тетрапептид trp-nle-asp-phenh-ch(ch₃)₂, обладающий анксиолитической активностью

Формула изобретения

Тетрапептид Trp-Nle-Asp-PheNH-CH(CH₃)₂, обладающий анксиолитической активностью.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к синтезу пептидов, обладающих анксиолитической активностью (способностью купировать состояние тревоги).

Известен пептид - синтетический аналог эндогенного пептида тафтцина (Thr - Lys - Pro - Arg - Pro - Gly - Pro), который при периферическом (внутрибрюшинном) введении в дозах 200-3000 мкг/кг купирует состояние тревоги у животных с генетически высоким уровнем тревоги (В журнале "Высшая нервная деятельность" имени И.П.Павлова, 1998; 48(1): 153). Недостатком данного пептида является его низкая анксиолитическая активность (купирование состояния тревоги регистрируется при высоких дозах пептида), а также большая трудоемкость и, следовательно, более высокие экономические затраты при его синтезе.

Известен пептид - эндогенный тетрапептид холецистокинина Trp - Met -Asp - PheNH₂ (ССК-4, или тетрагастрин) (В журнале "European Neuropsychopharmacology", 1996, V. 6, P. 263). Недостатком этого тетрапептида является его анксиогенная активность, что ограничивает его использование в качестве лекарственного средства. При введении тетрагастрина у здоровых людей в 17% случаев наблюдаются признаки тревоги или паники, а у больных с паническим состоянием в 90% случаев регистрируется увеличение выраженности панических признаков (В журнале "J. Psychiatry-Neuroscience", 1991, V. 16, N2, P. 91).

Техническим результатом изобретения является создание тетрапептида Trp - Nle - Asp - PheNH -CH(CH₃)₂, который обладает более высокой анксиолитической активностью без побочных эффектов, что способствует расширению арсенала средств для купирования состояния тревоги.

Этот результат достигается синтезом тетрапептида Trp - Nle - Asp - PheNH -CH(CH₃)₂, формулы:



Не вытекает из известного уровня техники, что замена остатка метионина на остаток норлейцина и C-концевой амидной группы на изопропиламидную в структуре эндогенного ССК-4 будет способствовать наличию анксиолитической активности, что делает возможным использование заявляемого тетрапептида в качестве основы для разработки лекарственных средств, обладающих анксиолитической активностью.

Данный пептид представляет собой белый порошок, растворимый в воде с 20% этанола или ацетонитрила, уксусной кислоте, нерастворимый в гексане, эфире. Пептид гомогенен по данным тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, охарактеризован данными количественного аминокислотного анализа и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР).

Синтез пептида осуществляют классическим методом в растворе путем последовательного наращивания пептидной цепи по одной аминокислоте, начиная с C-конца, с использованием активированных эфиров Z, Boc-аминокислот. Боковая карбоксильная функция аспарагиновой кислоты защищалась трет-бутильной группой. Деблокирование Boc-, Bu^t- защищенного тетрапептида проводят действием трифторуксусной кислоты (ТФА) с добавкой 5% деионизованной воды и 5% этандитиола. Очистку целевого продукта проводят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Ниже приведен пример получения заявляемого препарата.

В работе используют L-аминокислоты и их производные фирм Reanal (Венгрия), Bachem, Fluka (Швейцария).

Тонкослойную хроматографию (ТСХ) осуществляют на хроматографических пластинках Kieselgel 60 (Merck, Германия) в системах растворителей: хлороформ - метанол - 50% уксусная кислота 90:10:2 (А); этилацетат - гексан 1:1 (Б), хлороформ - метанол - 50% уксусная кислота 85:15:2 (В), хлороформ - метанол - 32% уксусная кислота 15:4:1 (Г). Вещества обнаруживают на пластинках с помощью хлорбензидинового реагента. Гидрирование пептидов проводят в присутствии 10% Pd/C (палладий на угле) фирмы Fluka или Merck (5-10% по весу).

Приведенные температуры плавления (не скорректированы) определяют на нагревательном столике Boetius (Германия).

N, N-диметилформамид (DMF) перегоняют над нингидрином и окисью бария, хлористый метилен промывают концентрированной серной кислотой и водой, сушат над CaCl₂, перегоняют над CaCl₂, затем над гидридом кальция.

Для экстракции из водных растворов, кристаллизации применяют растворители марок ч. и х.ч., для ВЭЖХ - ацетонитрил (Technofarm, Россия).

Аминокислотный анализ пептидов, гидролизованных 6 н. HCl с 2% тиогликолевой кислоты при 110^oC в течение 24 ч, проводят на автоматическом анализаторе Biotronik LC 5001 (Германия).

Аналитическую ВЭЖХ целевого продукта проводят на приборе Gilson (Франция) на колонке (4.6х250 мм) Beckman (Ultrasphere ODS) в условиях градиентной элюции буфером Б (80% ацетонитрила + 20% буфера А) в буфере А (0.1% водная трифторуксусная кислота). Детекцию осуществляют при длине волны 220 нм. Препаративную ВЭЖХ тетрапептида проводят на колонке Диасорб 130 C16T (24х250 мм).

Растворы упаривают на роторном испарителе Buchi (Швейцария) при 40^oC.

