способ получения полипептидов в бесклеточной системе

Формула изобретения

1. Способ получения полипептидов в бесклеточной системе, включающий приготовление реакционной смеси с использованием клеточных лизата или экстракта, по которому выбирают режим синтеза, устанавливают параметры бесклеточной системы, определяют режим обмена компонентами между реакционной и питающей смесями, выбирают тип и параметры по крайней мере одного пористого барьера, вводят реакционную и питающую смеси в реакционный модуль и проводят синтез, отличающийся тем, что на этапе выбора режима синтеза определяют тип по крайней мере одного из выбранных компонентов бесклеточной системы, который влияет на эффективность синтеза, устанавливают верхнюю и нижнюю границы диапазона концентраций выбранных компонентов, проводят синтез в условиях, когда концентрации выбранных компонентов изменяют однократно, периодически или непрерывно в выбранном диапазоне.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что по крайней мере один из выбранных компонентов входит в состав группы, состоящей из Mg²⁺, К⁺, NTP, полиаминов или их комбинаций.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в состав одной из комбинаций выбранных компонентов входят Mg²⁺ и NTP в превышающих значениях Mg²⁺ над NTP.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что режим синтеза выбирают из группы включающей трансляцию, сопряженную транскрипцию-трансляцию, транскрипцию-трансляцию проводимых в одном объеме, транскрипцию или комбинацию этих режимов.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что в зависимости от режима синтеза NTP, которые включены в состав реакционной смеси, представляют группу АТР, GTP, UTP, СТР или АТР, GТР.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что режим обмена выбирают из группы непрерывного обмена, непрерывного потока или их комбинаций.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакционную смесь готовят на основе бесклеточной системы из клеток прокариотов или эукариотов или их комбинаций.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области молекулярной биологии, в частности к синтезу белков и полипептидов в бесклеточных системах, получаемых из прокариотических и эукариотических клеток.

Синтез полипептидов и белков в бесклеточных системах трансляции первого поколения (Roberts, 1979) проводился в статическом (batch) режиме, в котором реакционная смесь находится в условиях постоянства параметров концентраций Mg²⁺, К⁺ и температуры. Для работы этих систем используют экстракты из прокариотических (Zubay, 1973) и эукариотических клеток (Roberts and Paterson, 1973; Pelham and Jackson, 1976), а также природные или синтетические мРНК (Palmenberg, 1990).

В системах второго поколения (Spirin et al., 1988) непрерывный ввод субстратов (режим CFCF) питающей смеси и вывод низкомолекулярных продуктов, ингибирующих работу бесклеточной системы, повышает время работы и выход целевого белка по сравнению с классической системой синтеза в статических (batch) условиях. Известны работы, которые были направлены на оптимизацию условий синтеза белков в CFCF режиме (Baranov and Spirin, 1993; Ryabova et al., 1998).

Одновременно с совершенствованием систем трансляции продолжались работы по совершенствованию способов получения мРНК в транскрипционных системах, включающих РНК полимеразу и ДНК. В этих системах получение мРНК зависит от концентрации РНК полимеразы и ДНК, а также от концентрации Mg²⁺, pH, NTP и от других ионных условий (Kern and Davis, 1997). Стоимость компонентов для in vitro транскрипции, включающих РНК полимеразу, ДНК и NTP достаточно велика. Поэтому необходимо проводить анализ условий транскрипции и оптимизировать процесс получения мРНК (Gurevich et al., 1991).

Известны способы синтеза полипептидов в режиме CFCF в прокариотических бесклеточных системах в условиях сопряженной транскрипции-трансляции (Baranov et al, 1989; Baranov et al., 1995; Ryabova et al., 1998) и способы синтеза в эукариотических бесклеточных системах, в которых этапы транскрипции и трансляции происходят в одном реакционном объеме (Spirin, 1992; Baranov and Spirin, 1993; Baranov et al., 1997).

Для эукариотических бесклеточных систем известно (Craig et al., 1993), что условия транскрипции и трансляции различны и в определенной степени характеризуются величиной концентрации Mg²⁺ и К⁺.

В патенте ЕР 0593757 (Baranov et al., 1997) показана возможность проведения непрерывного (CFCF) синтеза полипептидов в эукариотических бесклеточных системах транскрипции-трансляции в течение 20 часов. В течение синтеза величина концентрации Mg²⁺ поддерживается на необходимом уровне за счет постоянства концентрации Mg²⁺ в питающей смеси. Поскольку рибонуклеазная активность в реакционной системе мала и матрицы мРНК сохраняют свою активность в течение длительного времени, реакционная смесь работает с ранее и вновь синтезированными матрицами мРНК и синтезирует целевой продукт при постоянной концентрации Mg²⁺.

Для того, чтобы синтез прошел более успешно, необходимо чтобы транскрипционная составляющая системы транскрипции-трансляции производила синтез достаточного количества мРНК и для этих целей использовалось большое количество дорогостоящей полимеразы SP6 или T7 (до 30000 единиц). В тексте патента указано, что оптимальные условия синтеза должны быть подобраны в каждом конкретном случае. Для такого подбора необходимо провести несколько синтезов в статическом (batch) режиме при разных значениях концентраций Mg²⁺ и определить оптимальное значение Mg²⁺ для данного полипептида. Оптимизация процесса требует времени и является достаточно дорогостоящей процедурой.

Другой способ увеличения эффективности синтеза основан на использовании принципа непрерывного обмена (CECF режим) компонентов питающей смеси с компонентами реакционной смеси через полупроницаемый барьер за счет диффузионного процесса (Alakhov et al, 1995; Davis et al., 1996; Kim and Choi, 1996; Yamane et al., 1998).

В общем случае приведенные выше примеры описывают способы, разработанные для поддержания постоянных условий процесса синтеза. Постоянные условия синтеза обеспечивают посредством вывода низкомолекулярных продуктов синтеза, ингибирующих работу бесклеточной системы, и ввода компонентов, поддерживающих синтез. Поддержание условий синтеза осуществлялось выбором одинаковых концентраций солей Mg²⁺, К⁺, NTP и других компонентов, как в реакционной смеси, так и в питающей смеси. Для повышения выхода продукта авторы приведенных выше публикаций и патентов подбирали параметры реакционной смеси и оптимизировали процесс синтеза. Процесс оптимизации требует времени и относится к достаточно дорогостоящим процедурам.

Целью изобретения является усовершенствование способа синтеза целевых полипептидов в эукариотических и прокариотических бесклеточных системах. Изобретение основано на модификации способов синтеза в режимах непрерывного потока (CFCF) или непрерывного обмена (CECF), в которых наряду с поддержанием процесса синтеза за счет ввода в реакционную смесь компонентов, поддерживающих синтез и вывода из реакционной смеси низкомолекулярных компонентов, ингибирующих синтез, осуществляют непрерывное изменение концентрации некоторых выбранных компонентов, которые определяют эффективность синтеза (например: Mg²⁺, К⁺, NTP, полиаминов или их комбинаций) в установленном диапазоне изменения концентраций.

