ферментативно отщепляемые линкеры для твердофазных синтезов

Формула изобретения

1. Ферментативно отщепляемый линкер, связанный с твердой фазой, выбранной из группы, включающий керамику, стекло, латекс, сшитые поперечными связями полистиролы, сшитые поперечными связями полиакриламиды или другие смолы, природные полимеры, силикагели, аэрогели и гидрогели, на котором по функциональной группе синтезируют органические соединения, отличающийся тем, что линкер содержит место, узнаваемое гидролитическим ферментом, и при реакции с ферментом распадается так, что в синтезированном продукте не остается никаких участков молекулы линкера, причем данное место, узнаваемое ферментом, выбрано из группы, включающей сложноэфирные связи, амидокислотные связи, простые эфирные связи, сложноэфирные связи в эфирах фосфорной кислоты и гликозидные связи, и что узнаваемое ферментом место и место, при котором высвобождается продукт синтеза посредством распада линкера, являются различными.

2. Линкер по п.1, отличающийся тем, что линкер отщепляется от синтезированного на твердой фазе продукта при отщеплении двуокиси углерода.

3. Линкер по п.1 или 2, отличающийся тем, что гидролитический фермент выбран из группы, включающей липазы, эстеразы, амидазы, протеазы, пептидазы, фосфатазы, фосфолипазы, пероксидазы или гликозидазы.

4. Линкер по одному из пп.1-3, отличающийся тем, что он представляет собой соединение общей формулы I



в которой - спейсер с длиной, соответствующей длине 1-30 метиленовых групп;

R - водород, или инертный в условиях реакции остаток, или два соседних инертных остатка R, которые вместе образуют ароматическое, гетероароматическое или алифатическое кольцо;

R¹ - замещенный или незамещенный алкил с 1-20 атомами углерода, алкенил с 3-20 атомами углерода, алкинил с 3-6 атомами углерода, алкилкарбонил с 1-20 атомами углерода в алкиле, алкилфосфорил с 1-20 атомами углерода, алкенилкарбонил с 3-20 атомами углерода в алкениле, алкинилкарбонил с 3-6 атомами углерода в алкиниле, алкенилфосфорил с 3-20 атомами углерода, алкинилфосфорил с 3-6 атомами углерода, циклоалкил с 3-20 атомами углерода, циклоалкилкарбонил с 3-20 атомами углерода в циклоалкиле, циклоалкилфосфорил с 3-20 углеродными атомами, арил, арилкарбонил, арилфосфорил гетарил, гетарилкарбонил, гетарилфосфорил, гликозил, замещенные или незамещенные аминокислоты или пептиды;

R² - нуклеофуг, представляющий собой удаляемую группу, такую, как галоген;

n = 1 или 2.

5. Способ получения ферментативно отщепляемого линкера, связанного с твердой фазой, включающий связывание линкера посредством сложноэфирной связи, простой эфирной связи, амидной связи, аминосвязи, сульфидной или фосфатной фазы с твердой фазой, выбранной из группы, включающей керамику, стекло, латекс, сшитые поперечными связями полистиролы, сшитые поперечными связями полиакриламиды или другие смолы, природные полимеры, силикагели, аэрогели и гидрогели, отличающийся тем, что связыванию с твердой фазой подвергают соединения формулы II



где спейсер с длиной, соответствующей длине 1-30 метиленовых групп;

R - водород, инертный в условиях реакции остаток или два соседних инертных остатка R, которые вместе образуют ароматическое, гетероароматическое или алифатическое кольцо;

R¹ - замещенный или незамещенный алкил с 1-20 атомами углерода, алкенил с 3-20 атомами углерода, алкинил с 3-6 атомами углерода, алкилкарбонил с 1-20 атомами углерода в алкиле, алкилфосфорил с 1-20 атомами углерода, алкенилкарбонил с 3-20 атомами углерода в алкениле, алкинилкарбонил с 3-6 атомами углерода в алкиниле, алкенилфосфорил с 3-20 атомами углерода, алкинилфосфорил с 3-6 атомами углерода, циклоалкил с 3-20 атомами углерода, циклоалкилкарбонил с 3-20 атомами углерода в циклоалкиле, циклоалкилфосфорил с 3-20 углеродными атомами, арил, арилкарбонил, арилфосфорил, гетарил, гетарилкарбонил, гетарилфосфорил, гликозил, замещенные или незамещенные аминокислоты или пептиды;

Х - СОО, О, NR³, S, OPO(OR⁴)-O, где R³ и R⁴ независимо друг от друга - водород, алкил с 1-8 атомами углерода;

n = 1 или 2,

и получаемый продукт формулы III



где - указанная твердая фаза;

R, R¹ и n имеют указанные значения,

подвергают взаимодействию с соединениями формулы IV



где Y и R² одинаковы или различны и означают нуклеофуг, представляющий собой удаляемую группу, такую, как галоген.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к ферментативно отщепляемым линкерам для твердофазных синтезов и к способу их получения.

Для современного исследования биологически активных веществ разрабатывают множество молекулярных тест-систем, как, например, анализы связывания рецепторов, ферментативные анализы и анализы клеток и клеточных взаимодействий. Автоматизация и миниатюризация этих тест-систем делают возможным тестирование все большего числа химических соединений на их биологическое действие при случайном скрининге и тем самым на возможное применение в качестве требуемой структуры для биологически активного вещества в медицине, ветеринарии или для защиты растений.

Классическая синтетическая химия превратилась в результате этих разработок в лимитирующий фактор в исследованиях по поиску биологически активных веществ.

Когда полностью используется производительность разработанных тест-систем, эффективность химического синтеза биологически активного вещества должна значительно повыситься.

Такому требуемому повышению эффективности может способствовать комбинаторная химия, в частности, когда она использует автоматизированные методы твердофазного синтеза (см., например, обзор в J.Med.Chem. 1994, 37, 1233 и 1994, 37, 1385).

Принцип таких комбинаторных синтезов заключается в том, что на каждом этапе синтеза реакция проходит не только с одним структурным элементом, а с несколькими либо параллельно, либо в смеси. На каждом этапе образуются все возможные комбинации таким образом, что при относительно малом числе структурных звеньев уже после нескольких стадий возникает большое число продуктов, так называемая библиотека субстанций.

Твердофазный синтез имеет то достоинство, что легко могут быть удалены побочные продукты и избыточные реагенты, так что не требуется никакой очистки продуктов. При большом избытке растворенного, участвующего в реакции вещества реакции ускоряются и могут быть оптимизированы. Готовые продукты синтеза могут подвергаться массовому скринингу непосредственно, то есть соединенными с носителем, или после отщепления твердой фазы. Промежуточные продукты также могут испытываться при массовом скрининге.

Ранее описанные применения ограничивались в основном областью пептидов и нуклеотидов (Lebl и др., Int. J. Pept. Prot. Res. 41, 1993: 203 и международная заявка на патент 92/00091) или их производными (международная заявка на патент 96/00391). Поскольку пептиды и нуклеотиды в качестве фармацевтических препаратов применимы только ограниченно из-за их неблагоприятных фармакологических свойств, желательно использовать известные из химии пептидов и нуклеотидов испытанные способы твердофазного синтеза для синтетической органической химии.

В патенте США 5288514 сообщается об одном из первых комбинаторных твердофазных синтезов в органической химии не в области химии пептидов и нуклеотидов. Патент США 5288514 описывает последовательный твердофазный синтез 1,4-бензодиазепинов.

