, перспективно направление по использованию безопасных векторов, экспрессирующих гены антигенов возбудителя (Abdulhaqq S.A., Weiner D.B. DNA Vaccines: developing new strategies to enhance immune responses, 2008, № 42, с.219-232 - Вакцины: разработка новых стратегий для усиления иммунного ответа); (Zaia J.A., The status of gene vectors for the treatment of diabetes, Cell Biochem. Biophys, 2007, № 48 (2-3), с.183-90. - Статус генетических векторов для лечения сахарного диабета). Одними из наиболее безопасных для организма признаны векторы, сконструированные на основе аденовируса человека (Van Kampen K.R. et al., Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans, Vaccine, 2005, № 23(8), с.1029-36 - Безопасность и иммуногенность аденовекторных назальных и накожных противогриппозных вакцин у человека).

Рекомбинантные аденовирусные векторы обладают следующими полезными характеристиками: не патогенны, так как из их генома удалены области, ответственные за патогенность, способны трансдуцировать как делящиеся, так и постмитотические клетки, ДНК аденовируса остается в экстрахромосомной форме, способны к размножению только в специальных линиях клеток in vitro, выводятся из организма в течение 4-5 недель, индуцируют как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ, процесс получения нового рекомбинантного аденовируса занимает всего несколько недель, они обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого гена в клетке-мишени.

На сегодняшний день известен аденовирусный вектор, экспрессирующий рекомбинантные гемагглютинины вируса гриппа, (Заявка на патент WO № 2008/157419). Данная конструкция выбрана автором за прототип, как наиболее близкая к изобретению (прототип).

В связи с тем, что на дату приоритета заявки ничего не было известно о нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), нуклеотидная последовательность его гена гемагглютинина не могла быть использована для конструирования рекомбинантных аденовирусных частиц. Соответственно, заявители не имели возможности создать аденовирусную конструкцию с охарактеризованными культурально-морфологическими свойствами, уровнем экспрессии, иммуногенными и протективными свойствами. Это является существенным недостатком заявленной конструкции, так как не позволяет использовать ее для индукции протективного иммунитета к вирусам гриппа А субтипа Н1, в частности к штамму A/Brisbane/59/2007(H1N1), а также вирусу гриппа А субтипа Н5, что препятствует созданию противогриппозных вакцинных препаратов, индуцирующих специфический иммунитет к вирусам гриппа субтипов Н1 и Н5 на ее основе.

Раскрытие изобретения

Техническая задача заявляемого изобретения направлена на создание рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, продуцирующей рекомбинантный гемагглютинин вируса гриппа, способной обеспечивать усиленную экспрессию рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), позволяющую использовать ее для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа А субтипов Н1 и Н5.

Техническая задача решается за счет того, что создают рекомбинантную псевдоаденовирусную частицу на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, содержащую экспрессирующую кассету со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа, при этом в качестве гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) используют ген гемагглютинина с предварительно оптимизированной для экспрессии в клетках человека нуклеотидной последовательностью, с обеспечением повышенной экспрессии гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1). Причем оптимизированной нуклеотидной последовательностью гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) является SEQ ID NO:2, а ген гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) с оптимизированной нуклеотидной последовательностью клонирован в экспрессирующую кассету под контролем промотора и содержит сигнал полиаденилирования, причем промотором является промотор цитомегаловируса, а сигналом полиаденилирования является SV40. Экспрессирующая кассета в данном техническом решении расположена в области делеции Е1 генома аденовируса человека 5 серотипа. Способ использования рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, продуцирующей гемагглютинин вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), заключается во введении созданной рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа А субтипов Н1 и Н5.

Перечень фигур

На фиг.1 представлены:

SEQ ID NO:1 - неоптимизированная нуклеотидная последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1);

SEQ ID NO:2 - оптимизированная для экспрессии в клетках человека нуклеотидная последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1);

Protein - аминокислотная последовательность, кодируемая нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.

На фиг.2 представлена схема экспрессирующей кассеты рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы с геном гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1).

На фиг.3 изображена электрофореграмма ПЦР - анализов ДНК созданной рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе аденовируса человека 5 серотипа со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) (SEQ ID NO:2).