Изобретение поясняется чертежами:

На фиг.1 приведены диаграммы, отражающие изменение концентрации Mg²⁺ для двух примеров работы бесклеточной системы, при синтезе мРНК и при синтезе полипептидов в режиме непрерывного обмена (CECF).

На фиг.2 приведена диаграмма, отражающая процесс изменения концентрации Mg²⁺ в режиме непрерывного потока (CFCF) при изменении параметров синтеза, в диапазоне от преимущественно транскрипционных значений, до преимущественно трансляционных значений.

На фиг.3 приведена диаграмма изменения концентрации Mg²⁺ при периодическом импульсном вводе дополнительной смеси в объем реакционной смеси.

На фиг.4 приведена диаграмма периодического изменения Mg²⁺ в соответствии с формой линейного градиента.

На фиг. 5 представлено схематическое изображение реактора с одним пористым барьером.

На фиг. 6 представлено схематическое изображение реакционного модуля и направление потоков, которые формируются в режиме раздельного вывода высокомолекулярной и низкомолекулярной фракций (CFCF-BF).

На фиг.7 представлено схематическое изображение распределения потоков в режиме без вывода целевого продукта из зоны синтеза (CFCF-RP).

На фиг.8 представлено схематическое изображение реакторного модуля и распределение потоков в режиме, когда первый пористый барьер играет роль распределителя потоков питающей смеси и дополнительной смеси и целевой продукт остается в зоне синтеза (CFCF-RP).

На фиг. 9 представлено схематическое изображение реакторного модуля и распределение потоков в режиме, когда осуществляется периодическая смена направлений подачи питающей смеси поочередно через первый и второй пористые барьеры (CFCF-RF).

На фиг. 10 представлены кинетики синтеза хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT). Диаграмма P относится к синтезу в статическом (batch) режиме. Диаграмма R демонстрирует кинетику синтеза CAT в режиме трансляции и диализа (CECF).

На фиг.11 представлены кинетики синтеза CAT в условиях совмещенной транскрипции-трансляции. Диаграмма S относится к синтезу в статическом (batch) режиме. Диаграмма Т представляет кинетику синтеза CAT в совмещенной системе транскрипции-трансляции и диализном (CECF) режиме.

На фиг. 12 представлены кинетики синтеза CAT в условиях совмещенной транскрипции-трансляции с введением в реакционную смесь дополнительной смеси и изменяемой концентрацией Mg²⁺ и NTP в реакционной смеси во время синтеза. Диаграмма U относится к синтезу в статическом (batch) режиме. Диаграмма V представляет кинетику синтеза CAT в совмещенной системе транскрипции-трансляции и диализном (CECF) режиме.

На фиг. 13 показана диаграмма сравнения результатов экспериментов (6а - 6г), относящихся к синтезу целевого полипептида типа CAT.

Перечень обозначений, используемых в чертежах:

1. F10, F11, F12- потоки питающей смеси;

2. F20, F21, F22 - потоки дополнительной смеси;

3. F30, F31, F32 - потоки низкомолекулярных продуктов реакционной смеси;

4. F40 - поток высокомолекулярных продуктов реакционной смеси;

5. F50, F51, F52 - потоки высокомолекулярных компонентов, поддерживающих синтез;

6. Позиции 1-9 - относятся к входам и выходам реакторного модуля;

7. Позиции 10-19 - относятся к конструктивным элементам реактора.

Перечень сокращений, используемых в тексте:

Mg²⁺ - ион магния, добавляемый в виде соли.

К⁺ - ион калия, добавляемый в виде соли.

NTP - трифосфаты, выбираемые из группы: ATP, GTP, CTP, UTP.

1. Этапы синтеза

Синтез полипептидов в общем случае состоит из нескольких этапов. На этапе подготовки синтеза сначала создают реакционную смесь на основе клеточного лизата или экстракта, затем приготовляют питающую смесь и дополнительную смесь, в состав которой входит по крайней мере один из выбранных компонентов, который определяет эффективность синтеза. Затем выбирают режим работы реактора, тип реакционного модуля с заданными количеством и типом пористых барьеров. Далее выбирают соотношение объемов между реакционной смесью и питающей смесью и/или выбирают скорость потока питающей смеси через реакционный объем. На следующем этапе собирают установку для синтеза, в состав которой входит по крайней мере один реакционный модуль, вводят реакционную смесь и питающую смесь в соответствующие зоны реакционного модуля, разделенные друг от друга по крайней мере одним пористым барьером. При этом дополнительную смесь вводят в реакционную смесь или в одну из частей питающей смеси до синтеза или во время синтеза. На этапе синтеза в зависимости от режима работы дополнительную смесь вводят однократно, или периодически, или непрерывно. В режиме препаративного синтеза расходуемые высокомолекулярные компоненты вводят в реакционную смесь однократно, или периодически, или непрерывно. Синтезированный продукт отбирают из реакционной смеси в конце синтеза или в ходе синтеза. При отборе продукта в процессе синтеза осуществляют анализ синтезируемого продукта, корректируют параметры, определяющие продуктивность системы.

2. Подготовка реакционных смесей

Бесклеточные системы создаются на основе клеточных лизатов и клеточных экстрактов и включают в себя все компоненты, необходимые для синтеза белков, а также систему регенерации NTP, буфер и соли, аминокислоты. Известно большое число типов бесклеточных систем для синтеза полипептидов в прокариотических и эукариотических системах (Joyce, 1998).

Одним из компонентов бесклеточной системы транскрипции-трансляции должна быть ДНК зависимая РНК полимераза, синтезирующая мРНК. Используемая ДНК зависимая РНК полимераза выбирается из класса Е. coli РНК полимераз или бактериофаговых РНК полимераз. Данное изобретение рассматривает, но не ограничивает использование полимераз типа T1, T3, T5; T7, SP6, A16, PHL1, PHL11. Наиболее подходящими являются T7 и SP6 полимеразы.

3. Условия проведения синтеза

Предлагаемый способ не требует проведения дополнительных экспериментов, связанных с измерением концентрации Mg²⁺ и устраняет противоречие, возникающее в известных способах, при определении оптимальных значений Mg²⁺ и К⁺ в сопряженных системах транскрипции-трансляции, в которых значения Mg⁺ для оптимума транскрипции и оптимума трансляции различны. Во время синтеза наряду с вводом в реакционную смесь компонентов, поддерживающих синтез, и выводом из реакционной смеси низкомолекулярных компонентов, ингибирующих синтез, происходит непрерывное изменение концентрации по крайней мере одного из выбранных компонентов (входящих в следующую группу: Mg²⁺, K⁺, NTP, полиамины или комбинаций указанных компонентов) от верхней до нижней границы установленного диапазона.