В международных заявках на патенты 95/16712, 95/30642 и 96/00148 описываются другие твердофазные синтезы потенциальных биологически активных веществ в комбинаторной химии.

Чтобы можно было полностью использовать возможности современных тест-систем для массового скрининга, необходимо, однако, подвергать постоянно массовому скринингу новые соединения по возможности с большими структурными различиями. Такой подход позволяет значительно уменьшить время на идентификацию и оптимизацию новой основной структуры биологически активного вещества.

Поэтому необходимо постоянно разрабатывать новые различные комбинаторные твердофазные синтезы.

Для этих новых синтезов важно, чтобы отдельные структурные элементы твердофазного синтеза оптимально друг с другом взаимодействовали. Посредством выбора твердой фазы, как, например, стекло, керамика или смола, а также линкера оказывается решающее влияние на последующее проведение химических превращений на носителе.

Чтобы можно было осуществить возможно больший спектр органических синтезов на твердой фазе, имеется большая потребность в разработке новых твердых фаз, а также новых линкерных или анкерных групп.

До сих пор применялись неустойчивые к основаниям или кислотам линкерные группы, условия отщепления которых являются слишком жесткими для многих синтезируемых на носителе веществ. Поэтому предпринимаются большие усилия, чтобы создать линкеры, которые могут отщепляться от твердой фазы в мягких условиях.

При этом было бы желательно, чтобы можно было использовать фермент для отщепления линкера в мягких условиях, как это уже возможно в отдельных случаях для защитных групп. Пример ферментативно отщепляемой защитной группы описывает Waldmann и др. в Angew. Chem. 1995, 107, 20: 2425-2428.

Elmore и др. описывают первый ферментативно отщепляемый линкер для твердофазного пептидного синтеза (J. Chem. Soc., Chem. Commun., том 14, 1992: 1033-1034), который может быть отщеплен от носителя в мягких условиях. Другой ферментативно отщепляемый линкер в случае твердофазного синтеза сахаров описывается Schuster и др. (J. Am. Chem. Soc., 1994, 116: 1135-1136 и в патенте США 5369017).

Недостатком обоих способов является то, что после ферментативного отщепления в продукте всегда остаются части линкера. Оба способа, кроме того, сильно ограничены ферментом, отщепляющим данный линкер, так Elmore применяет для отщепления фосфодиэстеразу из селезенки теленка, а Schuster и др. описывают применение серинпротеаз для отщепления.

Задачей изобретения является разработка отщепляемого в мягких условиях линкера, который лишен указанных выше недостатков и делает возможной широкую палитру органических синтезов на твердой фазе.

Поставленная задача решается ферментативно отщепляемым линкером, связанным с твердой фазой, выбранной из группы, включающий керамику, стекло, латекс, сшитые поперечными связями полистиролы, сшитые поперечными связями полиакриламиды или другие смолы, природные полимеры, силикагели, аэрогели и гидрогели, на котором по функциональной группе синтезируют органические соединения за счет того, что линкер содержит место, узнаваемое гидролитическим ферментом, и при реакции с ферментом распадается так, что в синтезированном продукте не остается никаких участков молекулы линкера, причем данное место, узнаваемое ферментом, выбрано из группы, включающей сложноэфирные связи, амидокислотные связи, простые эфирные связи, сложноэфирные связи в эфирах фосфорной кислоты и гликозидные связи, и что узнаваемое ферментом место, при котором высвобождается продукт синтеза посредством распада линкера, являются различными.

Поставленная задача также решается способом его получения, который будет более подробно пояснен ниже.

Предпочтительный линкер характеризуется общей формулой I



в которой изменяющиеся величины и заместители имеют следующие значения:

означает спейсер с длиной, соответствующей длине 1-30 метиленовых групп,

R означает водород или инертный в условиях реакции остаток или два соседних инертных остатка R, которые вместе образуют ароматическое, гетероароматическое или алифатическое кольцо,

R¹ означает замещенный или незамещенный алкил с 1-20 атомами углерода, алкенил с 3-20 атомами углерода, алкинил с 3-6 атомами углерода, алкилкарбонил с 1-20 атомами углерода в алкиле, алкилфосфорил с 1-20 атомами углерода, алкенилкарбонил с 3-20 атомами углерода в алкениле, алкинилкарбонил с 3-6 атомами углерода в алкиниле, алкенилфосфорил с 3-20 атомами углерода, алкинилфосфорил с 3-6 атомами углерода, циклоалкил с 3-20 атомами углерода, циклоалкилкарбонил с 3-20 атомами углерода в циклоалкиле, циклоалкилфосфорил с 3-20 углеродными атомами, арил, арилкарбонил, арилфосфорил, гетарил, гетарилкарбонил, гетарилфосфорил, гликозил, замещенные или незамещенные аминокислоты или пептиды,

R² означает нуклеофуг, представляющий собой удаляемую группу, такую как галоген,

n = 1 или 2.

Линкерами по изобретению являются линкеры, которые содержат место, узнаваемое гидролитическим ферментом, и при реакции с ферментом распадаются так, что линкер полностью отщепляется от связанного на твердой фазе посредством линкера синтезированного продукта, то есть в синтезированном продукте не остается никаких частей молекулы линкера.

Предпочтительно линкер отщепляется от синтезированного на твердой фазе продукта при отщеплении двуокиси углерода.

Под местом, узнаваемым ферментом (Е), имеют в виду связь, расщепляемую гидролитическим ферментом. Расщепляемыми гидролитическими ферментами связями являются, например, такие связи, как сложноэфирные, амидокислотные связи, простые эфирные связи, сложноэфирные связи в эфирах фосфорной кислоты или гликозидные связи.

В качестве ферментов для расщепления линкера согласно изобретению в мягких условиях годятся гидролитические ферменты, как, например, липазы, эстеразы, амидазы, протеазы, пептидазы, фосфатазы, фосфолипазы, пероксидазы или гликозидазы. Предпочтительно ферменты выбирают из группы, включающей липазы, эстеразы, амидазы, протеазы или гликозидазы, особенно предпочтительны липазы, эстеразы или гликозидазы.

Например, линкеры согласно изобретению представлены формулой V (схема А).

Схема А



причем заместители и изменяющиеся величины имеют следующие значения:

означает твердую фазу, с которой связан линкер,

означает спейсер с длиной, соответствующей длине 1-30 метиленовых групп,

- место, узнаваемое гидролитическим ферментом,

К - центральная структура линкера,

Z - функциональная группа, при которой высвобождается продукт,

R² - нуклеофуг, представляющий собой удаляемую группу, с которой связываются целевые продукты.

Через центральную структуру линкера соединены узнаваемое ферментом место спейсер через которого линкер связан с твердой фазой , и место Z, при котором высвобождается продукт.

Для построения линкера в молекуле должны содержаться, как минимум, три функциональные группы или должно быть возможным их введение в центральную молекулу. По этим функциональным группам соединяются узнаваемое ферментом место , спейсер , через который линкер связан с твердой фазой и функциональная группа, при которой продукт связывается с линкером Z. Помимо этого не имеется никаких ограничений в отношении химического строения центрального линкера.

Центральная структура линкера может быть построена из при необходимости замещенных алифатических, ароматических или гетероароматических структур или их комбинаций. Предпочтительно центральная структура линкера содержит ароматические структуры, например фенильное или нафтильное кольцо.

