способ местного лечения ран с помощью биологической повязки, содержащей живые клетки линии диплоидных фибробластов человека

Формула изобретения

1. Биологическая повязка для местного лечения ран, содержащая полимерное основание из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки, покрытое слоем человеческого коллагена типа I, и диплоидные клетки человека, отличающаяся тем, что в качестве диплоидных клеток содержит охарактеризованные живые клетки фибробласты человека линии М-20 на уровне пассажей № 20-33 в виде монослоя клеток 70-80% плотности насыщения, полученного при исходной плотности посева (4-5)×10⁴ клеток на 1 см² повязки и культивировании в питательной среде с добавлением фибринолитически активной плазмы (ФАП), при этом повязка имеет форму квадрата.

2. Способ местного лечения ран, включающий наложение на поверхность раны биологической повязки, содержащей полимерное основание из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки, покрытой слоем человеческого коллагена типа I, и диплоидные клетки человека, отличающийся тем, что биологическая повязка изготовлена в форме «квадрата» и содержит в качестве диплоидных клеток охарактеризованные живые клетки фибробласты человека линии М-20 на уровне пассажей № 20-33 в виде монослоя клеток 70-80% плотности насыщения, полученного при исходной плотности посева (4-5)×10⁴ клеток на 1 см² повязки и культивировании в питательной среде с добавлением ФАП.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что при обширных повреждениях размещают необходимое число повязок «встык» на раневом поле.

4. Способ по любому из пп.2-3, отличающийся тем, что повязку применяют с 1-2 суток после травмы.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, биотехнологии.

Современный уровень развития биологии и медицины позволяет создавать раневые покрытия, содержащие диплоидные клетки, что позволяет активно влиять на процесс ранозаживления [Д.С. Саркисов, А.А. Алексеев, В.П. Туманов в кн.: Новые методы лечения ожогов с использованием культивированных аллофибробластов. Международный симпозиум. Саратов, 1998, с.31]. Такой подход открывает пути повышения эффективности, в частности, местного лечения пограничных ожоговых ран [С.В. Смирнов, В.Б. Хватов. Инновационные технологии местного лечения ожогов в НИИ скорой помощи им. Н.В. Склифосовского. В книге: Новая экономика. Инновационный портрет России. М., Центр стратегического партнерства, 2009, с.388-390].

Прототип. Патент РФ на изобретение № 2373944., 23.06.2008 (Способ лечения ожоговой раны. Ермолов А.С., Смирнов СВ., Хватов В.Б., Миронова Л.Л., Конюшко О.И., Жиркова Е.А., Бочарова B.C.). Способ местного лечения ожоговых ран включает туалет раны, наложение на ее поверхность биологической повязки, состоящей из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки «Карбоксил П», покрытой

слоем человеческого коллагена 1 типа, и в качестве аллогенных фибробластов используют охарактеризованные клетки линии диплоидных фибробластов человека М-22 на уровне 15-25 пассажей, причем повязку применяют с первых двух суток после ожоговой травмы. Местное лечение ожоговых ран позволяло обеспечить быстрое полноценное восстановление эпителия по всей поверхности раны II-IIIA с хорошим функциональным и косметическим результатом. Однако используемый штамм диплоидных фибробластов человека М-22 весьма «капризен» и требователен к условиям культивирования, обладает недостаточной пролиферативной активностью, что удлиняет время изготовления биологических повязок и увеличивает расход клеток. В результате возникла необходимость в клеточной линии, также пригодной для местного лечения пролежней, укушенных ран, длительно не заживающих и ожоговых ран. Для местного лечения повреждений кожи предложено использовать диплоидные клетки человека - фибробласты линии М-20.

Приводим сравнительную характеристику свойств линии М-20 и лицензированной линии М-22 (используется в прототипе) (Таблица).

