полипептиды или их соли, фармацевтическая композиция, обладающая противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека

Формула изобретения

1. Полипептиды общей формулы

где А₁ атом водорода или один или два аминокислотных остатка, такие, как лизин и аргинин;

А₂ независимо тирозиновый, фенилаланиновый или триптофановый остаток;

А₂ независимо аргининовый или лизиновый остаток;

А₄ независимо аланиновый, валиновый, лейциновый, изолейциновый, сериновый или метиониновый остаток,

и две пары цистеиновых остатков в положениях 3 и 16 и положениях 7 и 12 могут быть соединены дисульфидными мостиками (- S S -) или их соли.

2. Фармацевтическая композиция, обладающая противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека, содержащая в качестве активного начала производное полипептида, отличающаяся тем, что в качестве производного полипептида она содержит эффективное количество соединения формулы 1 по п. 1 или его соли.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к новому полипептиду или его соли. Более конкретно, данное изобретение относится к новому полипептиду, проявляющему сильное сродство с липополисахаридами, в частности эндотоксинами, и имеющему улучшенную противобактериальную активность и улучшенную противовирусную активность, его фармацевтически приемлемой соли, а также анти-ВИЧ средству, содержащему в качестве эффективного компонента данный полипептид.

На сегодняшний день, как показано в следующих литературных источниках, были приведены Nakamura, Iwanaga, Niwa, et al. полипептиды (Tachyplesin и PoIypgemusin), проявляющие сродство с эндотоксинами и полученные из камчатских крабов, а также их фармакологические свойства ( J. Biol. Chem. 263, 16709-16713 (1988); Опубликованная прошедшая экспертизу заявка на патент N 500194/1990; Chem. Pharm. BuII. 37, 2661-2664 (1989); Выложенная японская патентная публикация N 53799/1990; Выложенная японская патентная публикация N 152987/1990; Выложенная японская патентная публикация N 167230/1990; J. Biochem. 106- 663-668 (1989); Taicha (Metabolism), 26, 310-311 (1989).

Что касается полипептидов, имеющих сродство с эндотоксинами, выделенными из камчатских крабов (род Tachypleus, род Lumulus и род Carcinoscorpius), то существуют пять структурных аналогов и каждый из них представляет собой полипептид, имеющий циклическую структуру, включающую 17 или 18 натуральных аминокислот. Кроме того, эти полипептиды проявляют крайне аналогичные свойства и такой полипептид является весьма интересным в качестве ключевых веществ, посредством которых камчатские крабы способны адаптироваться к изменениям их внешней и сохранять свой вид от древних времен до наших дней в качестве живого ископаемого.

С другой стороны, в отношении сохранения существования человека, представители которого чрезвычайно дифференцированы, требуются лекарственные средства, которые, как ожидают, имеют профилактическое или терапевтическое воздействие на синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД), вызванный заражением вирусом человеческого иммунодефицита (ВИЧ).

Заявитель обратил внимание на вышеупомянутые эндотоксинсродственные полипептиды, которые, предположительно, имеют связь с сильной сохранностью видов камчатских крабов, и проделал исследование зависимости структурных изменений этих веществ от активности против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). В результате исследования заявитель обнаружил новые полипептиды, по существу отличающиеся от общей структуры известных эндотоксин-сродственных полипептидов камчатских крабов, и установил, что эти новые полипептиды оказывают превосходное влияние, которое выражается в том, что значения их противо-ВИЧ активности в 10 раз, или более, превосходят значения активности известного эндотоксинсродстенного полипептида.

Настоящее изобретение основано на данном открытии и относится к новому полипептиду, представленному следующей формулой (I):

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

A₁-Trp-Cys-A₂-A₃-Lys-A₄-A₂- A₃-Gly-A₄-A₄-A₂-A₃-

15 16 17 18

A₃-Cys-Arg-A₅ (I),

где А₁ обозначает атом водорода или один или два аминокислотных остатка аминокислот, выбранных из лизина и аргинина. A₂ самостоятельно обозначает остаток тирозина, фенилаланина или триптофана, А₃ самостоятельно обозначает остаток аргинина или лизина, А₄ самостоятельно обозначает остаток аланина, валина, лейцина, изолейцина, серина, цистеина или метионина, А₅ обозначает -ОН (полученный из карбоксильной группы) или -NH₂ (полученный из кислотно-амидной группы), Сys обозначает остаток цистеина, Gly обозначает остаток глицина, Lys обозначает остаток лизина, Arg обозначает остаток аргинина и Тrp обозначает остаток триптофана; причем остатки цистеина в положениях 3 и 16 могут соединяться посредством дисульфидной связи (-S-S-), и когда положения 7 и 12 оба означают остатки цистеина, они могут соединяться посредством дисульфидной связи (-S-S-) или его соли.