Линкер помимо твердой фазы, спейсера, места, узнаваемого ферментом, и функциональной группы, при которой высвобождается продукт (сердцевина линкера), содержит группу, являющуюся нуклеофугом, представляющий собой удаляемую группу R², по которой происходит присоединение продуктов синтеза.

Линкер делает возможным мягкое и селективное отщепление продуктов синтеза от носителя без разрушения или изменения продуктов синтеза.

При этом для ферментативного отщепления продукта от линкера годится область значений рН от 2,0 до 10,0, предпочтительны рН от 4,0 до 8,0, а также пригодны температуры от -10^oС до 100^oС, предпочтительно от 15^oС до 50^oС. Отщепление может быть осуществлено в водном растворе или в почти чистом растворителе со следами воды. Предпочтительно проводить отщепление, когда доля растворителя составляет от 10 до 50 мас.%.

Для построения линкера на твердой фазе последнюю при необходимости модифицируют известными специалисту способами.

Линкер в зависимости от того, какая должна применяться твердая фаза, связывается с твердой фазой посредством сложноэфирной связи, простой эфирной связи, амидной связи, аминосвязи, сульфидной или фосфатной связи.

Связывание с твердой фазой при этом осуществляется известным способом.

Так, например, присоединение к смоле Меррифилда или к 2-хлортритильной смоле соединений со свободными гидроксильными группами описывается P.M. Worster и др. (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1979, 18, 221 и след. стр.) или C. Chen и др. (J. Am. Chem. Soc. 1994, 116, 2661-2662).

Присоединение посредством аминосвязи описывается, например, М. Cardno и др. (J. Chem. Soc., Chem. Commun. 1995, 2163 и след. стр.) для 2-хлортритильной смолы, Е. Вауеr (Angew. Chem. 1991, 103, 117 и след. стр.) для карбоксисмолы Нова Син TG, J. R. Hanske и др. (Tetrahedron Lett., 1995, 36, 1589-1592) для ванг-смолы или смолы тентагель S РНВ.

Присоединение к носителю по тиольной группе описывается, например, Reynolds и др. (патент США 5324483) для смолы Меррифилда.

Названные здесь примеры присоединений хорошо известные специалисту, приводятся здесь только как примеры реакций, специалисту известны и другие возможности присоединения (лит.: Каталог по комбинаторной химии фирмы Калбайекем-Новабайекем, февраль 1996, 1-26 и S1-S24).

В случае предпочтительного линкера общей формулы I распад линкера происходит путем расщепления по узнаваемому ферментом месту с помощью, например, таких ферментов, как липазы, эстеразы, амидазы, протеазы или гликозидазы. Путем ферментативного расщепления линкера сначала образуется фенолят, который далее самопроизвольно распадается до связанного с твердой фазой хинометина и двуокиси углерода. При этом высвобождается продукт, не содержащий никаких остатков линкера.

В случае предпочтительного линкера формулы I имеется в виду фенилогический ацеталь. Другие линкеры по изобретению могут также содержать производные от него винилогические или нормальные ацетали (см. реакцию 2).

Пригодные линкеры по изобретению распадаются после ферментативного расщепления, например, с образованием лактама или лактона и таким образом высвобождают продукт без остатков линкера. Следующие реакции 1 и 2 (см. в конце описания) должны, например, продемонстрировать эти общие принципы распада.

Эти наглядно представленные в реакциях 1 и 2 принципы распада не ограничиваются указанными там местами, узнаваемыми ферментами, например липазами или амидазами.

Линкеры по изобретению отличаются пространственным расстоянием между узнаваемым ферментом местом и местом, при котором высвобождается продукт путем распада линкера, то есть узнаваемое ферментом место и место, при котором высвобождается продукт, являются различными. Вследствие этого стерическое нарушение ферментативной реакции с помощью субстрата далее существенно исключено. Полезно, когда расстояние между узнаваемым ферментом местом и местом высвобождения продукта выражается количеством единиц метиленовых групп от 2 до 8, предпочтительно от 4 до 8.

Линкеры по изобретению полностью отщепляются от продукта в мягких условиях с помощью большого числа ферментов и остаются на твердой фазе.

В качестве твердой фазы могут применяться для линкеров по изобретению в принципе все носители, которые, например, известны для твердофазных пептидных синтезов или синтезов нуклеиновых кислот.

Пригодные твердые фазы могут состоять в зависимости от того, насколько они совместимы с используемой синтетической химией в комбинаторике и с прикреплением линкера к твердой фазе, из большого числа материалов. Размер твердой фазы может в зависимости от материала варьироваться в широких рамках. Предпочтительно применяют в качестве твердой фазы размером от 1 мкм до 1,5 см, особенно предпочтительны в случае полимерных носителей частицы между 1 мкм и 150 мкм. Подходят также и гели.

Форма твердой фазы является любой, предпочтительны сферические частицы, причем она может быть в зависимости от распределения по размерам гомогенной или гетерогенной, предпочтительны одинаковые размеры частиц.

Могут также при необходимости применяться смеси различных частиц.

Материалы твердой фазы, которые мало или почти несжимаемы, являются предпочтительными по сравнению с сжимаемыми материалами, когда, например, отделение связанного носителем продукта должно проводиться посредством центрифугирования или синтез продукта должен проводиться в проточных реакторах, то есть полезнее, чтобы используемые твердые фазы обладали бы определенной устойчивостью к сжатию и благоприятными седиментационными свойствами.

Преимуществом является также высокая износостойкость примененных твердых фаз при более длительной механической нагрузке.

Подходящим твердым фазам следовало бы быть пористыми материалами, как, например, спеченное стекло, порошковые металлы, пористая керамика или смолы, которые имеют большую внутреннюю поверхность в области от 5 до 2000 м²/г материала носителя, предпочтительно от 40 до 800 м²/г, особо предпочтительно от 50 до 500 м²/г. Диаметр пор материала следовало бы предпочтительно выбирать так, чтобы не возникали никакие ограничения транспорта вещества путем диффузии или путем активного течения вещества.

Целесообразно, чтобы диаметр пор был между 10 нм и 500 нм, предпочтительно между 30 нм и 200 нм.

Полезно, чтобы примененные материалы твердых фаз имели бы возможно большой объем пор (> 1 мл/г материала носителя).

Могут быть использованы природные неорганические или органические материалы.

Подходящими твердыми фазами (Р) являются, например, функционализированные частицы, выбранные из группы, включающей керамику, стекло, латекс, сшитые поперечными связями полистиролы, сшитые поперечными связями полиакриламиды или другие смолы, природные полимеры, золото, коллоидные металлические частицы, силикагели, аэрогели или гидрогели.

Линкеры могут быть связаны на поверхности твердой фазы, или на внутренней части твердой фазы, или на обеих.

Под латексами подразумевают коллоидные дисперсии полимеров в водных средах.

При этом может идти речь о природных или синтетических латексах или микролатексах, которые были, например, получены при эмульсионной полимеризации подходящих мономеров или путем диспергирования полимеров в подходящих растворителях.

Под сшитыми поперечными связями полистиролами, поперечно сшитыми полиакриламидами или другими смолами подразумевают, например, полиакриламид, полиметакриламид, полигидроксиэтилметакрилат, полиамид, полистирол, сополимеры (мет)акрилата, например, (мет)акриловой кислоты, сложных эфиров (мет)акриловой кислоты и/или итаконовой кислоты, кротоновой кислоты, малеиновой кислоты, пенополиуретанов, эпоксидных смол или другие сополимеры.

