способ получения n-ацильных производных солей s- аденозилметионина

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ N-АЦИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ СОЛЕЙ S-АДЕНОЗИЛМЕТИОНИНА общей формулы



где R бензоил, n-толуолсульфонил или линейный алифатический C₂ - C₆-ацил;

R₁ водород, бензоил или алифатический линейный C₂ - C₆-ацил; причем R и R₁ могут быть одинаковыми или различными, когда R₁ не водород;

A эквивалент кислоты pK_а < 2,5;

n=1 5,

отличающийся тем, что водный раствор сульфата S-аденозилметионина, содержащий 100 г/л S-аденозилметионина, обрабатывают ангидридом или хлорангидридом соответствующей кислоты при pH 7, которое поддерживают добавлением 2н. раствора NaOH, и при 1^oС, причем соотношение указанного ангидрида или хлорангидрида и соли S-аденозилметионина составляет 1 1,15 - 1,3, если R бензоил, п-толуолсульфонил или линейный алифатический C₂ - C₆-ацил, R₁ водород, или соотношение указанных компонентов составляет соответственно 1 4,8 7,8, если R имеет указанные значения, а R₁ бензоил или алифатический линейный C₂ C₆-ацил, полученный продукт очищают пропусканием отфильтрованной реакционной смеси через колонку с ионообменной смолой Н⁺-типа, элюированием 0,1н. водным раствором НА-кислоты и после концентрирования к элюату добавляют НА-кислоту в количестве, необходимом для получения требуемого значения n, и полученную соль производного S-аденозилметионина выделяют при помощи лиофильной сушки.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к способу получения производных S-аденозилметилонина (САМ) общей формулы



где R-бензол, п-толуолсульфонил или линейный алифатический ацильный радикал, содержащий 2-6 атомов углерода; R₁ Н или бензоил или линейный алифатический ацил, содержащий 2-6 атомов углерода; R и R₁ одинаковые или различные, когда R₁ имеет значение, отличное от водорода; n 1-5; А является эквивалентом кислоты с рК_а менее 2,5.

Известно, что САМ является веществом, которое присутствует во всех живых организмах, и принимает участие в значительном числе биологических процессов основополагающего значения в том смысле, что представляет основной донор метильных групп в организме.

Известно также, что вплоть до 1975 г какое-либо практическое применение САМ было невозможно из-за его чрезвычайно высокой нестабильности.

С 1975 г по настоящее время заявитель подал ряд патентов (патенты США 3 893 999, 3 954 726, 4 057 686), касающихся определенных солей САМ, которые, совершенно неожиданно, демонстрировали такую стабильность, которая позволила получать фармацевтические композиции, применимые в ряде областей лечения людей.

Хотя при этом и был ликвидирован один из отрицательных аспектов САМ, эти соли все еще не решали остальных проблем, связанных с этими продуктами, а именно, их низкую проницаемость сквозь клеточные барьеры и соответственно затрудненную абсорбцию организмом, особенно при оральном введении.

Новый класс продуктов, а именно продукты формулы 1 были открыты к настоящему моменту, и они и составляют предмет настоящего изобретения, этот класс продуктов, что было совершенно неожиданно доказано, обладает полной фармакологической активностью уже найденной для солей САМ, и обладает также аналогичной или даже более высокой стабильностью, даже при повышенной температуре, и большей биологической доступностью.

В частности, эта последняя характеристика дает возможность получать фармацевтические композиции для орального введения, что чрезвычайно удобно при лечении людей.

Новые продукты формулы 1 получают следующим образом.

В качестве исходного материала используют сульфат САМ.

Приготавливают раствор соли САМ в Н₂О таким образом, чтобы концентрация САМ составляла 100 г/л.

Полученный раствор охлаждают до 1^оС, а затем, постоянно поддерживая эту температуру за счет охлаждения, устанавливают рН 7 используя 2н. NaOH.