Новый полипептид в соответствии с настоящим изобретением имеет важную характеристику, заключающуюся в том, что, хотя в известных полипептидах, полученных из камчатских крабов, аминокислотный остаток в положении 6 представляет собой остаток валина (Val), его 6-положение занимает остаток лизина (Lys), основной аминокислотный остаток, имеющий совершенно другое свойство, нежели имеет остаток валина.

Новый полипептид или его соль в соответствии с настоящим изобретением описаны более подробно ниже.

Новый полипептид предлагаемого изобретения может быть получен известным способом, например методом твердофазного синтеза. А именно прямоцепочечный полипептид настоящего изобретения, имеющий вышеприведенную формулу (I), может быть получен связыванием карбоксильной группы N-защищенного аргина с нерастворимым полимером, имеющим аминогруппы, непосредственно или, в некоторых случаях, посредством спейсера, имеющего функциональную группу, способную связываться с карбоксильной группой, и карбоксильную группу, последовательно связующую в соответствии с методом твердофазного синтеза соответствующие защищенные аминокислоты в положении от 16 до 1 аминокислотной последовательности, представленной следующей формулой (I):

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

A₁-Trp-Cys-A₂-A₃-Lys-A₄-A₂-A₃-Gly-A₄-A₄-A₂-A₃-

15 16 17 18

A₃-Cys-Arg-A₅ (I),

где А₁, A₂, A₃, A₄, Cys, Gly, Lys, Аrg и Тrp имеют значения, приведенные выше для формулы (I), с последующим элиминированием (отщеплением) нерастворимого полимера и защитных групп аминокислот. В данном случае карбоксильное окончание аминокислотного остатка в положении 17 может быть либо свободным (А₅ соответствует -ОН), либо превращенным в амид кислоты (А₅ соответствует -NР₂. Кроме того, в полученном полипептиде два цистеина в положениях 3 и 16 могут образовать дисульфидную связь (-S-S-) посредством меркаптогрупп.

Более того, когда положение 7 и положение 12 оба обозначают остатки цистеина, эти цистеины могут образовать также дисульфидную связь.

Что касается образования этих дисульфидных связей, то обе пары групп цистеина можно превратить в дисульфидную связь, например, окислением кислородом воздуха, либо дисульфидную связь можно образовать в соответствии с методом Atherton, E. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans, I, 1985, 2065, a именно с использованием стадий селективной защиты меркаптогрупп любой пары цистеинов в положениях 3 и 16 в положениях 7 и 12 с помощью защитной группы, т-Bus (трет-бутилтио) и меркаптогрупп любой пары цистеинов с помощью защитной группы Асm (ацетамидометил); освобождения от защиты т-Bus, частично окисляя меркаптогруппы; а затем освобождения от защиты Аcm в соответствии с известным способом.

Соответствующими аминокислотами, используемыми в методе твердофазного синтеза, могут быть традиционные L-формы или традиционные D-формы.

Что касается нерастворимых полимеров, имеющих аминогруппы для использования в синтезе нового полипептида настоящего изобретения, то можно использовать любые такие полимеры, если они только могут связываться через их аминогруппы с карбоксильной группой N-защищенного аргинина у С-окончания или, в некоторых случаях, с карбоксильной группой присоединенного спейсера, после чего их можно элиминировать (отщепить).

Примерами таких нерастворимых полимеров являются аминометиловые полимеры (аминометилированные стирол-дивинилбензоловые сополимеры), бензгидриламиновые полимеры, метилбензгидриламиновые полимеры и аминометилфеноксиметиловые полимеры и их производные, а так далее. При использовании бензгидриламинового полимера, метилбензгидриламинового полимера, диметоксибензгидриламинового (DMВНА) полимера или аминометилфеноксиметилового полимера амид непосредственно получают отщеплением, однако аминометиловый полимер является предпочтительным с точки зрения выхода.

В качестве спейсера, имеющего функциональную группу, способную связываться с карбоксильной группой, и карбоксильную группу, можно упомянуть, например, спейсер, способный превращать карбоксильную группу аргинина в сложный п-карбоксиметилбензиловый эфир, однако нет никакого конкретного ограничения в отношении спейсера.

Защищенная аминокислота представляет собой аминокислоту, функциональные группы которой защищены с помощью защитной группы известным способом, при этом различные защищенные аминокислоты поставляются на рынок.