В качестве природных полимеров или твердых фаз следует, например, назвать агарозу, целлюлозу, альгинат, хитозан, декстран, леван, ксантан, коллаген, геллан, Х-карагинан, агар, пектин, раманиан, древесную щепу, микрокристаллическую целлюлозу, гексозамин или желатину.

Также подходящими твердыми фазами являются диатомовая земля, кизельгур, окиси металлов или керамзит.

Выбор подходящей твердой фазы зависит от химических превращений с целью соединения линкера с твердой фазой и проводимых затем синтезов. Группы, не совместимые с такими химическими реакциями, защищают известными для специалистов способами.

Для выбора подходящей твердой фазы важно, кроме того, то, чтобы твердая фаза предпочтительно не содержала групп, или ионов, или других молекул, которые при отщеплении линкера наносят вред примененным ферментам, при необходимости эти группы следует до или после синтеза удалить, защитить, вымыть или инактивировать.

Если это невозможно, можно при необходимости решить эту проблему путем использования большего количества фермента.

Чтобы сделать возможным присоединение линкера к твердой фазе, выбирают твердую фазу, которая функционализирована подходящим способом или может быть функционализирована известным специалисту образом.

Предпочтительными подходящими твердыми фазами являются, например, хлорбензильная смола (смола Меррифилда), ринк-смола (фирма Новабайекем), зибер-смола (Новабайекем), ванг-смола (фирма Бачем), тентагель-смолы (фирма Рапп-полимеры), пега-смола (фирма Полимер Лаборэторис) или полиакриламиды. 9-Флуоренилметилоксикарбониламиноксантен-3-илокси-смола Меррифилда, фенилаланинол-2-хлортритильная смола, 5-нитроантраниловая кислота-2-хлортритильная смола или гидразин-2-хлортритильная смола также используются как носители.

Особенно предпочтительными подходящими твердыми фазами являются фазы с аминогруппой для присоединения линкера, как, например, полиакриламиды, пега-смолы, тентагель S-NH₂, аминометил-полистирол, 4-метилбензгидриламиносмола (МБГА-смола), НовасинТG аминосмола, 4-(2",4"-диметоксифенил-/9-флуоренилметилоксикарбонил/аминометил) феноксиацетамидонорлейциламинометильная смола, 4-(2", 4"-диметоксифенил-/9-флуоренил-метилоксикарбонил/аминометил) феноксиацетамидонорлейцил-МБГА-смола, 4-(2",4"-диметоксифенил-/9- флуоренилметилоксикарбонил/аминометил)фенокси-смола, - флуоренилметилоксикарбониламиноксантен-3-илокси-смола Меррифилда, фенилаланинол-2-хлортритильная смола, пролинол-2-хлортритильная смола, 5-нитроантраниловая кислота-2-хлортритильная смола или гидразин-2-хлортритилькая смола.

Под спейсером в соединениях общих формул I, II и III имеют в виду спейсер с длиной, соответствующей длине от 1 до 30 метиленовых групп. Спейсер может иметь любое строение. Полезно установить с помощью длины спейсера такое расстояние между центральной структурой линкера и твердой фазой, чтобы примененные ферменты могли оптимально отщепить линкер.

Если реакционноспособная группа, по которой спейсер прикреплен к твердой фазе, уже находится на каком-то расстоянии в пространстве по отношению к твердой фазе, как, например, в случае Нова Син TG бром-смолы (слабо сшитая полистирольная смола с полиэтиленгликолевыми хвостами с молекулярной массой 3000-4000, функционализированная по концам бромом) через полиэтиленгликолевые цепочки или в случае ринк-амид-МБГА-смолы [4-(2",4"-диметоксифенил-/9-флуоренилметилоксикарбонил/аминометил)фенокси- ацетамидонорлейцил-4-метилбензгидриламиносмола], тогда можно выбрать спейсер соответственно короче. Если эта реакционноспособная группа находится непосредственно на носителе, выгоднее выбрать спейсер соответственно длиннее. Спейсер может иметь любую структуру, имеющую подчиненное значение. Целесообразно, чтобы входящие в структуру группы, а также имеющиеся при необходимости заместители не принимали, однако, участия в проводимых химических синтезах.

Основной каркас или основа спейсера может, например, состоять из одной при необходимости замещенной полиметиленовой цепочки, которая вместо одной или нескольких метиленовых групп содержит такие остатки, как гетероатомы, например азот, кислород, серу, фосфор, олово или кремний, или при необходимости замещенные алифатические или ароматические кольца или циклические системы, которые при необходимости могут содержать другие гетероатомы, например азот, серу или кислород.

Комбинации названных остатков могут также содержаться в основном каркасе спейсера.

Спейсер соединяется с твердой фазой, как минимум, по одной связи, выбранной из группы, включающей сложноэфирную связь, простую эфирную связь, амидную связь, аминосвязь, сульфидную или фосфатную связи.

В качестве остатка R в соединениях формулы I, II и III следует упомянуть водород, или какой-нибудь инертный к условиям реакции остаток, или два соседних инертных остатка R, которые вместе могут образовать ароматическое, гетероароматическое или алифатическое кольцо. Под инертными остатками подразумеваются любые алифатические, ароматические или гетероароматические остатки или смеси этих остатков.

В качестве алифатических остатков следует, например, назвать замещенный при необходимости алкил с 1-8 углеродными атомами, алкенил с 2-8 углеродными атомами, алкинил с 3-6 углеродными атомами или циклоалкил.

В качестве алкильных остатков следует назвать разветвленные или неразветвленные алкильные цепочки с 1-8 атомами углерода, как, например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, н-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метилпропил, 1-этил-2-метилпропил, н-гептил или н-октил.

В качестве алкенильных остатков следует назвать разветвленные или неразветвленные алкенильные цепочки с 3-8 атомами углерода, как, например, пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 2-метилпропенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-пентенил, 4-пентенил, 1-метил-1-бутенил, 2-метил-1-бутенил, 3-метил-1-бутенил, 1-метил-2-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 3-метил-2-бутенил, 1-метил-3-бутенил, 2-метил-3-бутенил, 3-метил-3-бутенил, 1,1-диметил-2-пропенил, 1,2-диметил-1-пропенил, 1,2-диметил-2-пропенил, 1-этил-1-пропенил, 1-этил-2-пропенил, 1-гексенил, 2-гексенил, 3-гексенил, 4-гексенил, 5-гексенил, 1-метил-1-пентенил, 2-метил-1-пентенил, 3-метил-1-пентенил, 4-метил-1-пентенил, 1-метил-2-пентенил, 2-метил-2-пентенил, 3-метил-2-пентенил, 4-метил-2-пентенил, 1-метил-3-пентенил, 2-метил-3-пентенил, 3-метил-3-пентенил, 4-метил-3-пентенил, 1-метил-4-пентенил, 2-метил-4-пентенил, 3-метил-4-пентенил, 4-метил-4-пентенил, 1,1-диметил-2-бутенил, 1,1-диметил-3-бутенил, 1,2-диметил-1-бутенил, 1,2-диметил-2-бутенил, 1,2-диметил-3-бутенил, 1,3-диметил-1-бутенил, 1,3-диметил-2-бутенил, 1,3-диметил-3-бутенил, 2,2-диметил-3-бутенил, 2,3-диметил-1-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил, 2,3-диметил-3-бутенил, 3,3-диметил-1-бутенил, 3,3-диметил-2-бутенил, 1-этил-1-бутенил, 1-этил-2-бутенил, 1-этил-3-бутенил, 2-этил-1-бутенил, 2-этил-2-бутенил, 2-этил-3-бутенил, 1,1,2-триметил-2-пропенил, 1-этил-1-метил-2-пропенил, 1-этил-2-метил-1-пропенил, 1-этил-2-метил-2-пропенил, 1-гептенил, 2-гептенил, 3-гептенил, 4-гептенил, 5-гептенил, 6-гептенил, 1-октенил, 2-октенил, 3-октенил, 4-октенил, 5-октенил, 6-октенил или 7-октенил.

