линкер для твердофазного синтеза пептидов

Формула изобретения

Линкер для твердофазного синтеза пептидов общей формулы



где R₁ водород или Вос;

X связь или группа CO Gly--Ala-T.н

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к органической химии, в частности, к области синтеза пептидов в гетерогенных системах жидкость/твердое тело (твердофазного синтеза пептидов). Основная идея твердофазного синтеза пептидов заключается в том, что синтезируемый пептид на всех этапах синтеза (присоединение аминокислот, деблокирование, удаление непрореагировавших компонентов и т.д.) остается присоединенным к нерастворимому носителю (обычно полимеру) через группу, называемую линкер (linker). К линкеру предъявляются требования, которые зачастую бывают взаимоисключающими. Например, высокая химическая устойчивость (на всех этапах синтеза) и в то же время лабильность (т.е. возможность его расщепления по окончании синтеза в мягких условиях, не затрагивающих лабильные аминокислоты и другие защитные группы, если требуется получить пептид с сохранением защитных групп).

В настоящее время предложено большое количество вариантов линкеров [1,2] Тем не менее проблема не считается исчерпывающе решенной.

Недавно нами был предложен способ мягкого и селективного удаления фенилгидразидной группы, блокирующей карбоксильную функцию [3-6] Способ включает каталитическое окисление фенилгидразидной группы до высокоактивной и неустойчивой фенилдиимидной с последующим самопроизвольным гидролитическим разложением последней:



Мы предположили, что фенилгидразидная группа также может защищать карбоксильную функцию, будучи присоединенной к нерастворимому полимеру, т.е. выполнять функцию линкера для твердофазного синтеза пептидов. На основании этого предположения был разработан новый линкер для твердофазного синтеза пептидов.

В качестве нерастворимого полимера при этом может быть использован гидрофильный (сферон), гидрофобный (полистирол) или любой другой полимер, устойчивый в условиях твердофазного синтеза пептидов.

Заявляемое техническое решение является новым, т.к. ранее не были описаны линкеры, расщепляемые в мягких окислительных условиях. Оно имеет изобретательский уровень, т.к. оно явным образом не следует из уровня техники. Кроме того, является промышленно применимым, т.к. фенилгидразидный линкер позволяет осуществлять препаративный твердофазный синтез пептидов.

Пример 1. Получение носителя, содержащего фенилгидразин, на основе Сферона.

Носитель, содержащий фенилгидразидные группы, был получен путем модификации гидроксиэтилметакрилатного геля Spheron ArA 1000, "La Chema", Брно, Чехословакия (0,25-0,40 ммк, диаметр пор 37-50 нм). Исходный полимер содержал связанные 2-(4-аминофенил)сульфэтоксильные группы (0,8515 ммоль/г полимера). Модификацию осуществляли по следующей схеме:



К охлажденной до 0^oC суспензии 5 г сферона ArA 1000 в 250 мл 2 М HCl добавляли 200 мл охлажденного льдом 2%-ного раствора NaNO₂ и интенсивно перемешивали в течение 4 ч при 0^oC. Диазотированный полимер отделяли фильтрацией, промывали на фильтре 100 мл охлажденной льдом конц. HCl и переносили в колбу. К полимеру добавляли коллоидный раствор 5 г SnCl₂ в 100 мл конц. HCl. Суспензию перемешивали 2 ч при комнатной температуре и затем нагревали в течение 1 ч до 50-60^oC. Полимер отделяли фильтрацией горячего раствора, промывали 500 мл воды и сушили в вакууме. Выход: 4,87 г.

Пример 2. Синтез пептида на полимерном носителе (сфероне).

Синтез пептида проводили по стандартному протоколу, описанному в [7] изложенному в табл.1. Все стадии выполняли в стеклянном реакторе объемом 50 мл для твердофазного синтеза пептидов в ручном варианте. Использовали следующие реактивы: производные аминокислот ("Bachem", Швейцария), триэтиламин, диизопропилкарбодиимид, анизол, гидроксибензотриазол ("Fluka", Швейцария), трифторуксусная кислота и органические растворители ("Мосреактив", Россия).

Пример 3. Удаление частично защищенного пептида BOC-Trp-Met-Cys(Asm)-OH с полимерного носителя (сферона).

1 г пептидил-полимера, полученного согласно Примера 2, суспендировали в 20 мл смеси, содержащей 8 мл DMF, 2 мл 1 М раствора пиридинацетатного буфера в DMF, 9 мл 20%-ного водного раствора уксусной кислоты и 1 мл 0,5 М водного раствора CuSO₄. За протеканием реакции следили методом офВЭЖХ. Через 16 ч площадь пика, соответствующего целевому продукту, достигла максимального значения и составила 83% (от суммы площадей всех пиков, наблюдаемых методом офВЭЖХ). После этого полимер отфильтровали, промыли на фильтре DMF уксусной кислотой и водой. Объединенные фильтрат и промывные жидкости нанесли на препаративную колонку C₁₈ 2,5 x 25 см и элюировали градиентом метанола в 0,005 М аммоний-ацетатном буфере, рН 4,0. Фракции, содержащие целевой продукт, объединили, упарили до небольшого объема и лиофилизовали. Выход пептида 9 мг. Структуру пептида подтвердили методом ¹H-ЯМР-спектроскопии (ЯМР-спектрометр Bruker, 500 MHz, DMSO-d₆, стандарт тетраметилсилан), величины химических сдвигов протонов приведены ниже.