При синтезе полипептида предлагаемого изобретения предпочитают выбирать любую одну из числа следующих защитных групп. Защитной группой для -аминогруппы аминокислоты является Вос (трет-бутилоксикарбонил) или Fmoc (9-фторфенилметилоксикарбонил). Защитной группой для гуанидиногруппы аргинина (Аrg) является Tos (тозил), NO₂ (нитро, Мtr (4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонил) или Pmc (2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил). В качестве защитной группы для меркаптогруппы цистеина (Сys) можно упомянуть BzI (бензио), MBzI (4-метоксибензил), 4-MeBzI (4-метилбензил), Аcm (ацетамидометил), Тrt (тритил), Npys (3-нитро-2-пиридинсульфенил), т-Bu (трет-бутил) или т-Bus (трет-бутилтио), причем предпочтительными являются МВzl, 4-MeBzl, Тrt- Acm и Npys. Защитной группой для гидроксильной группы торозина (Туr) является Bzl, Cl₂Bzl (2,6-дихлорбензил) или т-Bu, однако группа может не быть защищенной. Защитной группой для e-аминогруппы лизина (Lys) является Z (бензилоксикарбонил)= СlZ (2-хлоробензилоксикарбонил), Вос или Npys. Предпочтительно выбирать в качестве определенной защитной группы группу из числа известных pеr se в соответствии с условиями синтеза пептида.

Сочетание (связывание) защищенных аминокислот можно осуществить в соответствии с обычным методом конденсации, таким как, например, метод DCC (дициклогексилкарбодиимида), метод DIPCDI (диизопропилкарбодиимида) [Tartar, A. et al. J. Org. Chem. 44: 5000 (1979)] метод активного сложного эфира, метод смешанного или симметричного ангидрида кислоты, метод карбонилдиимидазола, метод DCC-HOBt (1-гидроксибензотриазола) [Konig W. et al. Chem. Ber. 103, 788, 2024, 2034, (1970)] или метод дифенилфосфорилазида, однако предпочтительными являются метод DCC, метод DCC-HOBt, метод DIPCDI-HOBt и метод симметричного ангидрида кислоты. Данную реакцию конденсации обычно осуществляют в органическом растворителе, таком как дихлорметан или диметилформамид, или смеси растворителей. В качестве агента освобождения от защиты для a-аминогруппы используют смесь трифторуксусной кислоты и дихлорметана, смесь НСl и диоксана, смесь пиперидина и диметилформамида и так далее, при этом соответствующий выбор осуществляют в соответствии с типом защитной группы. Кроме того, степень развития реакции конденсации в каждой стадии синтеза прослеживают с помощью метода Е. Kaiser et al. [Anal. Biochem. 34, 595 (1970)] (метод нингидрин-реакции).

В соответствии с вышеупомянутыми способами можно получить защищенную пептидную смолу, имеющую желаемую аминокислотную последовательность.

При использовании в качестве нерастворимого полимера производного аминометиловой смолы последнюю можно отщепить, например, путем обработки защищенной пептидной смолы аммиаком в подходящем растворителе. Полученный защищенный пептид затем обрабатывают фтороводородом с получением полипептидного амида, представленного вышеприведенной формулой и свободного от защитных групп. Когда в качестве нерастворимого полимера используют бензгидриламиновый полимер, метилбензгидриламиновый полимер, аминометилфеноксиметиловый полимер или DMBHA полимер [Funakoshi, S. et al. J. Chem, Commun. 1988, 382] полимер и защитные группы можно отщепить одновременно путем обработки защищенного пептидного полимера фтороводородом, TF MSA (трифторметансульфокислотой) [публикация Academic Press, под редакцией E. Gross; Yajima, H. et al. "The Peptides", том 5, стр. 65 (1983)] TMSOTf (триметилсилилтрифлатом) [Fujii, N. et al. J.Chem. Soc. Chem. Commun. 1987, 274] или TMSBr (триметилфилилбромидом) [Fujii, N, et al. Chem. Pharm. Bull. 35, 3880 (1987)] и так далее.

Затем, при желании, полученный полипептид восстанавливают 2-меркаптоэтанолом, DTT (дитиотрейтолом) или аналогичным агентом с получением меркаптогрупп цистеинов восстановленной формы, после чего окисляют с получением циклического полипептида, принадлежащего изобретению.

Окислительную обработку можно осуществить известным методом. Обычно используют такой окислитель, как кислород в воздухе или феррицианат (например, феррицианид калия).