Под алкинилами подразумевают алкинильные остатки с 3-6 атомами углерода, как, например, проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил, н-бут-1-ин-1-ил, н-бут-1-ин-3-ил, н-бут-1-ин-4-ил, н-бут-2-ин-1-ил, н-пент-1-ин-1-ил, н-пент-1-ин-3-ил, н-пент-1-ин-4-ил, н-пент-1-ин-5-ил, н-пент-2-ин-1-ил, н-пент-2-ин-4-ил, н-пент-2-ин-5-ил, 3-метилбут-1-ин-3-ил, 3-метилбут-1-ин-4-ил, н-гекс-1-ин-1-ил, н-гекс-1-ин-3-ил, н-гекс-1-ин-4-ил, н-гекс-1-ин-5-ил, н-гекс-1-ин-6-ил, н-гекс-2-ин-1-ил, н-гекс-2-ин-4-ил, н-гекс-2-ин-5-ил, н-гекс-2-ин-6-ил, н-гекс-3-ин-1-ил, н-гекс-3-ин-2-ил, 3-метилпент-1-ин-1-ил, 3-метилпент-1-ин-3-ил, 3-метилпент-1-ин-4-ил, 3-метилпент-1-ин-5-ил, 4-метилпент-1-ин-1-ил, 4-метилпент-2-ин-4-ил или 4-метилпент-2-ин-5-ил.

В качестве циклоалкильных остатков следует назвать разветвленные или неразветвленные циклоалкильные цепочки с 3-10 атомами углерода и с 3-7 углеродными атомами в кольце, которое может также содержать такие гетероатомы, как сера, азот или кислород, или циклические системы, как, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, 1-метилциклопропил, 1-этилциклопропил, 1-пропилциклопропил, 1-бутилциклопропил, 1-пентилциклопропил, 1-метил-1-бутилциклопропил, 1,2-диметилциклопропил, 1-метил-2-этилциклопропил, циклооктил, циклононил или циклодецил.

В качестве заместителей речь идет об одном или нескольких инертных заместителях, как, например, галоген, алкил, арил, алкоксигруппа, бензилоксигруппа или бензил.

Под ароматическими остатками имеют в виду простые или конденсированные циклические системы. Предпочтительными остатками являются фенил или нафтил.

Полезно, когда гетероароматическими остатками являются простые или конденсированные ароматические циклические системы с одним или несколькими гетероароматическими 3-7-членными кольцами. В качестве гетероатомов в кольце или в циклической системе могут содержаться один или несколько атомов азота, серы и/или кислорода.

В качестве заместителей в ароматических или гетероароматических остатках имеются в виду один или несколько заместителей, как, например, галоген, алкил, арил, алкоксигруппа, бензилоксигруппа или бензил.

Два расположенных рядом остатка R могут вместе образовать ароматическое, гетероароматическое или алифатическое, при необходимости замещенное 4-8-членное кольцо.

Изменяющаяся величина n в соединениях формул I, II и III имеет значение один или два.

Для R¹ в соединениях формул I, II и III следует назвать в качестве остатков замещенный или незамещенный алкил с 1-20 атомами углерода, алкенил с 3-20 атомами углерода, алкинил с 3-6 атомами углерода, алкилкарбонил с 1-20 атомами углерода в алкиле, алкилфосфорил с 1-20 атомами углерода, алкенилкарбонил с 3-20 атомами углерода в алкениле, алкинилкарбонил с 3-6 атомами углерода в алкиниле, алкенилфосфорил с 3-20 атомами углерода, алкинилфосфорил с 3-6 атомами углерода, циклоалкил с 3-20 атомами углерода, циклоалкилкарбонил с 3-20 атомами углерода в циклоалкиле, циклоалкилфосфорил с 3-30 атомами углерода, арил, арилкарбонил, арилфосфорил, гетарил, гетарилкарбонил, гетарилфосфорил, гликозил, замещенные или незамещенные аминокислоты или пептиды, причем алкил означает разветвленные или неразветвленные алкильные цепочки с 1-20 атомами углерода, как, например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, н-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметилпропил, 1-этил-1-метилпропил, 1-этил-2-метилпропил, н-гептил, н-октил, н-нонил, н-децил, н-ундецил, н-додецил, н-тридецил, н-тетрадецил, н-пентадецил, н-гексадецил, н-гептадецил, н-октадецил, н-нонадецил или н-эйкозенил;

- алкенил означает разветвленные или неразветвленные алкенильные остатки с 3-20 углеродными атомами, как, например, пропенил, 1-бутенил, 2-бутенил, 3-бутенил, 2-метилпропенил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-пентенил, 4-пентенил, 1-метил-1-бутенил, 2-метил-1-бутенил, 3-метил-1-бутенил, 1-метил-2-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 3-метил-2-бутенил, 1-метил-3-бутенил, 2-метил-3-бутенил, 3-метил-3-бутенил, 1,1-диметил-2-пропенил, 1,2-диметил-1-пропенил, 1,2-диметил-2-пропенил, 1-этил-1-пропенил, 1-этил-2-пропенил, 1-гексенил, 2-гексенил, 3-гексенил, 4-гексенил, 5-гексенил, 1-метил-1-пентенил, 2-метил-1-пентенил, 3-метил-1-пентенил, 4-метил-1-пентенил, 1-метил-2-пентенил, 2-метил-2-пентенил, 3-метил-2-пентенил, 4-метил-2-пентенил, 1-метил-3-пентенил, 2-метил-3-пентенил, 3-метил-3-пентенил, 4-метил-3-пентенил, 1-метил-4-пентенил, 2-метил-4-пентенил, 3-метил-4-пентенил, 4-метил-4-пентенил, 1,1-диметил-2-бутенил, 1,1-диметил-3-бутенил, 1,2-диметил-1-бутенил, 1,2-диметил-2-бутенил, 1,2-диметил-3-бутенил, 1,3-диметил-1-бутенил, 1,3-диметил-2-бутенил, 1,3-диметил-3-бутенил, 2,2-диметил-3-бутенил, 2,3-диметил-1-бутенил, 2,3-диметил-2-бутенил, 2,3-диметил-3-бутенил, 3,3-диметил-1-бутенил, 3,3-диметил-2-бутенил, 1-этил-1-бутенил, 1-этил-2-бутенил, 1-этил-3-бутенил, 2-этил-1-бутенил, 2-этил-2-бутенил, 2-этил-3-бутенил, 1,1,2-триметил-2-пропенил, 1-этил-1-метил-2-пропенил, 1-этил-2-метил-1-пропенил, 1-этил-2-метил-2-пропенил, 1-гептенил, 2-гептенил, 3-гептенил, 4-гептенил, 5-гептенил, 6-гептенил, 1-октенил, 2-октенил, 3-октенил, 4-октенил, 5-октенил, 6-октенил, 7-октенил, ноненил, деценил, ундеценил, додеценил, тридеценил, тетрадеценил, пентадеценил, гексадеценил, гептадеценил, октадеценил, нонадеценил или эйкозенил;