Сравнительная характеристика линий диплоидных клеток человека М-20 и М22
Характеристика	М-20	М-22прототип)
Видовая принадлежность, ткань	Человек, кожа и мышцы 10-недельного эмбриона, полученного при выполнении аборта по медицинским показаниям.	Человек, кожа и мышцы 8-недельного эмбриона, полученного при выполнении аборта по медицинским показаниям.
Где и когда выделена	ИПВЭ им. М.Л. Лумакова РАМН, 1986	ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН, 1986
Характеристика донора	Онкологических, венерических заболеваний, гепатита, туберкулеза в анамнезе не обнаружено; генетических и врожденных заболеваний в семье не обнаружено.
Культуральные свойства
Тип роста	фибробластоподобный	фибробластоподобный
Жизненный цикл
Фазы жизненного цикла	Становление 1-3 пассажи, активный рост 4-40, старение от 41 до 48-52.	Становление 1-3 пассажи, активный рост 4-39, старение 40-70.
Способ культивирования	Стационарный, перевивки 2 раза в неделю в фазе активного роста с коэффициентом рассева 1:2-1:3.
Условия культивирования	Среда ДМЕМ с -глутамином с добавлением 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) при температуре 37°C и содержании CO2 -5%.	Среда Игла MEM с -глутамином и 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при температуре 37°C и содержании CO2-5%.
Отделение клеток от поверхности роста	Смесью 0,25% раствора трипсина.
Условия криоконсервирования	Состав криозащитной среды: ДМСО 10%, эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота 40%, среда Игла MEM 50%
Режим криоконсервирования	Стартовая температура 20°C, снижение температуры до +4°C со скоростью 1 град./мин; выдержка 10 минут, снижение температуры до -30 град./мин со скоростью 1 град./мин; выдержка 10 минут; снижение температуры до -150°C со скоростью 10 град./мин. Перенос замороженных образцов в жидкий азот.
Восстановление и жизнеспособность клеток после хранения в	На водяной бане при температуре 37°C. Жизнеспособность: не менее 75±5% клеток. Среда для культивирования та же.

Продолжение
Кариологические свойства.	Кариотип человека 2n=46,ХУ Диплоидных клеток 93,3-96,9%. Полиплоидных клеток не более 1,6%. Штамм обладает высокой генетической стабильностью.	Кариотип человека 2n=46,ХУ Диплоидных клеток 89,7-93,6%). Полиплоидных клеток не более 2,3%.
Изоэнзимная характеристика	Количество полос изоэнзимов Г-6ФДГ и ЛДГ и их электрофоретическая подвижность совпадают с таковыми для эритроцитов человека. Г-6ФДГ медленного типа
Контроль контаминации:
Бактериями	Отрицательный	Отрицательный
Грибами	Отрицательный	Отрицательный
Микоплазмами	Отрицательный	Отрицательный
Вирусами	Отрицательный	Отрицательный
Контроль на онкогенную активность
In vivo	Не обнаружено	Не обнаружено
In vitro	Не обнаружено	Не обнаружено
Чувствительность к вирусам	Полиовирус, штаммы А. Сэбина 1, 2, 3 типов, вирус везикулярногостоматита (ВВС).	Полиовирусу, штаммы А. Сэбина 1, 2, 3 типов, ECHO, кори, КЭ, ЛХМ.
Биохимические, генетические маркеры	HLA-маркеры. A*02,03; B*07,40; C*03, 07; DRB1*15, 16; DQB1*05, 06	Не определяли.
Область применения	Тест-система для определения интерферонового статуса, для получения клеточного продукта, предназначенного для лечения ожоговых (II-IIIa степень) и длительно не заживающих ран.	Для приготовления полиомиелитной вакцины из штаммов А. Сэбина трех типов.

Кроме того, показано, что клетки линии М-20 на уровне 20 пассажа продуцируют мРНК -интерферона (ИФН ) и интерлейкинов: ИЛ 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 18, что объясняет механизм улучшения репаративных процессов при ранозаживлении.

Паспорт линии диплоидных клеток человека М-20

Наименование линии: М-20; Видовая принадлежность: человек; линия установлена в 1986 году в ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН

Культуральные свойства:

1. Тип роста: фибробластоподобный

2. Количество пассажей: 50±2

3. Фазы роста: I-1-3 пассажи, II-4-40, III-41-(50±2)

4. Способ культивирования: стационарный, перевивки 2 раза в неделю

5. Условия культивирования: среда ДМЕМ с -глутамином с добавлением 10% фибринолитически активной плазмы (ФАП) при температуре 37°C и 5% CO₂ в атмосфере.

6. Метод отделения клеток от поверхности роста: смесью 0,25% раствора трипсина и 0,02% раствора Версена в отношении (1:1)

Условия хранения: при температуре минус 196°C (в жидком азоте); а) состав криозащитной среды: среда ДМЕМ-50%, криопротектор ДМСО-10%, сыворотка эмбрионов коров - 40%. б) Режим замораживания: стартовая температура 20°C, снижение температуры до +4°C со скоростью 1 град./мин; выдержка 10 минут, снижение температуры до -30 град./мин со скоростью 1 град./мин; выдержка 10 минут; снижение температуры до -150°C со скоростью 10 град./мин. Перенос замороженных образцов в жидкий азот.