H (500 MHz; DMSO-d₆; Me₄Si) 1,29 (9H, 1), 6,83 (1H, 2), 4,21 (1H, 3), 3,09 (2H, 4), 7,13 (1H, 5), 10,76 (1H, 6), 7,31 (1H, 7), 7,04 (1H, 8), 6,96 (1H, 9), 7,58 (1H, 10), 7,98 (1H, 11), 4,46 (1H, 12), 1,94 (2H, 13), 2,44 (2H, 14), 2,02 (3H, 15), 8,35 (1H, 16), 4,45 (1H, 17), 2,85-3,00 (2H, 18), 4,22 (2H, 19), 8,51 (1H, 20), 1,83 (3H, 21).

Пример 4. Синтез полимерного носителя, содержащего фенилгидразин, на основе хлорметилированного сшитого полистирола (смола Меррифилда).

Синтез полимерного носителя проводили по следующей схеме:



BOC-NHNH-C₆H₄-CONH-CH₂-COOH. 2,52 г N-трет-бутилоксикарбонил-пара-карбоксифенилгидразина (коммерческий продукт научно-производственной фирмы "ДиОс") (10 ммоль) растворили в 10 мл диметилформамида, добавили 1,38 мл (10 ммоль) триэтиламина и раствор охладили до -10^oC. При перемешивании добавили 1,3 мл (10 ммоль) изобутилхлорформиата. Через 2 мин к реакционной смеси добавили раствор 900 мг (12 ммоль) глицина в смеси 3 мл диметилформамида и 3 мл 4 н NaOH. Реакционную смесь перемешивали 24 ч, упарили, остаток растворили в 300 мл этилацетата и промыли последовательно 1 н серной кислотой и водой до нейтральной реакции. Этилацетат упарили досуха и остаток кристаллизовали из смеси этилацетат/гексан. Выход 2,47 г (80%).

BOC--Ala-COO-CH₂polymer. 10 г сшитого хлорметилированного полистирола (смола Меррифилда (Fluka, 2% сшивки, 3,5 ммоль хлора/1 г смолы) суспендировали в 20 мл диоксана. К суспензии добавили 7,52 г (9,4 ммоль) тетрабутиламмония и 1,78 г (9,4 ммоль) BOC-b-Ala-OH. Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником 8 ч, смолу отфильтровали, промыли диоксаном, метанолом, водой, метанолом и высушили в вакуумном эксикаторе до постоянного веса. Выход 10,315 г, что составляет 0,2 ммоль присоединившейся аминокислоты на 1 г смолы.

BOC-NHNH-C₆H₄-CONH-CH₂-CONH--Ala-COO-CH₂-polymer. 1 г BOC--Ala-COO-CH₂-polymer поместили в реактор для твердофазного синтеза пептидов в ручном варианте объемом 50 мл. Добавили смесь трифторуксусная кислота/хлороформ/анизол 1: 2,5: 0,5 (v/v/v) и инкубировали 40 мин. По окончании реакции смолу промыли хлороформом, смесью хлороформ/триэтиламин 9:1, хлороформом и диметилформамидом. Добавлии 20 мл диметилформамида, 309 мг (1 ммоль) BOC-NHNH-C₆H₄-CONH-CH₂-COOH, 135 мг (1 ммоль) HOBt и 126 мг (1 ммоль) диизопропилкарбодиимида. Реакцию проводили 24 ч при перемешивании на шейкере. По окончании реакции смолу промыли диметилформамидом и хлороформом.

Пример 5. Синтез пептида на полимерном носителе (смола Меррифилда).

1 г смолы Меррифилда, содержащей фенилгидразин в качестве линкера (получен в примере 4) использовали для синтеза пептида BOC-Trp-Met-Cys(Acm)-OH. Синтез проводили аналогично примеру 2.

Пример 6. Удаление частично защищенного пептида BOC-Trp-Met-Cys(Acm)-OH с полимерного носителя (смолы Меррифилда) в растворах разного состава.

Смола Меррифилда ограниченно набухает в присутствие воды, поэтому было проведено предварительное исследование влияния состава среды на выход пептида. По 10 мг пептидил-полимера, полученного в примере 5, поместили в пробирки. Добавили диметилформамид, 20% -ную уксусную кислоту, 0,5 М CuSO₄ (раствор в воде) и воду в пропорциях, приведенных в таблице 2. Через 24 ч методом количественной ВЭЖХ определили содержание пептида (в условных единицах площади пика). Результаты приведены в табл.2.

Из табл. 2 видно, что оптимальной по составу является среда, содержащая 90% диметилформамида. Очевидно, что в среде этого состава смола Меррифилда набухает достаточно эффективно и в то же время количество воды достаточно для участия в реакции отщепления пептида.

Пример 7. Удаление частично защищенного пептида BOC-Trp-Met-Cys(Acm)-OH с полимерного носителя (смолы Меррифилда).

1 г пептидил-полимера, полученного в примере 6, суспендировали в смеси, содержащей 17 мл диметилформамида, 1 мл 1 М пиридинийацетата в диметилформамиде, 1 мл 20%-ной водной уксусной кислоты и 1 мл 0,5 М CuSO₄. Через 24 ч смолу отфильтровали и пептид выделяли из фильтрата аналогично примеру 3. Выход 2,5 мг.