- алкинил означает разветвленные или неразветвленные алкинильные остатки с 2-6 атомами углерода, как, например, этинил, проп-1-ин-1-ил, проп-2-ин-1-ил, н-бут-1-ин-1-ил, н-бут-1-ин-3-ил, н-бут-1-ин-4-ил, н-бут-2-ин-1-ил, н-пент-1-ин-1-ил, н-пент-1-ин-3-ил, н-пент-1-ин-4-ил, н-пент-1-ин-5-ил, н-пент-2-ин-1-ил, н-пент-2-ин-4-ил, н-пент-2-ин-5-ил, 3-метилбут-1-ин-3-ил, 3-метилбут-1-ин-4-ил, н-гекс-1-ин-1-ил, н-гекс-1-ин-3-ил, н-гекс-1-ин-4-ил, н-гекс-1-ин-5-ил, н-гекс-1-ин-6-ил, н-гекс-2-ин-1-ил, н-гекс-2-ин-4-ил, н-гекс-2-ин-5-ил, н-гекс-2-ин-6-ил, н-гекс-3-ин-1-ил, н-гекс-3-ин-2-ил, 3-метилпент-1-ин-1-ил, 3-метилпент-1-ин-3-ил, 3-метилпент-1-ин-4-ил, 3-метилпент-1-ин-5-ил, 4-метилпент-1-ин-1-ил, 4-метилпент-2-ин-4-ил или 4-метилпент-2-ин-5-ил;

- алкилкарбонил означает разветвленные или неразветвленные алкилкарбонильные цепочки с 1-20 атомами углерода в алкиле с алкильными группами, как упомянутые выше для R¹, которые присоединены к основе по карбонильной группе [-(С=O)-];

- алкилфосфорил означает разветвленные или неразветвленные алкил-фосфорильные остатки с 1-20 атомами углерода с такими алкильными группами, как вышеупомянутые для R¹, которые присоединены к основе по фосфорильной группе [-О-Р(О)(ОН)-];

- алкенилкарбонил означает разветвленные или неразветвленные алкенил-карбонильные цепочки с 3-20 атомами углерода в алкениле с алкенильными группами, как упомянутые выше для R¹, которые присоединены к основе по карбонильной группе [-(С=O)-];

- алкенилфосфорил означает разветвленные или неразветвленные, содержащие 3-20 атомов углерода алкенилфосфорильные цепочки с алкенильными группами, как упомянутые выше для R¹, которые соединены с основой по фосфорильной группе [-О-Р(О)(ОН)-];

- алкинилкарбонил означает разветвленные или неразветвленные с 3-6 атомами углерода в алкиниле алкинилкарбонильные цепочки с алкинильными группами, как упомянутые выше для R¹, которые соединены с основой по карбонильной группе [-(С=0)-];

- алкинилфосфорил означает разветвленные или неразветвленные с 3-6 атомами углерода в алкиниле алкинилфосфорильные цепочки с алкинильными группами, как упомянутые выше для R¹, которые соединены с основой по фосфорильной группе [-О-Р(О)ОН-];

- циклоалкил означает разветвленные или неразветвленные циклоалкильные цепочки с 3-20 атомами углерода и с 3-7 атомами углерода в кольце, которое может содержать такие гетероатомы, как сера, азот или кислород, или такие циклические системы, как циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, 1-метилциклопропил, 1-этил-циклопропил, 1-пропилциклопропил, 1-бутилциклопропил, 1-пентилциклопропил, 1-метил-1-бутилциклопропил, 1,2-диметилциклопропил, 1-метил-2-этилциклопропил, циклооктил, циклононил или циклодецил;

- циклоалкилкарбонил означает разветвленные или неразветвленные с 3-20 углеродными атомами циклоалкилкарбонильные цепочки с 3-7 атомами углерода в кольце, которое может содержать гетероатомы, такие как сера, азот или кислород, или циклические системы, такие как циклопропилкарбонил, циклобутилкарбонил, циклопентилкарбонил, циклогексилкарбонил, циклогептилкарбонил, 1-метилциклопропилкарбонил, 1-этилциклопропилкарбонил, 1-пропилциклопропилкарбонил, 1-бутилциклопропилкарбонил, 1-пентилциклопропилкарбонил, 1-метил-1-бутилциклопропилкарбонил, 1,2-диметилциклопропилкарбонил, 1-метил-2-этилциклопропилкарбонил, циклооктилкарбонил, циклононилкарбонил или циклодецилкарбонил;

- циклоалкилфосфорил означает разветвленные или неразветвленные с 3-20 углеродными атомами циклоалкилфосфорильные цепочки с 3-7 атомами углерода в кольце, которое может содержать такие гетероатомы, как сера, азот или кислород, или циклические системы, как, например, циклопропилфосфорил, циклобутилфосфорил, циклопентилфосфорил, циклогексилфосфорил, циклогептилфосфорил, 1-метилциклопропилфосфорил, 1-этилциклопропилфосфорил, 1-пропилциклопропилфосфорил, 1-бутилциклопропилфосфорил, 1-пентилциклопропилфосфорил, 1-метил-1-бутилциклопропилфосфорил, 1,2-диметилциклопропилфосфорил, 1-метил-2-этилциклопропилфосфорил, циклооктилфосфорил, циклононилфосфорил или циклодецилфосфорил;

- арил означает, например, фенил или нафтил;

- арилкарбонил означает, например, фенилкарбонил или нафтилкарбонил;

- арилфосфорил означает, например, фенилфосфорил или нафтилфосфорил;

- гетарил и гетарильный участок гетарилкарбонила или гетарилфосфорила являются ароматическими моно- или полициклическими остатками, которые наряду с входящими в кольцо углеродными атомами дополнительно могут содержать в кольце от одного до четырех атомов азота или от одного до трех атомов азота и один атом кислорода или серы;

- гликозил означает моно-, ди- или олигосахариды, как, например, глюкоза, галактоза, манноза, фруктоза, фукоза, N-ацетил-D-глюкозамин, мальтоза, лактоза, хитобиоза, целлобиоза или олигосахариды во всех стереоизомерных формах - или -конфигурация) и при всех возможных типах связей в виде гомо- или гетеромеров, причем связывающийся с основой сахар должен узнаваться эндо- или экзогликозидазой или их смесями и гликозидная связь должна расщепляться.

Под замещенными или незамещенными аминокислотами или пептидами подразумевают природные или неприродные аминокислоты или пептиды, которые их содержат. Присоединенные к основе аминокислоты и пептиды выбираются так, чтобы они отщеплялись экзо- или эндопептидазой, или экзо- или зндопротеазой, или их смесями.

Все названные остатки R¹ могут при необходимости иметь другие заместители в той мере, в какой при этом не блокируется узнаваемое ферментом место.

R² означает в соединениях формул I, II и III нуклеофуг, представляющий собой удаляемую группу, который позволяет связывать любые продукты с линкером по изобретению через нуклеофильную группу и тем самым сделать возможным последующее применение комбинаторной химии на твердой фазе.