Полученный таким образом полипептид можно выделить и очистить способами, хорошо известными per. se для полипептидов, например, экстракцией, перекристаллизацией, различными хроматографиями (гель-фильтрацией, ионообменной, распределительной, адсорбционной, обращеннофазовой), электрофорезом, противоточным распределением и так далее, при этом наиболее эффективным средством является обращеннофазовая жидкостная хроматография высокого разрешения.

В качестве специфических примеров полипептидов настоящего изобретения, представленных формулой (1), можно упомянуть полипептиды следующих формул (11) (22) (см. фиг.1, 2). В этих формулах (1) (22) каждый символ обозначает соответствующий аминокислотный остаток посредством международно принятого трехбуквенного выражения. Каждый символ обозначает остаток следующих аминокислот.

Arg Аргинин Trp Триптофан

Cys Цистеин Tyr Тирозин

Lys Лизин Gly Глицин

Phe Фенилаланин Ile Изолейцин

Ser Серин Leu Лейцин

Met Метионин Val Валин

Ala Аланин

Полученные таким образом полипептиды настоящего изобретения, представленные формулой (1), аналогично известным полипептидам, полученным из камчатских крабов, имеют способность связываться с эндотоксинами, обладают противобактериальной активностью, активностью гемолизировать эндотоксин-сенсибилизированные гемоциты и противовирусной активностью, в особенности хорошей противовирусной активностью в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). А именно, эти полипептиды проявляют анти-ВИЧ активность в десять или более раз выше активности Tachyplesin I известного полипептида, а некоторые полипептиды в соответствии с настоящим изобретением проявляют анти-ВИЧ активностью, в несколько тысяч раз более высокую, нежели активность Tachylesin I.

В известных полипептидах, полученных из камчатских крабов, выявлено в качестве их структурных характеристик, что благодаря наличию четырех остатков Cys в положениях 3, 7, 12 и 16 они принимают b-пластинчатую структуру так, что часть в положениях 9 и 10 представляет собой оборотный участок под действием b-оборота, и пептидный участок от 3 до 8 положения, а также пептидный участок от 11 до 16 положения расположены напротив друг друга, тогда как четыре остатка Cys в положениях 3 и 16 и в положениях 7 и 12 связываются посредством соответственных двух дисульфидных связей (-S-S-). Что касается структурных характеристик для проявления противовирусной активности полипептидов, положение 6 которых превращено в Lys, то существование структурных частей, составляющие аминокислотные последовательности которых крайне не похожи друг на друга, как видно в ³Cys⁴A₂ ⁵A₃ ⁶Lys, обращенной в сторону ¹³A₂ ¹⁴A₃ ¹⁵A₃ ¹⁶Cys, в основном необходимо, тогда как ²Тrp и ¹⁷Arg являются обязательными. Отличие также состоит в том, что посредством связывания основной аминокислоты, приписанной положению A₁ с этими структурными частями в положении 1, получается структура таким образом, что чрезвычайно высоко проявляется анти-ВИЧ активность.

Полипептид настоящего изобретения, представленный формулой (1), проявляет основное свойство благодаря характеристике составляющих аминокислот и таким образом образует соли путем присоединения кислот. Например, полипептид образует соль с неорганической кислотой (хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой, серной кислотой и так далее) или органической карбоновой кислотой (уксусной кислотой, пропионовой кислотой, малеиновой кислотой, янтарной кислотой, яблочной кислотой, лимонной кислотой, винной кислотой, салициловой кислотой и так далее) или органической сульфокислотой (метансульфокислотой, п-толуолсульфокислотой и так далее). Полипептид настоящего изобретения, представленный формулой (1), может быть использован в качестве фармацевтически приемлемой соли.

Лекарственное средство в соответствии с настоящим изобретением получают в виде фармацевтической композиции, включающей полипептид, представленный формулой (1), или его соль в качестве активного компонента, а также фармакологически приемлемый носитель, выбранный в соответствии с методом введения и формой вводимого лекарственного средства. А именно лекарственное средство настоящего изобретения вводят перорально или парентерально вирусное заболевание in vivo или часть вирусной инфекции in vitro и лекарственное средство может быть получено в виде препарата такого, как порошок, гранулы, раствор для инъекции или перорального введения, таблетки, суппозитории, вагинальные суппозитории, мазь, крем или аэрозоль, с использованием подходящих фармацевтических носителей в соответствии с методом введения.

Когда лекарственный препарат настоящего изобретения вводят непосредственно как инъекцию в живой организм, полипептид или его соль настоящего изобретения можно вводить непрерывно или с промежутками в количестве от 10 до 5000 мг на кг массы тела человека из расчета на одни сутки с использованием капельного внутривенного вливания в виде раствора в физиологическом растворе.