Восстановление и жизнеспособность клеток после криохранения:

на водяной бане при температуре 37°C. Жизнеспособность: не менее 75±5% клеток. Среда для культивирования та же.

Изоэнзимная характеристика: Количество полос изоэнзимов Г-6ФДГ и ЛДГ и их электрофоретическая подвижность совпадают с таковыми для эритроцитов человека. Г-6ФДГ медленного типа.

Кариологическая характеристика: Кариотип человека 2n=46, ХУ. Диплоидных клеток 93,3-96,9%. Полиплоидных клеток не более 1,6%. Штамм обладает высокой генетической стабильностью.

Контроль контаминации: бактерий, грибов, микоплазм при посеве на селективные питательные среды, заражении куриных эмбрионов и при электронно-микроскопическом исследовании не выявлено, вирусов не обнаружено в исследованиях на животных, в клеточных культурах, в куриных эмбрионах, методами электронной микроскопии.

Онкогенная безопасность: in vivo - при исследовании с использованием линейных мышей СВА опухоли не образовывались; in vitro - контроль на обратную транскриптазу отрицательный.

Биохимические, генетические маркеры: а) HLA - маркеры: A*02, 03; B*07, 40; C*03, 07; DRB1*15, 16; DQB1*05, 06. б) Клетки линии М-20 на уровне 20 пассажа продуцируют мРНК -интерферона (ИФН ) и интерлейкинов: ИЛ 1 , 2, 4, 6, 8.10, 18.

Таким образом, линия диплоидных клеток человека М-20 охарактеризована согласно методическим рекомендациям «Аттестация перевиваемых клеточных линий - субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» РД-42-28-10-89. МЗ СССР. М., 1989.- С.16]. Она охарактеризована на безопасность в соответствии с рекомендациями ВОЗ и требованиями ГНИИСиК МИБП им. Л.А. Тарасевича. В ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН имеются банки посевных и рабочих клеток, способные обеспечить все потребности производства и научных исследований. Линия М-20 обладает более высокой пролиферативной активностью, чем линия М-22, за счет использования при культивировании клеток ФАП.

Эти данные являются обоснованием к применению этих клеток в новой биологической повязке для ускорения процессов заживления при лечении пролежней, ожоговых, укушенных и длительно не заживающих ран.

Техническое решение направлено на создание биологической повязки с улучшенными свойствами за счет применения фибробластов человека линии М-20, обладающих более высокой пролиферативной активностью в результате культивирования их с добавлением фибринолитически активной плазмы (ФАП), что обеспечивает улучшение репаративных процессов в ране и сокращение времени заживления. При этом повязку изготавливают в больших по площади чашках квадратной формы, что обеспечивает дополнительные преимущества - возможность покрытия раневой поверхности большой площади, в том числе путем размещения необходимого числа повязок «встык» на раневом поле, что позволяет закрыть все раневое поле при обширных повреждениях.

Таким образом, объектом изобретения является биологическая повязка для местного лечения ран, содержащая полимерное основание из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки, покрытое слоем человеческого коллагена типа I, и диплоидные клетки человека, которая в качестве диплоидных клеток содержит охарактеризованные живые клетки фибробласты человека линии М-20 на уровне пассажей № 20-33 в виде монослоя клеток 70-80% плотности насыщения, полученного при исходной плотности посева (4-5)×10⁴ клеток на 1 см² повязки и культивировании в питательной среде с добавлением фибринолитически активной плазмы (ФАП), при этом повязка имеет форму квадрата.

Объектом изобретения является также способ местного лечения ран, включающий наложение на поверхность раны биологической повязки, содержащей полимерное основание из гидрофобной перфорированной кремнийорганической пленки, покрытой слоем человеческого коллагена типа I, и диплоидные клетки человека, в котором биологическая повязка изготовлена в форме «квадрата» и содержит в качестве диплоидных клеток охарактеризованные живые клетки фибробласты человека линии М-20 на уровне пассажей № 20-33 в виде монослоя клеток 70-80% плотности насыщения, полученного при исходной плотности посева (4-5)×10⁴ клеток на 1 см² повязки и культивировании в питательной среде с добавлением ФАП. При обширных повреждениях возможно размещение необходимого числа повязок «встык» на раневом поле. Предпочтительно повязку применяют с 1-2 суток после травмы.