Выбор верхней и нижней границы диапазона зависит от режима синтеза, от параметров бесклеточного экстракта, от параметров реакционной смеси и параметров питающей смеси. Если Mg²⁺ входит в состав выбранных компонентов, то границы области, из которой выбираются все диапазоны изменения концентраций Mg²⁺ для разных режимов (включающих транскрипцию, транскрипцию-трансляцию, трансляцию), лежат в пределах от 0,25 до 50 mM добавленного Mg²⁺.

Если в качестве одного из компонентов бесклеточной системы используют ДНК зависимую РНК полимеразу, то в режиме транскрипции мРНК выбор верхней и нижней границы для конкретного диапазона изменения концентрации Mg²⁺ осуществляют из области значений от 2 до 50 mM добавленного Mg²⁺. Если синтез белка производят в условиях транскрипции-трансляции, то выбор верхней и нижней границы конкретного диапазона изменения концентрации Mg²⁺ осуществляют из области значений от 2 до 25 mM добавленного Mg²⁺. При синтезе белка в условиях трансляции выбор верхней и нижней границы конкретного диапазона изменения концентрации Mg²⁺ осуществляют из области значений от 0,25 до 25 mM добавленного Mg²⁺. Возможны варианты, при которых верхнюю и нижнюю границы диапазона изменений концентрации Mg²⁺ выбирают таким образом, что в процессе синтеза за счет смены величины концентраций происходит смена условий синтеза и переход от одного режима (например преимущественной транскрипции) к другому режиму (например режиму транскрипции-трансляции или преимущественной трансляции). Приведенные выше примеры отражают лишь области значений, в которых могут лежать концентрации одного из выбранных компонентов Mg²⁺, требуемые по условиям синтеза. Ширина выбираемых диапазонов и верхняя и нижняя границы диапазона определяются с учетом знаний, относящихся к условиям синтеза в прокариотических и эукариотических бесклеточных системах.

Дополнительной целью данного изобретения является снижение затрат на синтез заданного количества полипептида в эукариотических бесклеточных системах. В известных способах синтез осуществляют в условиях достаточно большой концентрации дорогостоящей T7 полимеразы, при непрерывном протоке через реакционный объем дорогостоящих компонентов питающей смеси, таких как NTP и аминокислоты (Baranov et al. , 1997). В данном изобретении эффективность синтеза в системах транскрипции- трансляции повышается за счет того, что введение в реакционную смесь высокой концентрации Mg²⁺ и NTP в начале синтеза приводит к уменьшению количества абортивных мРНК, что, в свою очередь, приводит к снижению расхода ATP, GTP и аминокислот во время этапа трансляции за счет снижения синтеза абортивных полипептидов.

Приведенные в данном изобретении примеры использования принципа непрерывного потока питающей смеси через реакционный объем (CFCF) ориентированы на снижение затрат при препаративном синтезе целевых полипептидов. Поток питающей смеси и концентрации выбранных компонентов легко регулируются с помощью изменения скорости или направления потока с использованием насоса. Другие технические решения с использованием режима непрерывного обмена (CECF) и простых диализаторов также позволяют увеличить эффективность синтеза за счет поддержания концентраций расходуемых низкомолекулярных компонентов и одновременного изменения концентрации выбранных компонентов. Известно, что скорость обмена низкомолекулярными компонентами между реакционной смесью и питающей смесью через диализную мембрану зависит от многих параметров (площадь, размер пор и др.). Это накладывает некоторые ограничения на выбор режимов синтеза и выбор верхней и нижней границы зоны, в которой изменяют концентрацию выбранных компонентов. Так, например, при использовании режима CECF более предпочтительно осуществлять синтез в отдельных режимах: транскрипции, трансляции, транскрипции-трансляции, или в комбинациях двух режимов (например, транскрипции и транскрипции-трансляции или транскрипции-трансляции и трансляции). Это вызвано тем обстоятельством, что процесс обмена из-за достаточно низкой скорости требует времени и может не соответствовать скорости, которая необходима для ввода требуемых для синтеза низкомолекулярных компонентов, и вывода низкомолекулярных продуктов синтеза, ингибирующих работу бесклеточной системы.

На фиг. 1 представлены два примера изменения концентрации Mg²⁺ в реакционной смеси для разных режимов синтеза. Первый пример относится к случаю, когда необходимо провести синтез мРНК в режиме транскрипции. Как видно из диаграммы (К), диапазон изменений концентраций выбранных компонентов от верхнего уровня (A) до уровня (C) лежит в пределах, в которых в реакционной смеси за счет высокой концентрации Mg²⁺ и NTP создаются условия преимущественной транскрипции и синтеза мРНК. В этой зоне первоначальное превышение концентрации Mg²⁺ над NTP устанавливают при подготовке реакционной смеси в пределах до 10 mM. Дальнейшее снижение концентрации обеспечивает переход системы к значениям концентраций Mg²⁺ и NTP соответствующим параметрам верхней границы зоны транскрипции-трансляции (зона C - D). В качестве второго примера (диаграмма L) выбраны условия, когда верхний предел диапазона концентраций Mg²⁺ и NTP соответствует верхней границе зоны транскрипции-трансляции (зона C - D), а нижний предел диапазона совпадает с нижней границей зоны трансляции (зона D-В). В этом случае за время синтеза условия в реакционной смеси изменяются от преимущественно транскрипционных до преимущественно трансляционных. Параметры пористого барьера (размеры пор, площадь мембраны, тип мембраны) и скорость потока питающей смеси вдоль поверхности пористого барьера должны быть выбраны с учетом скорости диффузии и обмена низкомолекулярных компонентов питающей смеси и реакционной смеси и должны обеспечивать требуемую скорость обмена и изменение концентраций Mg²⁺ и NTP за время синтеза. На выбор верхней и нижней границы диапазона влияют параметры бесклеточного экстракта, который может быть получен разными способами. На свойства реакционной смеси оказывает влияние процентное соотношение в смеси экстракта и питающей смеси. Устанавливая верхний и нижний пределы диапазона, в котором в процессе синтеза изменяют концентрации выбранных компонентов, регулируют эффективность работы бесклеточной системы в разных режимах.