В качестве нуклеофугов следует назвать такие удаляемые группы, как галоген, например бром, хлор или фтор, или группы, как, например,

-S-Cl,











m = 1 - 5;

R⁵=H, Cl, Вr, F, NO₂.

Y в соединениях формулы IV имеет указанное для R² значение и может быть таким же или отличным от R².

Х в соединениях формулы II означает одну из следующих групп - (С=О)-О-, -О-, -NR³-, -S-, -OPO(OR⁴)-O-, причем R³ и R⁴ независимо друг от друга означают водород или алкил с 1 - 8 атомами углерода, как, например, метил, этил, н-пропил, 1-метилэтил, н-бутил, 1-метилпропил, 2-метилпропил, 1,1-диметилэтил, н-пентил, 1-метилбутил, 2-метилбутил, 3-метилбутил, 2,2-диметилпропил, 1-этилпропил, н-гексил, 1,1-диметилпропил, 1,2-диметилпропил, 1-метилпентил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 4-метилпентил, 1,1-диметилбутил, 1,2-диметилбутил, 1,3-диметилбутил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил, 3,3-диметилбутил, 1-этилбутил, 2-этилбутил, 1,1,2-триметилпропил, 1,2,2-триметил-пропил, 1-этил-1-метилпропил, 1-этил-2-метилпропил, н-гептил или н-октил.

По группе ХН линкер соединяется с твердой фазой . Для синтеза годятся все группы, делающие возможным это связывание.

Полезно строить связанный с твердой фазой линкер по изобретению в такой реакционной последовательности, которая далее представлена, например, для тентагель S-NH₂ в качестве носителя и двух различных конструкций линкера (схемы I и II, см. в конце описания).

Реакции присоединения а) между твердой фазой и соединениями формулы II проводят, например, когда ХН является остатком карбоновой кислоты, в растворителе в присутствии, например, диизопропилкарбодиимида. Далее для связывания амидной связью подходящими сочетающими реагентами являются, например, тетрафторборат О-бензотриазол-1-ил-N, N, N",N"-тетраметилурония, соль О-бензотриазолил-N, N, N", N"-тетраметилурония, гексафторфосфат бензо-триазол-1-илокси-трис(диметиламино)фосфония, гексафторфосфат бензотриазол-1-илокси-трипирролидинфосфония (лит. : Int. J. Peptide Prot. Rev. 35, 1990: 161-214). В качестве растворителей годятся апротонные неполярные или полярные растворители, например диметилформамид (ДМФА), хлористый метилен, диметилсульфоксид (ДМСО) или тетрагидрофуран (ТГФ). Могут применяться отдельные растворители или смеси. Гидроксиметиленовую группу формулы II для присоединения к линкеру следует при необходимости защитить.

При реакции б) в линкер вводится нуклеофуг, что способствует присоединению других молекул, которые затем позже комбинаторно дериватизируются.

Реакцию б) полезно проводить с фосгеном или с эквивалентными фосгену соединениями в апротонном полярном или неполярном растворителе, как, например, хлористый метилен, ДМФА, ДМСО, ТГФ, толуол, ацетонитрил или их смеси.

Y и R², а также другие указанные остатки в схеме I в формулах I-IV имеют упомянутые выше значения.

Обе реакции проводят в области температур между -20^oС и +120^oС, предпочтительно между 0^oС и +60^oС, при необходимости реакция б) может быть проведена в присутствии каталитических количеств 4-диметиламино-пиридина (ДМАП).

Для связывании линкера с твердой фазой (см. схему II) их сначала функционализируют. Для этого твердую фазу подвергают реакции с соединением общей формулы IV (см. реакцию в), где остатки R² и Y имеют вышеназванные значения. Для функционализации твердой фазы подходят все эквивалентные фосгену соединения. Они приводят к введению нуклеофуга, посредством чего линкер присоединяется к твердой фазе.

Реакцию в) проводят в апротонных полярных или неполярных растворителях, как, например, хлористый метилен, ДМФА, ДМСО, ТГФ, толуол, ацетонитрил или их смеси.

Реакцию проводят в области температур между -20^oС и + 120^oС, предпочтительно между 0^oС и +60^oС, при необходимости реакцию можно проводить в присутствии каталитических количеств ДМАП. По нуклеофугу R² линкер затем связывается с носителем (реакция г).

Реакцию г) проводят в апротонных полярных или неполярных растворителях, как, например, хлористый метилен, ДМФА, ДМСО, ТГФ, толуол, ацетонитрил или их смеси.

Реакцию проводят в присутствии третичного амина, например триэтиламина или диизопропилэтиламина, и каталитических количеств ДМАП. Реакцию г) проводят при температурах между ^oС и +120^oС, предпочтительно между 20^oС и 80^oС.

Остатки R⁵, R⁶ и Q имеют следующие значения:

R⁵ означает водород, гидроксильную группу, нитрогруппу, при необходимости замещенный алкил с 1-8 атомами углерода, алкоксигруппу с 1-8 атомами углерода, циклоалкил с 3-10 атомами углерода, циклоалкилоксигруппу с 3-10 атомами углерода,

R⁶ означает замещенный или незамещенный алкил с 1-20 атомами углерода, алкенил с 3-20 атомами углерода, алкинил с 3-6 атомами углерода, алкилкарбонил с 1-20 атомами углерода в алкиле, алкилфосфорил с 1-20 атомами углерода, алкенилкарбонил с 3-20 атомами углерода в алкениле, алкинилкарбонил с 3-6 атомами углерода в алкиниле, алкенилфосфорил с 3-20 атомами углерода, алкинилфосфорил с 3-6 атомами углерода, циклоалкил с 3-20 атомами углерода, циклоалкилкарбонил с 3-20 атомами углерода в циклоалкиле, циклоалкилфосфорил с 3-20 атомами углерода, арил, арилкарбонил, арилфосфорил, гетарил, гетарилкарбонил, гетарилфосфорил, гликозил, замещенные или незамещенные аминокислоты или пептиды,

Q означает иминогруппу или кислород.

Остаток R⁶ следует выбирать так, чтобы образовывались узнаваемые ферментами места, по которым происходит отщепление. Связями, образующимися при подходящем выборе остатка R⁶ и удовлетворяющими названному выше критерию, являются, например, сложноэфирные связи, простые эфирные связи, связи в амидах кислот, сложноэфирные связи фосфорной кислоты или гликозидные связи. Ферментами, расщепляющими эти связи, являются, например, гидролитические ферменты, как, например, липазы, эстеразы, амидазы, протеазы, пептидазы, фосфатазы, фосфолипазы, пероксидазы или гликозидазы.

Достоинством линкера по изобретению, а также способа по изобретению является простое и полное отщепление линкера от продукта.

Линкер по изобретению делает возможной широкую палитру проводимых далее синтетических превращений, например создание так называемой библиотеки субстанций в комбинаторной химии, которая при необходимости может быть автоматизирована. Линкер согласно изобретению полезен для применения в твердофазных синтезах.

Следующие примеры служат для дальнейшего наглядного объяснения изобретения без ограничения каким-либо способом.