На фиг.4 изображены результаты иммуноблот-анализа. Дорожки обозначают результат анализа с лизатом клеток 293 линии.

На фиг.5 представлена диаграмма, столбцы которой показывают уровень антигемагглютинирующих антител, определенных в РТГА, к вирусу гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1).

На фиг.6 представлены кривые выживаемости иммунизированных мышей после заражения летальной дозой вируса гриппа А штаммов:

Графики 1-4 - A/Brisbane/59/2007(H1N1),

График 5 - A/USSR/90/77(H1N1),

График 6 - A/Mallard Duck/PensyIvania/10218/84(H5N2).

На фиг.7 представлена неоптимизированная нуклеотидная последовательность гена гемагглютинина A/Brisbane/59/2007(H1N1).

На фиг.8 представлена оптимизированная нуклеотидная последовательность гена гемагглютинина A/Brisbane/59/2007(H1N1).

На фиг.9 представлена аминокислотная последовательность гена гемагглютинина A/Brisbane/59/2007(H1N1).

Общеизвестно, что генетический код обладает вырожденностью, то есть одна аминокислота может кодироваться от одного до шести различных триплетов (кодонов) из разных нуклеотидов, которые, как правило, имеют различие лишь в последнем нуклеотиде (Дубинин Н.П., Общая генетика, М., 1970, с.204-207). Каждому такому кодону соответствует единственная тРНК, которая в процессе синтеза белка осуществляет доставку соответствующей аминокислоты к рибосоме. Однако у различных организмов набор тРНК различается, причем наблюдается предпочтительное использование одного из нескольких кодонов, кодирующих одну и ту же аминокислоту. Данные по частоте использования кодонов у различных организмов общедоступны (например, ресурс www.kazusa.or.jp).

Исходя из вышеописанных биологических особенностей транскрипции белка в организмах, автором было решено в нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина заменить отдельные нуклеотиды в кодонах, не влекущие за собой замены самой аминокислоты, с учетом предпочтительности использования кодонов тРНК у человека, то есть использовать ген гемагглютинина с предварительно оптимизированной для экспрессии в клетках человека нуклеотидной последовательностью, что, в конечном итоге, привело к усилению экспрессии целевого гена при введении вектора со вставкой полученного гена гемагглютинина в организм человека.

Для решения поставленной технической задачи необходимо:

1). Оптимизировать нуклеотидную последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) для повышения экспрессии данного гена в клетках человека;

2). Сконструировать рекомбинантную псевдоаденовирусную частицу с целевым трансгеном путем встраивания полученного оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) в аденовирус человека 5 серотипа;

3) Показать культурально-морфологические особенности полученных рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц;

4) Показать улучшение экспрессии оптимизированного гена гемагглютинина in vitro;

5) Показать улучшенные иммуногенность и протективные свойства полученных по заявленному изобретению рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе аденовируса человека 5 серотипа к гомологичному вирусу гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) и гетерологичным штаммам A/USSR/90/77(H1N1) и A/Mallard Duck/Pensylvania/10218/84(H5N2), и соответственно, использование их для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа А субтипов Н1 и Н5.

Представленные ниже примеры подтверждают решение поставленной технической задачи.

Примеры осуществления изобретения

Пример 1.

В данном примере показан ход конструирования рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1).

На первом этапе для улучшения экспрессии трансгена рекомбинантной псевдоаденовирусной частицей последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), выбранная на основе рекомендаций ВОЗ (взята из официального общедоступного источника NCBI, GenBank, США, № GQ293081.1; данные которого доступны: www.ncbi.nlm.nih.gov), на основе общеизвестных сведений о вырожденности генетического кода и частоте использования определенных видов кодонов у человека была предварительно оптимизирована для экспрессии в клетках человека.

Для этого в нуклеотидной последовательности гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) заменили «неудобные» для человеческих тРНК кодоны так, чтобы не произошла аминокислотная замена последовательности. При подборе пользовались общеизвестными данными по частоте встречаемости кодонов у человека (http://www.kazusa.or.jp/codon/). Так, например, аминокислота лейцин (L) кодируется шестью кодонами - UUA, UUG, CUA, CUC, CUG, CUU, однако у человека из них наиболее часто используются CUC (20%) и CUG (40%), поэтому на них были заменены все оставшиеся четыре кодона, в соответствующей пропорции (для CUC - 24,7% и CUG - 56,4%). Таким же образом поступали со всеми другими кодонами, не в единственном числе кодирующими одну аминокислоту.