Пример 1. Пример изготовления биологической повязки.

На дне квадратной чашки Петри (12×12 см) площадью 144 см² (в прототипе использовали круглые чашки диаметром 9 см и площадью 63 см²) помещают гидрофобную, прозрачную, перфорированную кремнийорганическую пленку «Карбоксил-П», покрывают слоем коллагена 1 типа человека, высушивают, подвергают стерилизации гамма-лучами. В стерильном боксе в подготовленные чаши Петри помещают суспензию фибробластов линии М-20 (20-33 пассажа), плотность посева клеток составляет (4-5)×10 ⁴ клеток на 1 см². Клетки культивируют в течение суток в CO₂-инкубаторе при 37°C и в атмосфере, содержащей 5% CO₂. Используют питательную среду ДМЕМ с -глутамином для культур клеток, содержащую 10% ФАП. Через 18-24 часа клетки формируют монослой 70-80% плотностью насыщения. Подготовленную таким образом биологическую повязку доставляют в клинику в герметичном термоконтейнере (рис.1, 2).

Рис 1. Биологическая повязка на основе культивированных аллофибробластов линии М-20 (а. внешний вид повязки, в. схема повязки, с. клетки линии М-20).

Рис 2. Биологическая повязка, содержащая фибробласты линии М-20 перед наложением на рану.

Пример 2. Наложение биологической повязки на примере ожоговой раны: с раневой поверхности удаляют мертвые ткани, продукты горения и загрязнения. На подготовленную рану накладывают биологическую повязку, клетками (фибробластами М-20) обращая к поверхности раны. Раневое покрытие фиксируют влажно-высыхающей марлевой повязкой. Повязку применяют с 1-2 суток после ожоговой травмы. Следующую перевязку выполняют через 2-3 дня. Прозрачность кремнийорганического полимерного основания позволяет наблюдать за состоянием раны и контролировать ее заживление, а газопроницаемость пленки, сравнимая с показателями здоровой кожи, обеспечивает метаболический комфорт в ране. Гидрофобная природа пленки способствует легкому, безболезненному ее удалению при перевязке без повреждения сформировавшегося на поверхности раны регенерировавшего слоя неоэпителия.

Примеры 3-4. Клинические примеры применения биологической повязки, содержащей фибробласты человека линии М-20 (рис 3, а. - пример 3, в - пример 4):

Пример 3. Больной К, 32 лет, диагноз: ожог пламенем I-II-IIIA степени 65% поверхности тела. Через 18 часов после травмы произведена первичная хирургическая обработка раны и на площадь 2260 см² наложены 15 биологических повязок, содержащих живые фибробласты линии М-20 (90 млн клеток). На 4 сутки после наложения биологической повязки (80 млн клеток) на всей раневой поверхности спины сформировался слой неоэпидермиса; на 6 сутки в местах наложения повязок наблюдалась полная эпителизация раневой поверхности без признаков гипертрофии эпидермиса. Мазки-отпечатки с поверхности неотэпителия свидетельствовали о наличии микрофлоры, типичной для нормальной кожи. К 12 суткам в сформированном эпителии появлялись признаки восстановления пигментации и волосы.

Пример 4. Больной С., 35 лет, диагноз: ожог пламенем I-II-IIIA степени 25% поверхности тела. Через 24 часа после травмы произведена первичная хирургическая обработка раны и на площадь 1200 см ² наложены 8 биологических повязок, содержащих живые фибробласты линии М-20 (40 млн клеток). На 4 сутки наложены биологические повязки, содержащие живые фибробласты (40 млн клеток), на 7 сутки в местах наложения повязок наблюдалась полная эпителизация раневой поверхности без признаков гипертрофии эпидермиса. К 15 суткам в сформированном эпителии появлялись признаки восстановления пигментации и волосы.

Наблюдение за больными в течение последующих 2-3 месяцев свидетельствует о формировании полноценного кожного покрова с нормальной эластичностью, пигментацией и ростом волос. При контрольном осмотре через 3-6 месяцев кожа в зоне применения аллофибробластов гладкая, эластичная, нормального цвета с наличием волос. Использование в составе биологической повязки всесторонне обследованной клеточной линии живых диплоидных фибробластов М-20 гарантирует биологическую безопасность клеточного материала и обеспечивает улучшение репаративных процессов в ожоговой ране. Наличие банков посевных и рабочих клеток из детально охарактеризованных клеточных линий позволяет своевременно и в полном объеме обеспечивать потребности клиники.