Эта процедура выглядит следующим образом в зависимости от того производного которое необходимо получить.

Моноацильные производные С₂-С₆ алифатических, бензольных или п-толуолсульфоновых кислот (R₁-Н).

Ацилирующий агент (ангидрид или хлорид нужной кислоты по выбору) добавляют небольшими порциями в молярном соотношении в пределах 1:1,15-1:1,3 относительно САМ, поддерживая температуру 1^оС и рН 7, добавляя NаОН.

В конце реакции (то есть, когда рН остается стабильным) температуре дают возможность повыситься до 20^оС.

Полученный раствор разбавляют до концентрации 20 г/л и если образуется осадок, его отфильтровывают полностью.

Конверсия САМ в моноацильное производное превышает 90%

Полученный таким образом раствор хроматографируют на ионообменной смоле.

Триацильные производные С₂-С₆ алифатических бензольных и п-толуолсульфоновых кислот.

Ацилирующий агент добавляют в молярном количестве между (R₁Н R₁ и R одинаковые или отличаются один от другого) 1:4,8 и 1:7,8 по отношению к САМ, всегда поддерживая при этом температуру при 1^оС а рН 7 за счет добавления 2н. NaOH.

В конце реакции температуре дают возможность повыситься до 20^оС.

Конверсия САМ в триацильное производное составляет около 80%

Раствор разбавляют до концентрации 20 г/л и отфильтровывают любое выпавший осадок.

Полученный при этом раствор хроматографируют на ионообменной смоле.

Во всех описанных случаях используют колонку со слабой кислотой смолой (АМБЕRLITE IRC 50 или CG 50 в форме Н⁺) предварительно промытую водой, а рабочие пара- метры колонки поддерживают следующими:

отношение диаметра к высоте слоя смолы 1:10,

загрузка 20 г производного САМ/л смолы,

скорость потока 1 об. колонка/ч. Затем колонку промывают 1 об. Н₂О и 0,1 н. уксусной кислоты до тех пор, пока рН элюата не установится 3. Ее промывают 20 мн Н₂SO₄ до завершения элюирования оставшегося САМ и остальных побочных продуктов, а целевой продукт элюируют 0,1 н. Н₂SO₄ (или другой сильной кислотой, если нужна другая соль).

Полученный таким образом раствор концентрируют в вакууме до 50 г/л.

Его фильтруют на активированном древесном угле (1/10 САМ производного), кислотную композицию устанавливают до нужного стехиометрического значения, и раствор лиофилизируют.

Далее приводятся несколько неограничивающих примеров получения САМ производных в соответствии с описанным ранее в целях иллюстрации настоящего изобретения.

П р и м е р 1. В 10 л Н₂О растворяют такое количество сульфата САМ, которое соответствует 1 кг ионов САМ, а затем охлаждают до 1^оС.

рН устанавливают 7 с помощью 2 н. NaOH, причем температуру поддерживают постоянной за счет циркуляции охлаждающей жидкости.

По-прежнему поддерживая температуру 1^оС, добавляют 285 мл уксусного ангидрида за промежуток времени 1 час, поддерживая в то же время рН 7 за счет добавления 2 н. NаОН.

После добавления уксусного ангидрида рН дают возможность стабилизироваться при той же самой температуре, после чего температуре дают возможность повыситься до 20^оС. Выход конверсии в моноацетильное производное составляет 95% Реакционную смесь разбавляют 20 л дистиллированной воды.

Отдельно подготавливают колонку с 50 л АМВЕRLITE IRC 50 смолы в форме Н⁺, предварительно активированной 100 л 0,5 н. Н₂SO₄, и промытый до нейтральной реакции. Реакционную смесь пропускают через колонку со скоростью 50 л/ч.