Режим непрерывного потока (CFCF) позволяет осуществить быструю смену скорости и направление потока питающей смеси через реакционную смесь и, таким образом, регулировать скорость изменения концентраций выбранных компонентов на разных этапах синтеза. В течение одного эксперимента можно выбрать разные скорости потока питающей смеси через реакционную смесь. Это позволяет в процессе синтеза полипептидов в бесклеточной системе транскрипции-трансляции независимо регулировать длительность разных этапов, в течение которых параметры реакционной смеси и концентрации выбранных компонентов соответствуют периодам: преимущественной транскрипции, транскрипции-трансляции и трансляции. Таким образом, выбор конкретных параметров диапазонов, в которых изменяют концентрацию выбранных компонентов, зависит от: цели проведения синтеза (синтез мРНК или синтез целевого полипептида или сопряженный синтез в системе транскрипции-трансляции); выбранных условий проведения синтеза (и, в первую очередь, от параметров бесклеточного экстракта); выбора параметров пористых барьеров (размеры пор, площади и типы мембран); возможности введения дополнительных расходуемых высокомолекулярных компонентов. Величина верхнего предела всей допустимой области значений концентрации Mg²⁺ (из которой выбирают рабочий диапазон), в режиме (CFCF) для синтеза в системах транскрипции-трансляции с использованием ДНК зависимой РНК полимеразы, может быть выбрана в пределах до 50 mM Mg²⁺. Минимальное значение нижнего значения области концентрации Mg²⁺ может составлять значение 0,25 mM Mg²⁺.

На фиг. 2 в качестве примера представлена зависимость (М) изменения концентрации Mg²⁺ от времени для синтеза в системе транскрипции - трансляции. Регулируя скорость потока питающей смеси на первом этапе синтеза (период t₁ - t₂), возможно корректировать количество синтезируемых мРНК и предотвратить их перепроизводство. Высокая концентрация Mg²⁺ и NTP в начале первого периода (t₁ - t₂) дает возможность снизить количество дорогостоящей РНК полимеразы за счет того, что синтез мРНК идет с меньшим количеством абортивных мРНК. Соотношение концентраций Mg²⁺ и NTP выбирается таким, чтобы на первом этапе концентрация Mg²⁺ превышала концентрацию NTP на величину от 5 до 10 mM, а на третьем этапе превышение Mg²⁺ над NTP составляло не менее 0,5 mM.

В процессе длительного синтеза в режиме CFCF величины концентраций выбранных компонентов изменяют от верхнего до нижнего уровня однократно или периодически. На фиг. 3 приведены диаграмма (N) изменения концентраций Mg²⁺ и NTP при периодическом импульсном вводе дополнительной смеси в объем реакционной смеси. Весь синтез разбивается на N шагов с длительностью шага от t₄ до t₆. Дополнительная смесь вводится за время t₄ - t₅. Концентрации Mg²⁺ и NTP повышаются, проходят уровень C и условия синтеза в реакционной системе, входят в зону A-C, в которой происходит преимущественная транскрипция мРНК. Снижение концентраций Mg²⁺ и NTP меняет параметры синтеза от условий транскрипции-трансляции (зона C-D) до условий преимущественной трансляции (зона D-B).

Препаративный синтез целевых полипептидов часто требует длительного времени, в течение которого в реакционную смесь вводят не только низкомолекулярные компоненты питающей смеси, но и дополнительно вводят высокомолекулярные компоненты, поддерживающие длительный синтез. В группу высокомолекулярных компонентов входят: рибосомная фракция, бесклеточный экстракт (S30, S100 и их модификации), полимеразы, плазмиды, тРНК. В зависимости от условий синтеза высокомолекулярные компоненты вводят в реакционный объем однократно, или непрерывно, или периодически. Такие компоненты, как полимеразы и плазмиды предпочтительно вводить в реакционную смесь одновременно с вводом максимальной концентрации Mg²⁺ и NTP на этапе транскрипции. Ввод рибосомной фракции предпочтительно синхронизировать с периодом трансляции.

На фиг. 4 приведены диаграмма (О) изменения концентраций Mg²⁺ и NTP при формировании в течение синтеза линейного градиента концентраций этих компонентов. Примеры формирования линейных градиентов широко известны и используются, например, в жидкостной хроматографии. Предпочтительно использовать данный режим для проведения препаративного синтеза целевого полипептида в системе трансляции мРНК. В этом режиме значения концентраций Mg²⁺ и NTP, входящих в общий диапазон изменения концентраций (E-F), должны быть соотнесены с диапазоном, в котором значения концентраций Mg²⁺ и NTP наиболее близко расположены к оптимуму трансляции мРНК. Диапазон допустимых значений концентраций Mg²⁺ и NTP может быть определен для известных типов экстрактов из литературных источников или из технических описаний, прилагаемых фирмами. Некоторое снижение эффективности трансляции в зонах, прилегающих к границам диапазона (E-F), компенсируется многократным проходом условий синтеза через зону оптимума при периодическом изменении концентраций Mg²⁺ и NTP в соответствии с формой линейного градиента. Как и в ранее рассмотренном случае, весь синтез разбивается на N шагов с длительностью шага от t₇ до t₉. На первом промежутке времени t₇ - t₈ дополнительная смесь, содержащая высокий уровень концентраций Mg²⁺ и NTP, смешивается с питающей смесью таким образом, что концентрация Mg²⁺ и NTP в суммарной смеси растет. Суммарная смесь вводится в реакционную смесь и изменяет условия синтеза. Одновременно с этим она поддерживает синтез и выводит из реакционного объема низкомолекулярные компоненты, ингибирующие синтез. При изменении соотношений смешиваемых объемов и уменьшении ввода дополнительной смеси по отношению к питающей смеси происходит снижение уровня концентраций Mg²⁺ и NTP в суммарной смеси. Концентрации Mg²⁺ и NTP в реакционной системе снижаются и проходят через участок зоны (E-F), в которой происходит максимальный синтез. Ввод в реакционный объем дополнительных высокомолекулярных компонентов, поддерживающих синтез, осуществляют в зависимости от условий синтеза непрерывно или периодически.

Аналогичным способом можно осуществлять управление и процессом препаративной транскрипции для наработки достаточного количества мРНК. Отличия от известных технических решений для синтеза мРНК в статическом (batch) режиме и способов, в которых осуществляют подпитку (fed batch) статических систем транскрипции без вывода низкомолекулярных продуктов (Kern and Davis, 1997), состоят в том, что: а) за счет вывода низкомолекулярных компонентов, ингибирующих синтез мРНК, продляется процесс синтеза и увеличивается выход мРНК; б) за счет выбора нижней границы диапазона, в котором находятся концентрации Mg²⁺ и NTP, можно получать препараты мРНК в условиях, способствующих дальнейшему этапу трансляции синтезируемой мРНК без дополнительных процедур очистки; в) использование высоких концентраций Mg²⁺ (например, до 50 mM) приводит к снижению выхода абортивных или неполных молекул мРНК и позволяет снизить количество дорогостоящей РНК полимеразы.