Фиг. 3 показывает схематическое изображение стадий синтеза нового полипептида в соответствии с настоящим изобретением.

Предлагаемое изобретение описано ниже более подробно в примерах, однако не ограничивается ими в объеме и сущности.

Используют следующие аппараты и реагенты.

Аппарат для проведения ЖХВР (жидкостной хроматографии высокого разрешения): Уотерс Ко, (США), модель 600;

колонка аппарата: Асахипак ОDP-90 (Асахи Кемикал Индастри Ко. Отл);

аминокислота Fmoc: производство Кокусан Кагаку Ко. Лтд;

аминосмола и конденсирующее средство: производство Пептид Кенкюшо Ко. Лтд;

FAB-MS (масс-спектрограф с бомбардировкой пучками быстрых атомов): УG Ко. (США), модель ZAB-SE.

Пример 1. Синтез полипептида (А) следующей формулы

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

Arg-Trp-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Tyr-Arg-Cly-Ile-Cys-Tyr-Arg-Lys-Cys-Arg-N- H₂ (A)

В вышеприведенной формуле (А) Arg, Trp, Cys, Tyr, Lys, Gly и Ile обозначают вышеуказанные аминокислотные остатки, а остатки Cys в положениях 3 и 16 и в положениях 7 и 12 связаны соответственно с помощью дисульфидной связи.

(1) Введение в аминометиловую смолу Fmoc-DMBHA-CH₂CH₂COOH[(3-(a-Fmoc-амино-4-метоксибензил)-4-метоксифенил)пропионовой кислоты]

270 мг (0,2 моль) аминометиловой смолы (0,74 мэкв/г) и 268,5 мг (0,5 ммоль, 2,5 экв) Fmoc-SMBHA-CH₂CH₂COOH (молекулярная масса 537) помещают в колонку для твердофазного синтеза и реакцию конденсации осуществляют в течение 2 часов с использованием метода DIPCD I-HOBt в ДМФ в соответствии со способом Guo, L. et al. [Chem. Pharm, Bull. 36, 4989 (1988)] После завершения реакции конденсации осуществляют сочетание для защиты свободных аминогрупп, используя уксусный ангидрид (смолу DMBHA).

(2) Введение аргинина в положении 17 в смолу DMBHA).

После отщепления групп F от смолы DMBHA, полученной в стадии (1), с помощью 20% пиперидина (ДМФ, прибавляют 2,5 экв. Fmoc-Aro (Mtr)-Oн на основе DMBHA и реакцию конденсации осуществляют в ДМФ с помощью метода DIPCDI-HOB. Степень развития реакции конденсации прослеживают путем измерения в соответствии с нингидрин-тестом Kaiser, E. et al. [And Biochem. 34, 595 (1970)]

(3) Введение цистеина в положении 16.

После отщепления групп Fmoc смолы DMBHA, полученной в стадии (2), в которую введен аргини, с помощью 20% пиперидина (ДМФ прибавляют 2,5 экв. Fmoc-Cys (MBzl)-OH на основе смолы DMBHA, а реакцию конденсации осуществляют в ДМФ методом DIPCDI-HOBt. Cтепень развития реакции конденсации прослеживают аналогично стадии (2) путем измерения в соответствии с нингидрин-тестом.

(4) Введение аминокислот в положениях от 15 до 1.

Аналогично вышеприведенным методикам, Lys (Boc), Arg-(Mtr), Tyr(т-Bu), Cys(MBzl), Ile, Gly, Arg(Mtr), Tyr(т-Bu), Gys(MBzl), Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr(т-Bu), Cys(MBzl), Trp и Arg(Mtr)-остатки в соответствии с последовательностью от С-концевой аминокислоты последовательно вводят в смолу DMBHA с получением защищенной с помощью защитной группы пептидной (А) смолы.

Реакцию конденсации каждой аминокислоты в твердофазном синтезе осуществляют в соответствии с условиями, приведенными в табл. 1.

(5) Получение пептида (А) путем отщепления защитных групп и операции по отношению смолы и частичной очистке.