Ее промывают 50 л дистиллированной воды. Через колонку пропускают 0,1 л раствор уксусной кислоты (около 400 л) до тех пор, пока рН элюата не становится 3. Колонку промывают 50 л 20 мн Н₂SO₄ для элюирования последних следов непрореа- гировавшего САМ. Ее элюируют 50 л 0,1 н Н₂SO₄. Раствор концентрируют в вакууме (30 мм рт.ст. 35^оС) до около 1 л. Его обрабатывают 50 г активированного древесного угля и фильтруют.

Раствор титруют и добавляют достаточное количество серной кислоты для достижения молярного отношения моноацетил САМ/Н₂SO 1:2, после чего его лиофилизируют. Получают 900 г соли моноацетила САМ2 Н₂SO₄ 0,5 Н₂О, следующей композиции: Моноацетил САМ 68,3% Н₂SO 30,3% Н₂О 1,4%

что соответствует выходу 61,5% по отношению к САМ.

При анализе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (колонка РАRTISIL 10 SCX, элюент 0,1 М муравьинокислый аммоний, рН 4, 20% метанола, скорость потока 1 мл/мин, полученный продукт дает одиночный пик со временем удерживания 360 с.

Полученный продукт идентифицировали с помощью УФ и ЯМР.

Спектр У. Ф. при рН 4 максимум поглощения при 258 нм = 14040, при рН 1 максимум поглощения при 256 нм = 13500.

Спектр ЯМР: 2 млн. д. синглет ацетильной группы, 3 млн.д. синглет S-СН₃ группы.

Продукт не дает положительной реакции на тест нингидрина, что указывает на модификацию аминокислотной группы.

Устанавливая молярное стехиометрическое соотношение 1,5 или 2,5 по отношению к серной кислоте перед лиофилизацией получают следующие соли:

моноацетил САМ1,5 Н₂SO₄ 0,5 Н₂О

моноацетил САМ2,5 Н₂SO₄ 0,5 Н₂О

Используя соляную кислоту или метансульфокислоту вместо серной кислоты для элюирования колонки, получают следующие соли:

Моноацетил САМ 3 НСl 0,5 Н₂О

Моноацетил САМ 4НСl0,5 Н₂О

Моноацетил САМ 5 НСl0,5 Н₂О

Моноацетил САМ 3СН₃SO₃Н0,5 Н₂О

Моноацетил САМ 4СН₃SO₃Н0,5 Н₂О

Моноацетил САМ 5СН₃SO₃Н0,5 Н₂О

Спектр УФ и ЯМР всех этих солей были идентичны характеристикам указанных ранее продуктов.

Аналитические данные, касающихся этих солей, приведены в табл.1.

П р и м е р 2. Повторяли процедуру примера 1, однако использовали пропионовый ангидрид, масляный ангидрид, гексаноилхлорид, бензоилхлорид, паратолуолсуль- фонилхлорид, янтарный ангидрид, и глутаровый ангидрид, вместо уксусного ангидрида. Получили соответствующие SАМ-производные, аналитические характеристики для которых приведены в табл.2.

П р и м е р 3. Повторили процедуру примера 1, используя 1540 мл деканоилхлорида в около 15 л ацетона вместо уксусного ангидрида.

После завершения реакции раствор разбавили 20 л Н₂О, ацетон выпаривали в вакууме и осадок декановой кислоты отфильтровали. По способу примера 1 получили соль деканоил САМ 2Н₂SO₄ 0,5 Н₂О.

При анализе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях примера 1 получили одиночный пик со временем удерживания 340 с.

УФ спектральные характеристики:

при рН 4 максимум поглощения 258 нм: = 14040

при рН 1 максимум поглощения 256 нм: = 13500

Используя октилхлорид и додецилхлорид вместо деканоилхлорида получили следующие продукты:

-n-Октил САМ 2Н₂SO₄0,5 Н₂О

-н-додецил САМ 2Н₂SO₄ 0,5 Н₂О

Аналитические данные для этих продуктов приведены в табл.3.