Пример 1

Получение 2-ацетокси-5-метилбензойной кислоты



Растворяли 1 г 5-метилсалициловой кислоты (6,58 ммоля) и 1,83 мл триэтиламина (2 эквивалента) в 80 мл этилацетата. При 0^oС прибавляли по каплям 0,94 мл хлористого ацетила (2 эквивалента) и затем перемешивали 1 час при 23^oС. Выпавшие в осадок соли отфильтровывали. К фильтрату прибавляли 100 мл 1М соляной кислоты и перемешивали в течение ночи. Образовывался гомогенный раствор, рН которого устанавливали около 4 с помощью насыщенного раствора бикарбоната натрия. Затем экстрагировали хлороформом, органическую фазу промывали небольшим количеством воды и сушили над сернокислым магнием. Растворитель затем удаляли и неочищенный продукт перекристаллизовывали из гексана/этилацетата. Выход: 1,21 г (95%).

¹Н-ЯМР (дейтерохлороформ): 7,89 (д, J=2 Гц); 7,39 (дд, J=8 Гц; J"=2 Гц); 6,99 (д, J=8 Гц); 2,40 (с, 3Н, метил); 2,31 (с, 3Н, -ОАс).

Пример 2

Получение 2-ацетокси-5-бромметилбензойной кислоты



В 20 мл абсолютного четыреххлористого углерода осторожно нагревали в атмосфере аргона при перемешивании 1 г 2-ацетокси-5-метилбензойной кислоты (5,16 ммоля), 1,16 г N-бромсукцинимида (1,25 эквивалента) и 33 мг азодиизобутиронитрила и кипятили 2,5 часа с обратным холодильником при облучении лампой дневного света. Затем охлаждали в бане со льдом, отфильтровывали и промывали отфильтрованный осадок н-пентаном. Кристаллы вместе с маточным раствором смешивали с хлороформом и промывали холодной водой. Органическую фазу сушили над сернокислым магнием и концентрировали. Неочищенный продукт сразу затем перекристаллизовывали.

Выход: 1 г (58%) указанного в заглавии соединения, кроме того, получают около 10% 2-ацетокси-5-дибромметилбензойной кислоты (определено с помощью ¹Н-ЯМР-спектра).

¹Н-ЯМР (дейтерохлороформ): 8,11 (д, J=2 Гц); 7,62 (дд, J=8 Гц, J"=2 Гц); 7,11 (д, J=8 Гц); 4,48 (с, 2Н, -CH₂-); 2,33 (с, 3Н, -ОАс).

Пример 3

Получение 2-ацетокси-5-гидроксиметилбензойной кислоты



Неочищенный продукт из примера 2 в количестве 1 г (2,99 ммоля) смешивали с 25,5 мл диоксана и 30 мл 0,1 н. раствора азотнокислого серебра и перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Затем экстрагировали несколько раз этилацетатом, объединенные органические фазы высушивали над сернокислым магнием и упаривали досуха. После хроматографирования на колонке в хлороформе/метаноле (5:1) выход составил 389 мг (62%).

¹Н-ЯМР (дейтерохлороформ): 8,07 (д, J=2 Гц); 7,61 (дд, J=8 Гц, J"=2 Гц); 7,12 (д, J=8 Гц); 4,73 (с, 2Н, -СН₂); 2,32 (с, 3Н, -ОАс).

Пример 4

Присоединение анкерного структурного элемента в виде 2-ацетокси-5-гидроксиметилбензойной кислоты к тентагелю S-NН₂



К 500 мг тентагеля S-NH₂ (0, 29 ммоля NH₂-групп/г) в 6 мл безводного хлористого метилена прибавляли 36,5 мг 2-ацетокси-5-гидроксиметилбензойной кислоты (1,2 эквивалента) и 21,5 мкл диизопропилкарбодиимида (1,44 эквивалента). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре и смолу отсасывали на фритте. Затем последовательно промывали на фритте в каждом случае трижды безводным ДМФА, метанолом и хлористым метиленом, причем при перемешивании с помощью пропускаемого азота. Смолу высушивали в вакууме, создаваемом масляным вакуумным насосом, и процедуру связывания повторяли еще раз, пока тест Кайзера на свободные NН₂-группы не был отрицательным (Е. Kaiser и др., Anal. Biochem. 1979, 34, 595).

ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием: 1766 см^-1 (-ОАс), 1666 см^-1 (-CONH-), 1540 см^-1 (-NH-), 3100 -3500 см^-1 (-ОН).

Пример 5

Превращение в сложный эфир хлормуравьиной кислоты



К 210 мг полученного в примере 4 продукта, помещенного в 3,5 мл безводного ТГФ в атмосфере аргона, прибавляли по каплям при 23^oС 400 мкл (примерно 12 эквивалентов) раствора фосгена в толуоле (1,93 М). Суспензию перемешивали 2 часа и после прибавления по каплям еще 200 мкл раствора фосгена перемешивали еще 2 часа. Затем последовательно в каждом случае дважды промывали безводным ТГФ, серным эфиром, ТГФ и еще раз серным эфиром и смолу сушили в вакууме. ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием: 1770,5 см^-1 (-ОАс и -СОСl), 1666 см^-1 (-CONH-), 1540 см^-1 (-NH-)

Пример 6

Получение



путем реакции сочетания с хлогидратом трет-бутилового эфира лейцина.

Охлажденный в бане с ледяной водой раствор 29 мг хлоргидрата трет-бутилового эфира лейцина (4 эквивалента) и 20 мкл триэтиламина (примерно 5 эквивалентов) в 4 мл безводного хлористого метилена медленно прибавляли при 0^oС под аргоном к суспензии 110 мг соединения, полученного согласно примеру 5, в 2 мл хлористого метилена. Суспензию перемешивали 0,5 часа при 0^oС и 3 часа при 23^oС. Затем последовательно промывали каждый раз безводным метанолом, хлористым метиленом, метанолом и серным эфиром и смолу сушили в вакууме.

ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием:

1776 см^-1 (-ОАс), 1724 см^-1 (-OCONH-), 1666 см^-1 (-CONH-), 1540 см^-1(-NH-).

Пример 7

Отщепление в основных условиях трет-бутилового эфира лейцина для определения поверхностной плотности

Продукт сочетания из примера 6 в количестве 6 мг суспендировали в растворе из 200 мкл ТГФ и 200 мкл насыщенного раствора бикарбоната натрия с рН 10,5 и реакционную смесь встряхивали около 30 мин при 23^oС. Затем экстрагировали 200 мкл хлороформа и с применением газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ - МС) количественно оценивали органическую фазу с помощью эталона. Доля присоединения трет-бутилового эфира лейцина через анкерный структурный элемент к полимерному носителю относительно имеющихся NH₂-групп составляла 51%.

Пример 8

Ферментативное отщепление трет-бутилового эфира лейцина

Продукт сочетания из примера 6 в количестве 27 мг суспендировали в 1066 мкл фосфатного буфера (0,1 М двузамещенный фосфорнокислый натрий, 0,2 М йодистый калий, рН 5) и 500 мкл метилового спирта; прибавляли 3 Ед. липазы (из Mucor meihei), растворенной в 100 мкл такого же буфера, и смесь инкубировали при 30^oС при встряхивании. Благодаря присутствию иодида в буферном растворе улавливали промежуточный образующийся хинонметин. Через 6 часов и 32 часа прибавляли каждый раз еще 100 мкл раствора липазы. Инкубирование прекращали через 58 часов. Реакционную смесь экстрагировали хлороформом. Объединенные и высушенные органические фазы упаривали до 1 мл и количественно оценивали с помощью ГХ - МС. Выход: 42%.