На фигуре 1 представлены:

SEQ ID NO:1 - неоптимизированная нуклеотидная последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1);

SEQ ID NO:2. - оптимизированная для экспрессии в клетках человека нуклеотидная последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1);

Protein - аминокислотная последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), кодируемая нуклеотидными последовательностями SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2.

Цифры над последовательностями обозначают номер нуклеотида в последовательности.

Проведенные нами с целью оптимизации замены нуклеотидов в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1 неоптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) на нуклеотиды в нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:2 оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) затемнены серыми прямоугольниками.

Буквенное обозначение аминокислоты расположено под тремя нуклеотидами двух сравненных нуклеотидных последовательностей (SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2), которыми она кодируется.

Все буквенные обозначения нуклеотидов и аминокислот стандартны и общеизвестны.

Таким образом, представленные на фигуре 1 неоптимизированная и оптимизированная нуклеотидные последовательности гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) состоят из 1698 пар нуклеотидов, расположены друг под другом и сравнены (сверху последовательность неоптимизированного гена гемагглютинина, под ней оптимизированная последовательность). Всего обе нуклеотидные последовательности кодируют 565 аминокислот (аминокислотная последовательность отображена под названием «protein»), причем обе представленные нуклеотидные последовательности SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), то есть продуцирующийся с оптимизированной нуклеотидной последовательности ген гемагглютинина вышеуказанного штамма вируса гриппа не отличается от нативного, что и требуется при оптимизации нуклеотидной последовательности.

Таким образом, нижняя (SEQ ID NO:2) нуклеотидная последовательность представляет собой уникальную оптимизированную для экспрессии в клетках человека нуклеотидную последовательность гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1).

Полученную уникальную оптимизированную последовательность кДНК гена гемагглютинина вируса гриппа человека синтезировали общеизвестным химическим методом и лигировали в общеизвестную вспомогательную плазмиду для дальнейшего переклонирования. Таким образом, синтезированная нуклеотидная последовательность содержала оптимизированные кодоны, которые не влияли на аминокислотный состав гемагглютинина, но значительно улучшали уровень его экспрессии в клетках человека.

На следующем этапе получили рекомбинантную псевдоаденовирусную частицу на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа, содержащую вставку оптимизированной последовательности гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) - SEQ ID NO:2.

Все нижеописанные работы по клонированию проводили с использованием общеизвестных методик, описанных в Sambrook J. et al., Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed., Russell, 2001, том 1, 2, 3 - Молекулярное клонирование - лабораторное руководство.

Получение конструкции рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека пятого серотипа (размером 70-80 нм), проводили методом гомологичной рекомбинации между общеизвестной плазмидой pJM17 (McGrory W.J. et al., A simple technique for the rescue of early regioni mutations into infectious human adenovirus type 5, Virology, V.163, № 2, 1988 - Простая техника для удаления раннего региона 1 в инфекционном аденовирусе человека 5 типа), содержащей геномную часть аденовируса человека 5 серотипа с нарушенной Е1 областью, и вспомогательной плазмидой pACCMVpLpA (Roth M.G., Methods in cell biology, № 43, с.175 - Методы в клеточной биологии.), (Go' mez-Foix A. et al., Adenovirus-mediated transfer of the muscle glycogen phosphorylase gene into hepatocytes confers altered regulation of glycogen metabolism, J. Biol. Chem., 1992, № 267 (35), 15, с.25129-25134 - Обеспечиваемый аденовирусом перенос гена фосфорилазы мышечного гликогена в гепатоциты меняет регуляцию метаболизма гликогена). Предварительно в шаттл-плазмиду pACCMVpLpA переклонировали оптимизированный ген гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) из вспомогательной плазмиды, в результате получили pACCMVpLpA с экспрессирующей кассетой с целевым трансгеном (геном гемагглютинина), фланкированной участками генома аденовируса, которые участвуют в дальнейшей рекомбинации. Гомологичную рекомбинацию проводили в клетках линии НЕК293 (например, № 300192, CLS, Germany) после котрансфекции ее плазмидами pJM17 и pACCMVpLpA. Так как плазмида pJM17 содержала бактериальный сайт инициации репликации (Ori) и ген устойчивости к ампициллину внутри области Е1 геномной части аденовируса, то эта плазмида не могла быть упакована в аденовирусные вирионы и, таким образом, предотвращалось размножение аденовирусов «дикого типа». После рекомбинации Ori и ген устойчивости к ампициллину исчезали, замещаясь кассетой с целевым трансгеном. Рекомбинантные ДНК упаковывались в капсид вирионов, в результате чего образовались рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, не способные размножаться в непермиссивных культурах клеток, в том числе, в обычных клетках человека, из-за отсутствия Е1 в геноме рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц.