Смолу пептида (А), защищенного с помощью защитной группы, которую получают в стадиях (1) (4), подвергают обработке 20% пиперидином (ДМФ с целью отщепления группы Fmoc, а затем подвергают реакции при температуре 25^oС в течение 2 часов в системе 1 М TMSOTf-тиоанизол) трифторуксусная кислота (10 мл трифторуксусной кислоты в присутствии м-крезола (100 экв.) и этантиола (300 экв. ) на 100 мг смолы. Смолу отфильтровывают из реакционной смеси и дважды промывают с помощью 1 мл трифторуксусной кислоты, после чего 100 мл охлажденного на льду сухого простого эфира прибавляют в смесь фильтрата и промывки, образованный осадок центрифугируют и остаток промывают холодным простым эфиром, растворяют в 10 мл 4 н. раствора АсОН, 830 мг; 80 экв. дитиотрейтола прибавляют и смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционный раствор центрифугируют, супернатант обрабатывают с помощью Сефадекс G-10 (3,7x50 см), гель-фильтруют с помощью 4 н. раствора АсОН, после чего фракцию, которая прошла через колонку Сефадекс без остановки, собирают в виде основной части элюата и лиофилизируют с получением в виде порошка частично очищенного нециклизованного полипептида (А).

(6) Получение полипептида (А) окислением на воздухе.

С другой стороны, половину количества фракции, которая прошла через колонку Сефадекс без остановки при гель-фильтрации, доводят до рН 7,5 концентрированным водным аммиаком и подвергают окислению на воздухе с помощью аэрации с тем, чтобы осуществить реакцию замыкания цикла. После завершения окисления на воздухе циклизованный пептид (А) адсорбируют на 10 г смолы Диаион НР-20, десорбируют и элюируют с помощью 60% СН₃CN (в 1 н. растворе АсОН) и элюат концентрируют при комнатной температуре при пониженном давлении с тем, чтобы отщепить CH₃CN, а затем лиофилизируют с получением порошка. Порошок растворяют в малом количестве воды и раствор вливают на Асахипак и очищают жидкостной хроматографией высокого разрешения (ЖХВР-Модель 600, производство Уотерс Ко.), используя градиентное элюирование с помощью СH₃CN, с получением пептида (А) единственного пика с выходом 27% (значение вычислено на основе смолы пептида (А), защищенного с помощью защитной группы).

(7) Анализ полипептида

Значение аминокислотного состава с перевариванием лейцин-аминопептидазой полипептида, очищенного в стадии (6) выше, хорошо согласуется с вычисленным значением состава на основе аминокислотной последовательности формулы (А). Кроме того, при определении значения молекулярной массы с помощью FAB-MS вычисленное значение (M+H⁺) cоставляет 2309, 786, а с другой стороны, найденное значение составляет 2310, 048.

Удельное вращение []²_D⁰ полученного полипептида составляет +14,2^o (C= 0,3, 1 н. раствор уксусной кислоты).

Пример 2 и сравнительные примеры 1 и 2.

Противовирусная активность в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ)

Противовирусная активность в отношении ВИЧ полипептида (А), синтезированного в примере 1, исследуют и оценивают в соответствии со следующим способом.

ВИЧ-зараженные клетки МТ-4 (2,5х10⁴ клеток/лунку, множественность заражения (МО1):0,001) немедленно после заражения прибавляют вместе с испытуемым веществом при различных изменениях в концентрации в титрационный микропланшет с 96 лунками. После инкубации при температуре 7^oC в течение 5 суток в инкубаторе СО₂ число выживших клеток измеряют методом МТТ (Pauwels et al. J. Virol. Methods, 20, 309-321 (1988)). Противовирусную активность выражают в виде концентрации, при которой происходит 50% ингибирование целлюлярного поражения вследствие заражения ВИЧ (ЕС₅₀:50% эффективная концентрация). С другой стороны, с целью обнаружения цитотоксичности испытуемого вещества относительно клеток МТ-4 не зараженные вирусом клетки инкубируют, как описано выше, вместе с испытуемым соединением при различных изменениях в концентрации. Цитотоксичность выражают в виде 50% цитотоксичной концентрации (СС₅₀) вследствие испытуемого вещества. Кроме того, грубое отношение СС₅₀ и ЕС₅₀ (CC₅₀/EC₅₀) выражают в виде эффективного отношения (SI).

Таблица 2 показывает значения EC₅₀, CC₅₀ и SI полипептида (А), а также Tachyplesin I, известного полипептида, имеющего сродство с эндотоксинами, и азидотимидина, противо-ВИЧ агента, при этом оба последних используют для сравнения.

Как видно из вышеприведенной таблицы, полипептид (А) в соответствии с настоящим изобретением имеет несколько более высокую цитотоксичность, нежели Tachyplesin I, анти-ВИЧ активность которого выявлена ранее, однако проявляет противовирусную активность при концентрации 1/50. В сравнении с азидотимидином полипептид (А) имеет значение ЕС₅₀ при более высокой концентрации, однако в 60 раз более высокую СС₅₀, что указывает на низкую цитотоксичность.