П р и м е р 4. В 10 л Н₂О растворяют такое количество соли САМ, которое эквивалентно 1 кг ионов САМ и охлаждают до 1^оС. рН устанавливают 7 с помощью 2н. NaOH, поддерживая температуру 1^оС постоянной за счет циркуляции охлаждающей жидкости.

Поддерживая температуру 1^оС медленно добавляют 1200 мл уксусного ангидрида за промежуток времени 2 ч, поддерживая при этом рН 7 за счет добавления 2н. NaOH.

Выход в триацетильное производное составляет 80%

С этого момента следуют процедуре примера 1.

Получают 720 г соли триацетил САМ 2Н₂SO₄ 0,5 Н₂О

триацетил САМ 71,9% Н₂SO₄ 26,8% Н₂О 1,3% что соответствует выходу 51,8% по отношению к САМ.

При анализе с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в условиях примера 1 продукт дает одиночный пик со временем удержания 820 с.

Продукт также отличается следующими характеристиками УФ- и ЯМР спектров.

У. Ф-спектр: при рН 4 максимум поглощения при 258 нм, = 14050 при рН 1 максимум поглощения при 256 нм, = 13500 спектр ЯМР:

2 млн. д. синглет ацетила у метионина

2,2 млн д. синглет соответствующий 2 ацетилам на рибозе

3 млн. д, синглет S СН₃ группы

Если вместо уксусного ангидрида используют масляный ангидрид, пропионовый ангидрид или бензойный ангидрид получают следующие продукты:

трипропионил САМ 2Н₂SO₄ 0,5 Н₂О

трибутирил САМ 2Н₂SО₄ 0,5 Н₂О

трибензоил САМ 2Н₂SO₄ 0,5 Н₂О

Аналитические характеристики триацетильных производных САМ приведены в табл.4.

П р и м е р 5. Повторили процедуру примера 2 до получения реакционных смесей содержащих гексаноил САМ, бензоил САМ и сукцинил САМ, соответственно.

С этого момента, поддерживая температуру 1^оС за промежуток времени 1 ч добавляют 1000 мл уксусного ангидрида поддерживая рН 7 за счет добавления 2н NaOH. Далее следуют процедуры примера 1.

Получают следующие триацетильные производные смешанного типа:

гексаноил-диацетил САМ2Н₂SO₄0,5 Н₂О

бензоил-диацетил САМ 2Н₂SO₄ 0,5 Н₂О

сукцинил-диацетил САМ2Н₂SO₄0,5 Н₂О

аналитические характеристики которых приведены в нижеследующей табл.5.

Стабильность полученных САМ производных выше, чем САМ солей. Табл.6 показывает стабильность САМ-ацил производных в сухом состоянии при 45^оС по сравнению с САМ.

Другое отличительное свойство производных формулы 1 заключается в их способности проникать через клеточные барьеры и демонстрируется результатами, приведенными ниже в табл.7.

В испытании, известном как "in situ" (кишечные мешочки) 2 мг каждого испытываемого продукта в 1 мл физиологического раствора помещали в кишечных мешочках крысам под эфирной анастезией. Крысы погибали через 2 ч и остаточное содержание мешочка (стенка + содержание) брали на анализ. Определенное таким образом количество мигрировавшего продукта приводится в табл.7 в от исходного количества в мешочке.

В другом опыте использовались кусочки вывернутой кишки, выдержанные при 37^оС по методу Кребса Риндера против внешней концентрации продукта в 10^-4 М.

Количество абсорбированного продукта, подтвержденное анализом, приводится в табл.7 в виде удельной величины, т.е. моль/час/мг ткани.

Соединения формулы I хорошо абсорбируются кишечником, более интенсивно, чем САМ-сульфат, что позволяет получать более высокие концентрации активного соединения в плазме при оральном назначении по сравнению с использованием САМ-сульфата.

Способность солей сложных эфиров САМ проникать через клеточные барьеры.