4. Реакторный модуль

Обеспечить рассмотренные режимы работы можно путем соответствующего выбора варианта конструкции реакционного модуля. Внутри реакционного модуля с помощью пористых барьеров создают реакционный объем и по крайней мере одну зону для ввода компонентов питающей смеси, дополнительной смеси, высокомолекулярных компонентов, поддерживающих синтез, и вывода продуктов, ингибирующих синтез, и продуктов синтеза.

В простейшем случае объем реакционного модуля разделяется на две зоны: (а) в режиме CECF, объем разделяется одним пористым барьером на зону с реакционной смесью и зону с питающей средой; (б) в режиме CFCF, объем разделяется пористым барьером на зону с реакционной смесью, в которую вводят питающую смесь, и зону отбора продуктов синтеза (Alakhov et al., 1995).

Известны реакторы, в которых формируют три зоны (Dzewulski et al., 1992; Alakhov et al., 1995; Bauer et al., 1999): зону ввода питающей смеси, зону с реакционной смесью и зону вывода продуктов синтеза. Такое размещение зон вызывалось необходимостью поддержания постоянных условий синтеза. В данном изобретении эффективность синтеза обеспечивается, с одной стороны, за счет поддержания в реакционной смеси постоянного состава аминокислот и ряда других компонентов и за счет активного (в режиме CFCF) или пассивного (в режиме CECF) регулирования величины концентраций выбранных компонентов. Это условие в значительной степени определяет выбор конструкции реакторов, предназначенных для разных режимов. Наибольшее количество применений обеспечивает конструкция реактора с двумя пористыми барьерами, которые формируют три зоны в объеме реактора. Количество зон может быть большим в зависимости от конструктивных особенностей реакторного модуля.

Величина объема реакционной смеси зависит от условий и цели проведения синтеза. Известно (Thompson et al., 1994), что для исследовательских целей синтез осуществляют в микрообъемах. Синтез в препаративном масштабе (Baranov et al., 1997) производят в реакторах с объемом от 1,0 мл. Для осуществления синтеза в исследовательских целях минимальный реакционный объем выбирают в пределах от 50 до 500 мкл. Синтез в препаративном количестве ведут в одном или нескольких реакционных модулях с объемом от 500 мкл до 10 мл. Количество реакционных объемов, входящих в реактор, может лежать в диапазоне от 1 до 10 в зависимости от использования типов реакторных модулей.

В каждой точке реакционного объема должно одновременно осуществляться три процесса: а) ввод питающей среды; б) отвод низкомолекулярных продуктов, ингибирующих процесс синтеза; в) формирование временного изменения концентраций выбранных компонентов, определяющих эффективность процесса синтеза. Предпочтительной является конструкция модуля реактора, в которой осуществляют формирование тонких слоев реакционной смеси любой формы. Толщину слоя выбирают из условия, что непрерывный обмен компонентов реакционной смеси и питающей смеси или поток питающей смеси через реакционную смесь также как и удаление низкомолекулярных продуктов, ингибирующих синтез, должно происходить за время, в течение которого синтез не снижается ниже допустимого уровня. Реакционная смесь может быть помещена в объем любой формы, который формируется между поверхностями пористых барьеров. При использовании полых волокон, плоских мембран или их комбинаций форма реакционного объема может быть или цилиндрической, или выполнена в виде плоского слоя с толщиной от 0,1 до 5 мм. Внутренние объемы реакционной смеси и питающей смеси могут перемешиваться или за счет создания циркуляции реакционной смеси по замкнутой петле с использованием насоса (Mozayeni, 1995), или за счет встряхивания реактора (Choi, 1997), или с помощью магнитной мешалки (Kim and Choi, 1996). Объем реакционной смеси может предварительно заполняться различного рода сепараторами или наполнителями органического и неорганического происхождения. В качестве таковых могут быть использованы пористые, слоистые, капиллярные материалы, выбираемые из группы: а) фильтров из синтетических полимерных или неорганических материалов, б) пористых металлов или их композиции, в) гелеобразных структур. Введение пористых материалов с размерами пор от 10 мкм до 0,1 мм в реакционную смесь позволяет увеличить площадь, на которой происходит соударение молекул, что в конечном итоге ведет к возрастанию скорости реакций, связанных с синтезом (Alberts et al., 1983). В группу материалов кроме полимерных материалов, неорганических оксидов, цеолитов (Choi, 1997) могут входить сорбенты, используемые для хроматографии, в том числе и аффинные (Maier et al., 1998), с помощью которых можно выделить из реакционной системы целевой синтезируемый полипептид. Использование пористых материалов любого типа ограничивается лишь их химической активностью и возможностью ингибирования синтеза.

Пористые барьеры, такие как мембраны, полые волокна и другие пористые структуры, должны обеспечивать обмен компонентов между питающей смесью и реакционной смесью или играть роль распределителей потоков питающей смеси через реакционный объем. Нет ограничений, связанных с одновременным использованием в реакторе пористых барьеров разных типов (мембраны, полые волокна) и разных типов материалов (твердых или твердых в комбинации с гелеобразными структурами). Пористые барьеры могут быть использованы в виде однослойных или многослойных конструкций, включая использование разных материалов.

Приведенные в описании конструктивные варианты, связанные с размещением пористых барьеров друг относительно друга, могут быть модифицированы в другие варианты на основе известных знаний.

Ниже приводятся примеры вариантов формирования потоков (питающей смеси, дополнительной смеси или их комбинаций) в реакторных модулях для осуществления эффективного синтеза в режиме непрерывного обмена (CECF) или режиме непрерывного потока (CFCF).

Пример 1. На фиг. 5 представлено схематическое изображение реактора 10 с одним пористым барьером 11, который разделяет общий объем реакционного модуля на две части. В одной части объема 14, ограниченной поверхностью пористого барьера 11, размещают реакционную смесь, которую вводят через вход 1. Во вторую часть объема 15 через вход 2 вводят питающую смесь, которая соприкасается с поверхностью пористого барьера 11. Пористый барьер может иметь плоскую или цилиндрическую формы. В первом случае используют диализные или ультрафильтрационные мембраны, выполненные в виде диска, квадрата или прямоугольника. Во втором случае используют полые волокна или диализные мешки. Инкубацию реакционной смеси проводят при температуре, лежащей в диапазоне от 20 до 40^oC. Температурный диапазон, предпочтительный для экстракта пшеницы, лежит в диапазоне от 20 до 26^oC, для ретикулоцитного лизата используют диапазон от 28 до 38^oC, при работе с экстрактом E-coli выбирают температурный диапазон в пределах от 20 до 38^oC. Для повышения эффективности обмена между питающей смесью и реакционной смесью создают тангенциальные потоки вдоль внутренней и внешней поверхности мембраны.