Фигура 2. Схема экспрессирующей кассеты рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы с геном гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1). Изображено:

1 - аденовирусная нуклеотидная последовательность ( );

2 - промотор цитомегаловируса ( );

3 - трансген ( )

4 - сигнал полиаденилирования SV40 (Simian vacuolating virus 40) ( ).

Для подтверждения соответствия заявленным свойствам созданной конструкции рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе аденовируса человека 5 серотипа со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа типа А штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) (SEQ ID NO:2) проводили описанные ниже ПЦР (полимеразная цепная реакция) по известной стандартной методике.

Проверяли следующие свойства созданной конструкции:

1. Подлинность рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, то есть наличие генома аденовируса человека 5 серотипа. Для этого проводили ПЦР на аденовирусную часть (последовательность ДНК, кодирующая гексон аденовируса человека 5 серотипа). Использовали пару праймеров для подтверждения наличия генома (ген гексона) рекомбинантного аденовируса.

ADH12-Reverse

5'-CTCAAAAGTCATGTCTAGCGC-3'

ADH 11-Forward

5'-AACTTCCAGCCCATGAGCCG-3'

2. Отсутствие патогенности, то есть невозможность вызвать заболевание аденовирусом у человека, Е1 область делетирована у полученных рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы, в отличие от аденовируса «дикого типа», способного вызвать заболевание. Для подтверждения отсутствия области Е1 проводили ПЦР.

Использовали пару праймеров на область Е1, которая должна отсутствовать у созданных рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц.

KD25-Forward

5'-CGCGGGAAAACTGAATAAGAGGA-3'

wtEIR-Reverse

5'-ATGTCGGGCGTCTCAGG-3'

3. Наличие вставки оптимизированного гена гемагглютинина (SEQ ID NO:2). Для этого использовали ПЦР на гемагглютинин вируса гриппа с праймерами на целевой ген гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), оптимизированный для экспрессии в клетках человека.

CMVF

5'-GGTAGGCGTGTACGGTGGGAGG-3'

A1R

5'-GACCAGCACCTCTTTCTCCTTG-3'

Результаты ПЦР с вышеприведенными праймерами представлены на одной электрофореграмме (Фигура 3).

На фигуре 3 изображена электрофореграмма ПЦР - анализов ДНК рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе аденовируса человека 5 серотипа со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) (SEQ ID NO:2).

Светлые горизонтальные полоски на треке - положительный результат реакции, отсутствие полос на треке - отрицательный результат.

Треки: 1, 2, 3 - отрицательный контроль, ДНК аденовируса и положительный контроль, соответственно, с праймерами на трансген (гемагглютинин).

Треки 4, 5, 6 - отрицательный контроль, ДНК аденовируса и положительный контроль, соответственно, с праймерами на гексон аденовируса человека пятого серотипа.

Треки 7, 8, 9 - отрицательный контроль, ДНК аденовируса и положительный контроль, соответственно, с праймерами на Е1 область аденовируса человека пятого серотипа.

М - маркер молекулярного веса Gene Ruler^TM DNA Ladder Mix, Fermentas. Анализ проводили в 0,8% агарозном геле.

Таким образом, согласно результатам, представленным на фигуре 3, полученная рекомбинантная псевдоаденовирусная частица была проанализирована методом ПЦР с использованием пар праймеров, комплементарных соответствующему целевому трансгену (SEQ ID NO:2), гену гексона аденовируса человека пятого серотипа, а так же Е1 области аденовируса для контроля возможного присутствия репликативно-компетентных вирусных частиц (ревертантов «дикого типа» аденовируса).