Соединения формулы 1 хорошо абсорбируются кишечником, более приемлемы и никакого тератогенического действия или злокачественных новообразований на зародышах или выросших плодах не проявляют.

При внутривенном введении доз вплоть до 200 мг/кг у кроликов не вызывалось пирогенных явлений.

При внутривенном введении кроликам и крысам 40 мг/кг не наблюдалось изменений к каротидном давлении, частоте сердечных и дыхательных сокращений или на электрокардиограмме.

Локальная переносимость внутримышечных инъекций даже после повторения введений в течение 30-60 дней и внутривенных инъекций в маpгинальную вену наружного уха кроликов была превосходной.

Фармакология.

Полная серия тестов, проведенных на крысах, продемонстрировала, что новые продукты обладают весьма заметными защитными и разрешающими действиями при гепатитных стеатозах, вызванных гиперлипид-гипербелковой диетой по способу Хандлера, и при стеатозах, вызванных острыми алкогольными отравлениями и вызванных другими токсическими агентами при приеме в дозах 10 мг/кг САМ⁺

При экспериментальной гиперлипемии у крыс, например вызванной Ttilon S новые продукты продемонстрировали чрезвычайно заметную гиполипемическую активность, которая по отношению к использованным дозам (то есть 10 мг/кг) снова выраженная в САМ⁺) значительно превосходила другие препараты с гиполипемической активностью.

У цыплят с атеросклерозом, вызванным с помощью диеты обогащенной холестерином и фруктозой, при парэнтеральном введении новых продуктов в дозах 10 мг/кг снижалась холестеролемия и благоприятно модифицировались повреждения по сравнению с контрольными экземплярами по отношению к торакальной и абдоминальной аорте и мелким сосудам энцефалической основы.

Что касается фосфолипидного метаболизма, экспериментально было обнаружено, что имеется увеличение фосфатидилхолина в гепатитной ткани крыс при некомпенсированных стеатозах. Четкое повышение фосфатидилхолина было также определено в опытах гематических -липопротеинов в экспериментальных альтерациях вызванных ,-липопротеиновыми отношениями.

Во всех эти тестах имеются четкие указания на лечебное действие новых производных при нарушениях липидного метаболизма.

Следующую серию тестов проводили на крысах, и она продемонстрировала, что введение доз 1 мг/кг вызывает аккумуляцию гликогенных резервов на гепатитном и мускульном уровнях, что демонстрируется как гистохимическими методами так и по количественным измерениям. В экспериментальных диабетах, вызванных аллоксаном, количества инсулина, необходимого для возвращения гликемических значений к нормальным, значительно снижалось при введении эквивалента 0,5 мг/кг/САМ⁺.

Эта серия экспериментов продемонстрировала отчетливое положительное действие новых соединений настоящего изобретения на глюцидный метаболизм.

И наконец, крыс с экспериментально вызванной гиподиспротеинемией обрабатывали количествами 10 мг/кг производных САМ. Было обнаружено, что указанные продукты возвращают полные протеинемичные значения к нормальным, при существенном повышении уровня альбумина и, тем самым демонстрируют заметную протеиновую анаболическую активность.

Эти и другие аналогичные тесты продемонстрировали лечебную способность новых продуктов при нарушениях протидного метаболизма.

Новые продукты обладают также совершенно неожиданно обнаруженной значительной противовоспалительной и анальгетической активностью, не известной для структурных аналогов.

Испытания противовоспалительной и болеутоляющей активности соединений формулы 1 проводили в соответствии с процедурой предложенной Winter и др. результаты действия на edema вызванной каррагенином у крыс и реакции в испытании на мышах на горячей пластинке (метод Янссена и Ягено) приведены в табл.8.

Сульфат SAM при стоматическом применении не обладает какой-либо противовоспалительной и болеутоляющей активностью. Кроме того, противовоспалительная и болеутоляющая активности соединений формулы I выше по сравнению с аналогичными показателями, которые были получены для сульфата SAM при внутримышечном применении.