Для режима CECF параметры пористого барьера выбирают из условий вывода из реакционного объема только низкомолекулярных компонентов (размеры пор лежат в диапазоне до 30 kD), или одновременно низкомолекулярных и высокомолекулярных компонентов (размеры пор выбирают в пределах от 30 до 100 kD). Входы 1 и 2 в реакторный модуль могут быть герметично закрыты в процессе синтеза или открыты и в двух частях реакционного объема автоматически поддерживается одинаковое давление. Это позволяет в процессе синтеза вводить в реакционную или в питающую смесь субстраты, поддерживающие синтез, или дополнительно изменять концентрацию выбранных компонентов независимо от процесса диффузии. Перед началом синтеза выбирают соотношение объемов реакционной и питающей смесей в пределах от 1/5 до 1/100 и соответственно выбирают соответствующий тип реакционного модуля по характеристикам объема, размера пор и площади диализной мембраны.

Синтез полипептидов в аналитических целях проводится в микрореакторах с реакционным объемом от 50 мкл. Синтез полипептидов в препаративных количествах, с реакционным объемом до 50 мл, накладывает свои условия на способ синтеза и конструкцию реактора. Ниже рассматриваются варианты, которые могут быть выполнены с помощью одноканальных и многоканальных реакторов, в том числе и с разделением потоков внутри реакционного объема. Варианты пористых барьеров, их параметры, толщина слоя реакционной смеси во многом аналогичны рассмотренным ранее вариантам.

Конструкции реакторов, используемые в проточном режиме (CFCF), должны обеспечивать ввод в реакционный объем не только питающей смеси, в которую входят низкомолекулярные компоненты, но и ввод высокомолекулярных компонентов непосредственно в реакционный объем или через пористый барьер. Последний выполняет функцию распределителя потока и имеет размер пор до 5000 kD, через которые свободно проникает большинство компонентов, входящих в S30 экстракт, исключая рибосомы и образованные вокруг нее комплексы. Примеры с 2 по 5 относятся к использованию предлагаемого способа синтеза полипептидов в режиме непрерывного потока (CFCF), а пример 6 относится к синтезу полипептидов в режиме непрерывного обмена (CECF).

Пример 2. Синтез в режиме непрерывного ввода питающей смеси с разделением выходных потоков на фракции, содержащие высокомолекулярные и низкомолекулярные компоненты синтеза (CFCF-BF), позволяет концентрировать синтезируемый полипептид внутри реакционной смеси за счет независимого регулирования выходных потоков. На фиг. 6 представлено схематическое изображение реакционного модуля и направление потоков, которые формируются в режиме раздельного вывода высокомолекулярной F40 и низкомолекулярной F30 фракций. Реакционный модуль имеет корпус 10, два пористых барьера 11 и 12, которые формируют реакционный объем 14, расположенный между внутренними поверхностями пористых барьеров и две зоны 15 и 16 для ввода/вывода жидкостных коммуникаций, которые контактируют с внешней поверхностью пористых барьеров. Подготовленная реакционная смесь вводится в реакционный объем через вход 1. На этот же вход в процессе синтеза подают: (а) питающую смесь F10; (б) дополнительную смесь F20; (в) фракцию высокомолекулярных компонентов F50. Подачу питающей смеси на вход 1 осуществляют непрерывно или периодически. Дополнительную смесь F20 и фракцию высокомолекулярных компонентов F50 подают в реакционную смесь в зависимости от условий синтеза однократно, периодически или непрерывно. Фракцию высокомолекулярных компонентов F50 вводят в реакционный объем независимо от питающей смеси F10, или высокомолекулярные компоненты предварительно смешивают с питающей смесью. Синтез может быть осуществлен без ввода фракции F50. Перед началом синтеза выбираются соотношения между объемами вводимых по условиям эксперимента фракций питающей смеси, дополнительной смеси и высокомолекулярной фракции по отношению к объему реакционной смеси и скорости потока этих фракций через реакционный объем. Размер пор первого пористого барьера 11 выбирают, исходя из молекулярного веса и размеров целевого полипептида в пределах от 30 до 100 kD, размер пор второго пористого барьера 12 выбирают в пределах до 30 kD. В зависимости от выбранного режима синтеза выбирают соотношение объемов, проходящих через первый и второй пористые барьеры в пределах от 1/1 до 1/100.

Пример 3. На фиг. 7 приведено схематическое изображение потоков в реакторе, в котором первый и второй пористые барьеры имеют одинаковый или разный размер пор, лежащий в пределах до 30 kD. В этом случае синтез происходит без вывода высокомолекулярной фракции F40 и целевого продукта из зоны синтеза (CFCF-RP), а потоки F31 и F32 содержат только низкомолекулярные компоненты синтеза. Данный режим используют в тех случаях, когда синтезируемый полипептид превышает величину 80-100 kD или когда накопление синтезируемого полипептида в реакционном объеме не ингибирует процесс синтеза. Режимы ввода питающей смеси, дополнительной смеси и фракции с высокомолекулярными компонентами аналогичны режиму CFCF-BF.

Пример 4. Пористые барьеры можно использовать как распределители потоков питающей смеси и дополнительной смеси в тех случаях, когда объем, в который вводится реакционная смесь, заполнен пористыми структурами и перемешивание реакционного объема затруднено или невозможно.

На фиг. 8 приведена структурная схема реакторного модуля и направление потоков в режиме CFCF-RP, в котором первый пористый барьер играет роль распределителя потока питающей смеси F10 и дополнительной смеси F20. Размеры пор первого пористого барьера 11 выбираются в пределах до 5000 kD. Это позволяет вводить через первый пористый барьер часть фракции высокомолекулярных компонентов F51, если размеры компонентов, включенных во фракцию F51, меньше размеров пор первого барьера. К таким компонентам относятся тРНК, ферменты и др. При необходимости рибосомную фракцию F52 вводят в реакционный объем 14 непосредственно через жидкостной вход 1. Параметры второго пористого барьера выбираются в пределах до 30 kD. Поток низкомолекулярных компонентов синтеза F30, ингибирующих работу системы, выводится через выход 5.