Пример 3.

Таблица 3 показывает структурные формулы и физические свойства различных полипептидов настоящего изобретения, полученных аналогично примеру 1, а также их противовирусную активность в отношении ВИЧ, исследованную и оцененную аналогично примеру 2.

В соединениях данного примера в вышеуказанной таблице остатки Сys в положениях 3, 7, 12 и 16 связаны посредством дисульфидной связи между положениями 3 и 16 и между положениями 7 и 12, если не указано что-либо иное.

Кроме того, в вышеприведенной таблице "AZT" обозначает азидотимидин (общее название: зидовудин).

В соответствии с настоящим изобретением можно получить новый полипептид или его соль, имеющие противовирусную активность в отношении вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), а также противо-ВИЧ средство, содержащее данный полипептид или его соль в качестве эффективного ингредиента.

Ниже приведены два рабочих примера, которые иллюстрируют два случая получения соединения формулы 1.

Cлучай 1. Способ получения соединения, когда А₁=H.

Когда А₁= H, этот случай соответствует соединению, которое начинается с триптофана (Trp) в положении +2 в формуле (1).

Этот вариант уже был проиллюстрирован соединением (1) в таблице 3. Соединение (1) получают только изменением наименования соответствующего целевого продукта из (А) в (1) по примеру 1 (стр. 16) и заменой операции (4) на странице 17 так, как это показано ниже, операциями (1) (3) и (5) (6), сохраняемыми в том виде, как они присутствуют.

Операция (4) должна быть изменена следующим образом.

(4) Введение аминокислот в положениях с 15- по 2-.

Подобно изложенному выше, остатки Lys(Boc), Arg(Mtr) Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Ile, Gly, Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl) и Trp в соответствии с последовательностью, начиная с С-концевой аминокислоты, последовательно вводились в смолу DMBHA с получением пептида (1) на смоле, защищенного защитной группой.

Случай 2. Способ получения соединения, когда A₁=лизин.

Получение соединения 23 должно быть дополнено следующим новым примером 4, причем общая схема синтеза остается по существу той же, что дана на фиг. 1.

Пример 4.

Синтез полипептида (23) следующей формулы:



(1) Введение в аминометильную смолу Fmoc-DMBHA-CH₂CH₂COOH (3-(-Fmoc-амино-4-метоксибензил)-4-метоксифенил)пропионовой кислоты.

Процесс должен проводиться в тех же условиях, что и в примере 1.

(2) Введение лизина из положения 17 в смолу DMBHA.

После удаления Fmoc-групп из смолы DMBHA, полученной в (1) с помощью 20% -ного пиперидина (диметилформамид, 2,5 экв. Fmoc Lys(Boc)-OH было добавлено в расчете на DMBHA-смолу и реакцию конденсации осуществляли в ДМФ в соответствии с методом DIPCDI-HOBt.

За развитием реакции конденсации следили с помощью нингидринного теста по методике, описанной в Kaiser E. и др. (And Biochem, 34, 595 (1970)).

(3) Введение цистеина из положения -16:

После удаления Fmoc-групп из DMBHA-смолы, полученной в (2), в которую был введен лизин, с помощью 20%-ного пиперидина (ДМФ, добавлено 2,5 экв. Fmoc-Cys(MBzl)-OH в рассчете на DMBHA смолу и проведена реакция конденсации в ДМФ методом DIPCDI-HOBt. Развитие реакции конденсации оценивалось аналогично тому, как указано в (2), согласно нингидринному тесту.

(4) Введение аминокислот из положений от 15- до 1-.

Как и выше, в смолу DMBHA были последовательно введены остатки Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr-(t-Bu), Cys(MBzl), Ile, Gly, Lys(Boc), Tyr(t-Bu), Cys-(MBzl); Lys(Boc), Arg(Mtr), Tyr(t-Bu), Cys(MBzl), Trp и Lys(Boc) в соответствии с последовательностью, начиная с С-концевой аминокислоты, с получением пептида (23) на смоле, защищенного блокирующей группой.

Каждая реакция конденсации аминокислоты, осуществляемая твердофазным синтезом, проводилась таким же образом, как и процесс по примеру 1 (таблица 1).

(5) Получение пептида (23) удалением защитных групп и стадия выделения смолы и частичная очистка.

Процесс следует проводить так же, как и в примере 1.

(6) Получение полипептида (23) окислением на воздухе.

Процесс следует проводить так же, как в примере 1.

Величина удельного вращения []²_d⁰, полученного полипептида (23) составила +18,6^o (C=0,1; 1N AcOH).