Изображенные на фигуре результаты ПЦР-анализа показывают, что Е1 область, которая должна быть делегирована у рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц не обнаружена (отрицательный результат на треке 8), последовательность ДНК, кодирующая гексон аденовируса человека 5 серотипа, обнаружена (положительный результат на треке 5), ген оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1)(SEQ ID NO:2), обнаружен (положительный результат на треке 2).

По результатам ПЦР заключено, что получена рекомбинантная псевдоаденовирусная (отсутствует Е1 область аденовируса) частица на основе аденовируса человека 5 серотипа (есть гексон аденовируса человека 5 серотипа) со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) (присутствует оптимизированный ген гемагглютинина - SEQ ID NO:2), что говорит о соответствии данной конструкции заявляемым по изобретению требованиям.

Пример 2.

В данном примере описываются культурально морфологические особенности сконструированных рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц на основе генома аденовируса человека 5 серотипа со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2.

Все применяемые культуральные методы были общеизвестными (Фрешни Р. и др. Культура животных клеток. Методы, М., Мир, 1989, с.333).

Рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы собираются в клетках линии НЕК293 (human embryonic kidney - почек эмбриона человека) (например, № 300192, CLS, Germany). Геном данного типа клеток содержит область Е1, что позволяет рекомбинантным псевдоаденовирусным частицам с удаленными аналогичными областями собираться и размножаться в клетках этой линии. Сборка частиц сопровождается лизисом клеток, от момента трансдукции до момента лизиса клеток и получения новой генерации рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой гена гемагглютинина вируса гриппа проходит 48 часов.

Для роста клеток линии НЕК293 в адгезионной культуре необходимо использовать среду DMEM (например, Invitrogen, № 52100-047, США), содержащую 25 мМ глюкозы, 4 мМ Д-глютамина и 10% эмбриональной бычьей сыворотки, специальный инкубатор с поддержанием температуры +37°С и 5% CO₂.

Для роста клеток линии НЕК293 в адгезионной культуре необходимо использовать среду DMEM (например, Invitrogen, № 52100-047, США), содержащую 25 мМ глюкозы, 4 мМ Д-глютамина и 10% эмбриональной бычьей сыворотки, специальный инкубатор с поддержанием температуры +37°С и 5% CO₂.

Широко известно, что наиболее достоверным методом определения активности вируса является титрование. Речь идет о способности вируса образовывать повреждения клеток в слое культуры, которые называют бляшками. Соответственно, одна бляшкообразующая единица (БОЕ) равна дозе вируса, способной образовать одну бляшку.

Поэтому количество рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц, способных трансдуцировать (активность) клетки линии НЕК293, определяли с помощью метода титрования по бляшкам, в результате получали титр частиц, выраженный в бляшкообразующих единицах на мл (БОЕ/мл) (Мейхи Б. Вирусология. Методы. - М., Мир, 1988, 365-266 с.; Здродовский П.Ф. Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней. - М., Медицина, 1965, 82-87 с.).

Для оценки активности монослой клеток линии НЕК293 с конфлюэнтностью 50-70% заражали суспензией зараженных клеток, в количестве 10 БОЕ вируса на культуральную чашку диаметром 15 см. Через двое суток инфицированные клетки снимали, концентрировали низкоскоростным центрифугированием, суспендировали в фосфатном буфере (рН 7,2-7,4) и разрушали с помощью 3-х кратного замораживания-оттаивания. Полученную суспензию осветляли центрифугированием при 2000 об/мин 10 мин при +4°С и титровали по бляшкам.

Таким образом, установили активность рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц от 7Х10⁷ до 3Х10⁸ БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц на мл культуры НЕК293).

Пример 3.

Способность к усиленной экспрессии рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) определяли in vitro стандартным методом иммуноблоттинга (вестерн-блот) с использованием моноклональных антител к гемагглютинину.