Пример 5. На фиг. 9 приведено схематическое изображение потоков для режима CFCF-RF, в котором осуществляется периодическая смена направлений подачи питающей среды через первый и второй пористые барьеры. В этом режиме, предназначенном для длительного синтеза полипептидов, переключение направлений подачи питающей смеси позволяет очищать поры первого 11 и второго 12 пористых барьеров. Синтез проводят или без вывода высокомолекулярных продуктов из объема реактора (размер пор первого и второго барьеров выбирается одинаковым и лежит в диапазоне до 30 kD), или в режиме с отбором части синтезируемого продукта из реакционного объема (размер пор первого пористого барьера выбирают до 100 kD, а размер второго пористого барьера до 30 kD). Поток высокомолекулярных компонентов F50 вводится через вход 1 в реакционный объем. В процессе синтеза формируют N шагов ввода питающей смеси и дополнительной смеси. Каждый шаг разбивают на два периода. В течение первого периода с помощью жидкостных кранов резервуары с питающей смесью и дополнительной смесью подключают к входу 2. Потоки питающей смеси F11 и поток дополнительной смеси F21 вводят в зону 16, которая сформирована поверхностью первого пористого барьера 11. Через поры первого пористого барьера питающая и дополнительная смеси вводятся в зону синтеза 14 реактора и через поры второго пористого барьера 12 из зоны синтеза низкомолекулярные компоненты синтеза выводятся в зону 15 и далее формируют поток 32, который выводят за пределы реактора через выход 5. После окончания первого периода краны переключаются и подключают резервуары с питающей смесью и дополнительной смесью к входу 3, который сопряжен с зоной 15, которая сформирована вторым пористым барьером 12. Потоки F12, F22 через поры второго пористого барьера проникают в реакционную смесь и одновременно очищают поры второго барьера, которые закрылись на первом шаге синтеза. Низкомолекулярные компоненты выводятся из реакционного объема через поры первого пористого барьера и формируют поток F31, который выводится из реактора через выход 4. Регулируя длительности первого и второго периодов ввода потоков питающей и дополнительной смеси в реакционный объем через первый или второй пористые барьеры, изменяют объемное соотношение потоков F31 и F32.

Пример 6. Синтез хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CAT) в режиме непрерывного обмена (CECF) в системе трансляции и в двух вариантах совмещенных систем транскрипции-трансляции.

Известно, что транскрипция с кольцевой и линейной формы ДНК фаговыми полимеразами проводится при разных условиях, в частности с разной концентрацией Mg²⁺. К линейной форме ДНК матрицы могут быть отнесены как плазмиды, линеаризованные ферментами рестрикции, так и продукты PCR. При использовании продуктов PCR нет необходимости вовлекать живые клетки для получения генетических конструкций (например, в случае экспрессии генов, кодирующих либо нестабильные, либо токсичные продукты (Marteyanov et al., 1997). Кроме того, использование PCR для получения матрицы позволяет более быстро и удобно модифицировать ее конструкцию на генетическом уровне: а) вводить элементы, стабилизирующие структуру РНК (например, высокоструктурированные участки, элементы RQ РНК, терминаторы транскрипции и т.д.); б) вводить элементы, усиливающие экспрессию гена (например энхансеров, не транслируемых лидеров и т. п. ); в) осуществлять ввод кодирующих маркерных последовательностей (например ввод эпитопов, ТАГов для афинного выделения и т.д.).

Метод позволяет варьировать интенсивность транскрипции и с кольцевых плазмид, которые могут быть по ряду причин в суперскрученной форме или в форме релаксированного кольца. Для различных полимераз эти формы представляют собой матрицы, эффективность которых зависит от Mg²⁺.

Ниже рассматривается пример применения рассматриваемого метода для случая использования кольцевых плазмид при синтезе CAT в совмещенной системе транскрипции-трансляции, на основе экстракта из зародышей пшеницы.

Для сравнения эффективности предлагаемого способа с известными способами использовали несколько реакционных смесей. На основе первой реакционной смеси создали трансляционную смесь и проводили синтез CAT, используя приготовленные ранее мРНК. Во втором варианте добавляли в реакционную смесь компоненты для транскрипции мРНК и создали условия для совмещенной транскрипции-трансляции. В третьем варианте в реакционную смесь, подготовленную для синтеза в условиях совмещенной транскрипции-трансляции, вводили дополнительную смесь из выбранных компонентов, в качестве которых использовали Mg²⁺ и NTP. Дополнительные компоненты вводили в реакционную смесь до синтеза.

а) Синтез CAT в бесклеточной системе трансляции.

Приготавливали реакционную смесь для трансляции мРНК в соответствии с данными, приведенными в таблице 1. В состав смеси входит экстракт из зародышей пшеницы.

Питающую смесь приготавливали в соответствии с данными, приведенными в таблице 2.

В данном примере использовался диализатор, изготовленный из диализного мешка диаметром 8 мм фирмы Union carbide Corp. с рабочим объемом 100 мкл. Объем питающей смеси составлял 1 мл. Для сравнения эффективности синтеза общая реакционная смесь разделялась на два объема. 30 мкл реакционной смеси помещали в микроцентрифужную пробирку, а 100 мкл помещали в диализатор. Устанавливали диализатор и микропробирку в термостатируемый объем и проводили синтез при температуре 25^oC. В процессе синтеза из микропробирки и диализного мешка отбирали аликвоты по 5 мкл для определения кинетики синтеза в статическом (batch) режиме и в режиме непрерывного обмена (CECF). Количество синтезируемого полипептида определяли методом осаждения синтезируемого полипептида на стеклянный волокнистый фильтр трихлоруксусной кислотой с последующим счетом радиоактивности в жидкостном сцинтилляционном счетчике. На фиг. 10 приведены кинетики синтеза. Диаграмма Р относится к синтезу в статическом (batch) режиме. Диаграмма R представляет кинетику синтеза CAT в трансляционных условиях в режиме CECF.

б) Синтез CAT в системе совмещенной транскрипции-трансляции

Приготавливали реакционную смесь в соответствии с данными, приведенными в таблице 3. Совмещенная система транскрипции/трансляции содержит плаздмиду рСАТ enhancer, содержащую ген хлорамфеникол ацетилтрансферазы (CAT) под промотором SP6 полимеразы.

Питающую смесь готовили в соответствии с данными, приведенными в таблице 4. Для поддержания процесса транскрипции в питающую смесь вводили CTP и UTP.

Параметры синтеза (температура, объем реакционной смеси и питающей смеси, тип диализатора) выбирали одинаковыми с приведенными в примере 6a (синтез CAT в системе трансляции). Результаты синтеза анализировали также как и в примере 6a.

На фиг. 11 приведены кинетики синтеза CAT в совмещенной системе транскрипции-трансляции. Диаграмма S относится к синтезу в статическом (batch) режиме. Диаграмма Т представляет кинетику синтеза CAT в условиях транскрипции-трансляции в режиме CECF.

в) Синтез CAT в системе совмещенной транскрипции-трансляции при непрерывном изменении концентрации Mg²⁺, NTP в реакционной смеси во время синтеза.

Реакционную смесь (в которую перед началом синтеза включили дополнительную смесь, состоящую из выбранных компонентов Mg²⁺ и NTP) готовили в соответствии с данными, приведенными в таблице 5.

Питающую смесь готовят в соответствии с данными, приведенными в таблице 6.

Параметры синтеза (температура, объем реакционной смеси и питающей смеси, тип диализатора) выбирали аналогичными приведенным в примере 6a (синтез CAT в системе трансляции). Анализировали результаты синтеза таким же способом, который приведен в примере 6a.