Для доказательства того, что положения 3- и 16-, а также положения 7- и 12- нового полипептида каждое соединено дисульфидным мостиком, использован полипептид А по примеру 1.

а) Новые полипептиды благодаря наличию четырех Cys остатков в положении 3, 7, 12 и 16 и благодаря присутствию остатка Gly, в положении 10 имеют -слоистую структуру, так что часть его в положениях 9 и 10 находится в повернутом положении по отношению к b-витку и пептидная часть с положения 3 до положения 8 и пептидная часть с положения 11 до положения 16 располагаются лицом друг к другу, и, кроме того, четыре Cys остатка в положениях 3- и 16- и в положениях 7- и 12- легко связываются химически при окислении на воздухе двумя соответствующими дисульфидными мостиками (-S-S-) (см. описание, стр. 13).

Что касается образования восстановленной формулы (Cys-SH) полипептида, то на полипептид действуют восстановительными агентами, такими как: 2-меркаптоэтанол и дитиотрейтол, и, таким образом, может быть установлено наличие восстановленной формы полипептида (см. описание, стр. 9 и стр. 18).

Каждая форма окисленного или восстановленного полипептида проявляет одинаковую степень воздействия на антивирусную активность по отношению к вирусу иммунодефицита человека (СПИД). Сравните символы (3) и (3Н) в таблице 3 описания.

(b) Доказательство факта, что в молекуле полипептида А отсутствует группа Cys-SH (пример 1).

Наличие остатка Сys-SH в полипептиде А определялось методом Ellman/G.L. Ellman, Arch. Biochem Biophys 82, стр. 70 (1959).

Более детально: раствор полипептида А обрабатывали реактивом DTNB 5,5-дитио-бис(2-нитробензойная кислота) и образующуюся 2-нитро-5-меркаптобензойную кислоту анализировали на спектрофотометре (при длине волны 412 нм).

В результате не наблюдалось абсорбции при длине волны 412 нм и, таким образом, было подтверждено отсутствие -SH групп в молекуле полипептида [a]

(c) Доказательства факта, что дисульфидные мостики в полипептиде [A] образуются соответственно между Cys положений 3- и 16- и между Cys положений 7- и 12-.

Положение дисульфидных мостиков в полипептиде [A] определялось из аминокислотных составов пептидов, которые были получены триптическим расщеплением исходного полипептида [A] с использованием следующей методики:

32 мкг полипептида [A] расщепляли трипсином в течение 12 часов при 37^oC в соотношении энзима к субстрату 1:32 (по весу) в 80 мкл раствора аммонийной соли муравьиной кислоты с концентрацией 50 мМ (рН 6,5), содержащего й мМ СаСl₂.

Продукт расщепления разделяли с применением обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с Cosmosil 5C₁₈-P (4,6x250 мм).

Элюирование осуществлялось с линейным градиентом 050% ацетонитрила в 0,1% трифторуксусной кислоте в течение 50 минут.

Хроматограмма процесса изображена на фиг. 4.

Каждый из фрагментов Р-1 и Р-2 анализировали на автоматическом пептидном анализаторе и их аминокислотные составы показаны в табл. 4.

Из результатов таблицы 4 стало известно, что структура полипептидов (Р-1 и Р-2), образующихся в результате расщепления трипсином полипептида А формулы:



имеет следующий вид:

Фрагмент Р-1 Фрагмент Р-2

2 3 4 5 6 7 8 9

Trp Cys Tyr Arg OH Lys Cys Tyr Arg OH

Lys Cys Arg NH₂ Gly Ile Cys Tyr Arg OH

15 16 17 10 11 12 13 14

Таким образом, результаты подтверждают, то два дисульфидных мостика расположены между положениями Сys 3- и Cys-16 и положениями Cys7- и Cys12-.

Примеры, иллюстрирующие фармацевтическую композицию.

Капсулы для орального применения

Полипептид [A] (активный ингредиент) 100 мг

Кукурузный крахмал 300 мг

Стеарат магния 10 мг

Микрокристаллическая целлюлоза 590 мг 1000 мг

Компоненты перемешивают до получения однородной смеси и наполняют ею твердые желатиновые капсулы (200 мг на каждую).

Препарат для инъекций

Полипептид [3] (активный ингредиент) 10 мг

Кондроитин сульфат натрия 10 мг

Указанные компоненты растворяют в 2 мл 5%-ного водного раствора маннита (для переливания крови) и полученный раствор подвергают стерильной фильтрации. Фильтрат растворяют в 200 мл 5%-ного раствора маннита (для переливания крови) и полученный раствор используют для внутривенного вливания.