Для этого клетки линии НЕК293 трансдуцировали рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина, а также рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами с неоптимизированными для трансляции кодонами и рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами, имеющими целевой ген, не относящийся к гемагглютининам. Через сутки после трансдукции клетки всех образцов отмыли 2 раза фосфатно-солевым буфером, рН=7.4 и лизировали в буфере для нанесения, содержащем додецил сульфат натрия и дитиотреитол. Образцы прогрели 7 мин при +95°С и охладили до комнантной температуры. Далее полученные лизаты контрольных и трансдуцированных клеток подвергли электрофорезу в полиакриамидном геле в денатурирующих условиях. В качестве положительного контроля использовали очищенный гемагглютинин вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1). После проведения фореза, белки из геля перенесли на специальную мембрану для проведения иммуноблот-анализа. Иммуноблот-анализ проводили по стандартной схеме с использованием антител к гемагглютинину Ж (Sino Biological Inc., Китай, Кат. № 11055-ММ09) и белка гемагглютинина вируса гриппа A H1N1 A/Brisbane/59/2007 (Sino Biological Inc., Китай, Кат. № 11052-V08H). Результаты иммуноблот-анализа показаны на фигуре 4.

На фигуре 4 изображены результаты иммуноблот-анализа. Дорожки обозначают анализ с лизатом клеток 293 линии:

1 - рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2;.

2 - рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы со вставкой неоптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:1;

3 - отрицательный контроль (рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, не продуцирующие гемагглютинин);

4 - положительный контроль (гемагглютинин вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1)).

Таким образом, на фигуре 4 хорошо заметно темное окрашивание полосы детекции на дорожке 1, что отмечено стрелкой и означает высокий уровень экспрессии гена гемагглютинина рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина, SEQ ID NO:2. На дорожке 2 слабозаметная окрашенная полоса, что означает низкий уровень экспрессии гена гемагглютинина рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами с гемагглютинином с неоптимизированными кодонами, SEQ ID NO:1. На 3 дорожке отрицательного контроля окрашенной полосы нет, а на дорожке 4 расположена хорошо видимая полоса положительного контроля.

Полученные результаты иммуноблот-анализа позволяют заключить о значительно усиленном уровне экспрессии рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) по сравнению с неоптимизированным геном гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), что соответствует решению поставленной по изобретению задаче по созданию рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, усиленно продуцирующей гемагглютинин вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2.

Пример 4.

В данном примере рассматривается способ использования рекомбинантной псевдоаденовирусной частицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа, продуцирующей гемагглютинин вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) путем ее введения в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа А субтипа H1N1.

Также показана индукция протективного иммунитета к вирусу гриппа А гетерологичных штаммов A/USSR/90/77(H1N1) и A/Mallard Duck/Pensylvania/10218/84(H5N2).

Для подтверждения способа иммунизировали мышей в дозе 10⁸ БОЕ/мышь и изучали иммуногенные и протективные свойства созданных рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц.

Для иммунизации лабораторных мышей рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами животные были разбиты на группы по 10 особей и под легким эфирным наркозом интраназально однократно иммунизированы рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2, в дозе 10⁸ БОЕ/мышь. В качестве контрольных использовались группы мышей, получавших рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы, не несущие трансгена, и физиологический раствор NaCl. Препаратом сравнения были рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы со вставкой неоптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:1.

Взятие крови для анализа сывороток проводилось через три недели после иммунизации.

Иммуногенность рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой гена гемагглютинина определяли по уровню антигемагглютинирующих антител в сыворотке крови в стандартной РТГА (реакции торможения гемагглютинации) (Таблица 1 и фигура 5).

В таблице 1 представлены титры специфических антител к вирусу гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1) в сыворотке крови на 21 сутки после иммунизации мышей.

Таблица 1
Наименование вводимого препарата	Антигемагглютинирующие антитела в РТГА (средний геометрический титр)
Рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2
	2352,53±1415,3
Рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы со вставкой гена гемагглютинина (неоптимизированного) вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:1
	3224,8
Рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы без вставки трансгена
	<4

Контрольное вещество (физиологический раствор NaCl)
	<4

По данным таблицы 1, иммуногенность рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2, значительно превосходит иммуногенность рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой неоптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:1. Контрольные вещества были неиммуногенны.