На фиг. 12 приведены кинетики синтеза CAT в совмещенной системе транскрипции-трансляции, в которую в начале синтеза включили дополнительную смесь из выбранных компонентов Mg²⁺ и NTP. Диаграмма U относится к синтезу в статическом (batch) режиме. Диаграмма V представляет кинетику синтеза CAT в реакционной смеси, в которую перед началом синтеза ввели дополнительную смесь Mg²⁺ и NTP и провели синтез в условиях совмещенной транскрипции-трансляции в режиме CECF с изменяемыми концентрациями Mg²⁺ и NTP в реакционной смеси во время синтеза.

На фиг. 13 представлена диаграмма, на которой сравниваются результаты экспериментов синтеза целевого полипептида CAT. Данные взяты из примеров 6 а-в и представляют выход CAT (в мкг/мл) в разных режимах: а) статического (batch) режима в условиях совмещенной транскрипции-трансляции (пример 6б, полоса W), б) трансляции (пример 6a, полоса X), в) совмещенной транскрипции-трансляции (пример 6б, полоса Y), г) совмещенной транскрипции-трансляции с изменяемыми параметрами концентрации Mg²⁺ и NTP в реакционной смеси (пример 6в, полоса Z). Сравнение результатов показывает, что наибольший выход полипептида CAT (32 мкг/мл) получен в режиме совмещенной транскрипции-трансляции с изменяемыми от максимальных до минимальных значений концентрациями Mg²⁺ и NTP.

Изобретение можно использовать в исследовательской и прикладной практике для синтеза полипептидов в бесклеточной системе на основе экстрактов эукариотических и прокариотических клеток. Описанный способ позволяет исследователю оптимизировать не только весь процесс синтеза в целом, но исследовать вклад отдельных компонентов в поддержание синтеза на отдельных этапах транскрипции, транскрипции-трансляции и трансляции.

Источники информации

Alakhov J. В. et al. Method of preparing polypeptides in a cell-free translation system. US Patent 5478730, US Cl. 435/68.1 (26.12.1995).

Alberts В. et al. Molecular biology of the cell. New York, London, p. 133 (1983).

Baranov V.I. et al. Gene expression in a cell-free system on the preparative scale. Gene 84 : 463-466 (1989).

Baranov V. I. et al. Method for obtaining polypeptides in a cell-free system. EP Patent 0593757, Int. Cl. C12P 21/00 (15.01.1997).

Baranov V.I. et al. Method for preparative expression of genes in a cell-free system of conjugated transcription/translation. EP Patent 0401369, Int. Cl. C12P 21/00 (31.05.1995).

Baranov V.I., Spirin A.S. Gene expression in cell-free system on preparative scale. From: "Methods in Enzym." Vol. 217 "Recombinant DNA", Part H, Edit. R. Wu, Academic Press p.p. 123-142 (1993).

Bauer H. et al. Verfahren und forrichtung zur Durchfuhrung biochemicher Reactionen. DE Patent Applic. 19832160.0 Al, Int. Cl. C 12 M 1/12 (04.02.1999).

Choi С. et al. Method producing protein in a cell-free system. US Patent 5593856, US Cl. 435/68.1 (14.01.1997).

Craig D. et al. Plasmid cDNA- directed protein synthesis in a coupled eukaryotic in vitro transcription-translation system, Nucl. Acids Res. V. 20, No. 19: 4987-4995 (1993).

Davis J. et al. Large scale dialysis reactions using E. Coli S30 extract systems Promega Notes N 56:14-20 (1996).

Dziewulski D. et al. Three compartment bioreactor and method of use. US Patent 5135853, US Cl. 435/04 (04.04.1992).

Gurevich V. et al. Preparative in - Vitro mRNA Synthesis Using SP6 and T7 RNA Polymerases. Analyt. Biochem. 195: 207-213 (1991).

Joice G. F. Coupled isothermal polynucleotide amplification and translation system. US Patent 5807717, U.S. Cl 435/091.1 (15.09.1998).

Kern J. A. , Davis R.H. Application of solution equilibrium analysis to in-vitro RNA transcription. Biotechnol. Prog., 13: 747-756 (1997).

Kirn D. M., Choi C.Y. A semicontinuous prokaryotic coupled transcription/translation system using a dialysis membrane. Biotechnol. Prog., Sep., 12: 645 - 649 (1996).

Martemyanov К. A. et al. Direct expression of PCR products in a cell-free transcription/translation system: synthesis of antibacterial peptide cecropin. FEBS Letters 414, 268-270 (1997).

Maier Т. et al. Strep-tag II affinity purification: an approach to study intermediates of metalloenzyme biosynthesis. Anal. Biochem. 259:1, 68-73 (1998).

Mozayeni B.R. Apparatus and process for continuous in vitro synhesis of proteins. US Patent 5434079, US Cl. 435/311 (07.18.1995).

Palmenberg A. C. et al. Translation enhancer. US Patent 4937190, US Cl. 435/69.1 (26.06.1990).

Pelham H. R. B. , Jackson R.J. An efficient mRNA- dependent translation system from reticulocyte lysates. Eur. J. Biochem.V. 67: 247-256 (1976).

Roberts В. E. Protein translation method. US Patent 4668624, US Cl. 435/68 (28.03.1979).

Roberts В. E. , Paterson B.M. Efficient translation of tobacco mosaic virus RNA and rabbit globin 8S RNA in a cell-free system from commercial wheat germ. Proc. Natl. Acan. Sci. U.S.A. 70: 2330-2334(1973).

Ryabova L. A. et al. Continuous-flow cell-free translation, transcription-translation, and replication-translation systems. From: "Methods in Molecular Biology" Vol. 77 "Protein Synthesis: Methods and Protocols", Edit. R. Martin, Humana Press Inc. Totowa, NJ p.p. 179- 193 (1998).

Spirin A.S. Cell-Free Protein Synthesis Bioreactor. From: "Frontiers in Bioprocessing II", Edit. Todd P. et al, Amer. Chemic. Soc. p.p. 31 - 43 (1992).

Spirin A.S. et al. A Continuous Cell-Free Translation System Capable of Producing Polypeptides in High Yeld. Science, 242: 1162-1164 (1988).

Thompson D.V. et al. Coupled transcription and translation in eukaryotic Cell-free extract. US Patent 5324637, US Cl. 435/68.1 (28.06.1994).

Yamane T. et al. Synthesis of protein by cell-free protein synthetic system and apparatus therefor. JP Patent 10080295, IPC Cl. C 12 P 21/00 (31.03.1998).

Zubay G. In vitro synthesis of protein in microbial systems. Annu. Rev. Genet. 7: 267-287 (1973).