На фигуре 5 представлена диаграмма, столбцы которой показывают уровень антигемагглютинирующих антител, определенных в РТГА, к вирусу гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), при этом иммунизацию проводили следующими веществами:

1 - рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2;

2 - рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой неоптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:1;

3 - рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами без вставки трансгена;

4 - физиологическим раствором NaCl.

Результаты диаграммы на фигуре 5 показывают значительное повышение уровня антигемагглютинирующих антител в случае иммунизации рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2, по сравнению с рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой неоптимизированного гена гемагглютинина того же штамма, SEQ ID NO:1, а также контрольными веществами (титры антигемагглютинирующих антител отсутствовали).

Также одновременно через три недели после иммунизации для исследования протективных свойств созданных рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц моделировали летальную инфекцию путем заражения лабораторных мышей высокой летальной дозой вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) интраназально под легким эфирным наркозом. Наблюдение за животными проводили в течение 16 дней после заражения.

На фигуре 6, графики 1, 2, 3, 4, представлены кривые выживаемости иммунизированных мышей после заражения летальной дозой вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1). Иммунизацию проводили:

1 - рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2;

2 - рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой неоптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:1;

3 - рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами без вставки трансгена;

4 - физиологический раствор NaCl.

Представленные на фигуре 6 данные графиков 1, 2, 3, 4 свидетельствуют о наличии протективных свойств против заражения гомологичным штаммом у рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2, так как ни одна из иммунизированных мышей при заражении летальной дозой вируса A/Brisbane/59/2007(H1N1) не погибла (100% выживаемость). В случае иммунизации рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой неоптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:1, и без вставки трансгена протективные свойства были гораздо слабее, выживаемость составила, соответственно, 20% и 6%. При этом, в контрольной группе, получавшей физиологический раствор, наблюдалась гибель 100% мышей в течение 12 дней.

Для определения индукции гетеросубтипического иммунитета, возникающего в ответ на иммунизацию рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2, были сформированы дополнительно 2 опытные группы по 10 мышей. Схема иммунизации мышей рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) и отбор сывороток крови, а также время наблюдения были такими же, как описано выше в данном примере.

Заражение проводили высокими летальными дозами вируса гриппа, штамма A/USSR/90/77(H1N1) и штамма A/Mallard Duck/Pensylvania/10218/84(H5N2).

На фигуре 6 график 5 отражает результаты выживаемости мышей, иммунизированных рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) и зараженных летальной дозой вируса гриппа A/USSR/90/77(H1N1). Выживаемость составила 89%, что подтвердило предположение об индукции гетеросубтипического протективного иммунитета в ответ на введение рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) к другому штамму субтипа Н1.

Также на фигуре 6 график 6 отражает результаты выживаемости мышей, иммунизированных рекомбинантными псевдоаденовирусными частицами со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) и зараженных летальной дозой вируса гриппа A/Mallard Duck/Pensylvania/10218/84(H5N2). Была обнаружена выживаемость в 80%, что подтвердило предположение об индукции гетеросубтипического протективного иммунитета в ответ на введение рекомбинантных псевдоаденовирусных частиц со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1) к штамму субтипа Н5.

Таким образом, по результатам экспериментов заключили, что созданные рекомбинантные псевдоаденовирусные частицы со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), SEQ ID NO:2, продуцирующие гемагглютинин вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), обладают усиленными иммуногенными и протективными свойствами в отношении гомологичного штамма возбудителя вируса гриппа A/Brisbane/59/2007(H1N1), а также индуцируют протективный иммунитет к гетерологичным штаммам A/USSR/90/77(H1N1) и A/Mallard Duck/Pensylvania/10218/84(H5N2), что позволяет использовать их для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа А субтипов Н1 и Н5.

Вывод. На основании представленных в примерах результатов исследований заключено, что поставленная техническая задача по изобретению выполнена. Создана рекомбинантная псевдоаденовирусная частица со вставкой оптимизированного гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), обладающая активностью 7×10 ⁷ до 3×10⁸ БОЕ/мл и усиленным уровнем экспрессии гена гемагглютинина вируса гриппа штамма A/Brisbane/59/2007(H1N1), усиленными иммуногенными и протективными свойствами, что позволяет использовать ее для индукции специфического иммунитета к вирусу гриппа А субтипов Н1 и Н5.