Z-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (I). К раствору 1.26 г (3 ммоль) Z-Phe-ONp в 10 мл метанола прибавляют 10 мл 5% раствора изопропиламина в хлороформе, выдерживают 12 ч, упаривают досуха, продукт переосаждают из изопропилового спирта гексаном. Получено 1,0 г (96.7%) соединения (I). R_f 0.86 (А), 0.94 (Г). Т.пл. 154-155^oC.

Z-Asp(OBu^t)-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (II). 0.50 г (1.5 ммоль) соединения (I) гидрируют в 5 мл смеси метанола, этанола и воды в присутствии Pd/C. Катализатор отфильтровывают, промывают метанолом, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в 5 мл DMF, к полученному раствору прибавляют 0.53 г (1.2 ммоль) Z-Asp(OBu^t)ONp. Через 16 ч реакционную смесь концентрируют в вакууме, к остатку добавляют 50 мл 5% раствора NaHCO₃. Выпавший белый осадок отфильтровывают, промывают на фильтре водой до нейтральной реакции, переосаждают из изопропилового спирта гексаном. Получено 0.60 г (98%) соединения (II). R_f 0.89 (А), 0.50 (Б).

Z-Nle-Asp(OBu^t)-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (III). 0.60 г соединения (II) растворяют в 5 мл этанола и гидрируют аналогично соединению (I). Полученный в виде масла продукт гидрирования растворяют в 5 мл DMF, к раствору прибавляют 0.46 г (1.2 ммоль) Z-Nle-ONp. Через 16 ч реакционную смесь обрабатывают аналогично соединению (II). Получено 0.58 г (77%) соединения (III). Rf 0.75 (А), 0.30 (Б).

Boc-Trp-Nle-Asp(OBu^t)-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (IV). 0.30 г (0.48 ммоль) соединения (III) гидрируют в этаноле аналогично соединениям (I) и (II). Полученный в виде масла продукт растворяют в 3 мл DMF, к раствору прибавляют 0.21 г (0.5 ммоль) Boc-Trp-ONp. Через 16 ч реакционную смесь обрабатывают аналогично соединениям (II) и (III). Получено 0.28 г (71.8%) соединения (IV). R_f 0.34 (А), 0.57 (В).

Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH₃)₂ (V). 0.16 г (0.21 ммоль) соединения (IV) растворяют в охлажденной до 0^oC смеси 9 мл трифторуксусной кислоты, 0.5 мл деионизованной воды и 0.5 мл этандитиола. Через 1ч реакционную смесь концентрируют в вакууме, пептид осаждают холодным сухим эфиром. Сырой продукт деблокирования очищают методом препаративной ВЭЖХ на обращенной фазе в условиях: колонка Диасорб 130 C16T (24х250 мм), градиентная элюция буфером Б в буфере А (А - 0.1% ТФА, Б-80% ацетонитрила в А) со скоростью 0.5% в мин, скорость потока 4 мл/мин, детекция при 220 нм. Получено 0.11 г (75%) соединения (V) в виде лиофилизата. R_f 0.28 (В), 0.55 (Г). R_t 18.8 мин в условиях: колонка Beckman (Ultrasphere ODS 4.6 x 250), градиентная элюция буфером Б в буфере А от 20 до 80% в течение 30 мин (буфер А - 0.1% ТФА, буфер Б - 80% ацетонитрила в буфере А). Т.пл. 132 -140^oC.

Пример 1. В эксперименте исследуют анксиолитическую активность заявляемого соединения. Крыс (самцы) породы Вистар начальной массы 100-120 г делят на группы с различным уровнем эндогенной тревоги в тесте конфликтной ситуации или тесте Вогеля (В журнале "Psychopharmacol.", 1971, V. 21, P. 1).

Тестирование животных в тесте Вогеля проводят с использованием камеры "Lick supression test" фирмы "Coulbourn" (USA). За 72 часа до эксперимента животных лишают воды при избытке стандартного брикетированного корма, а за 24 часа до тестирования животных обучают навыку обнаружения источника воды. Затем в условиях подключения электрического тока (в возрастающем режиме от 0,2 до 1,0 mA) к электродному полу камеры и поилке с водой регистрируют количество подходов животного к поилке. Отсутствие подходов к поилке при увеличении силы тока позволяет говорить о повышенном уровне эндогенной тревоги у животных. Результаты определений приведены в табл.1.

Как следует из результатов, представленных в табл. 1, животные I группы подходят к поилке только при силе тока 0.2 mA, животные II группы - при 0.2, 0.5 и 1.0 mA, что свидетельствует о высоком и низком уровне эндогенной тревоги у животных I и II групп соответственно.

Далее животных I и II групп с высоким и низким уровнем тревоги соответственно случайным образом разделяют на подгруппы по 10 крыс в каждой. В каждой группе с использованием слепого контроля животным одной подгруппы вводят заявляемое соединение, а другой плацебо - 0,9% раствор NaCl. Инъекцию заявляемого соединения проводят внутрибрюшинно в дозе 2,0 мкг/кг веса животного. Спустя 15 минут животных вновь тестируют в тесте Вогеля, как описано выше, регистрируя количество подходов к поилке и количество шоков, получаемых животным во время нахождения у поилки при силе тока 0.5 mA. Увеличение этих показателей в опытной группе животных по сравнению с контрольной группой, получавшей 0,9% раствор NaCl, является показателем наличия у исследуемого соединения анксиолитической активности. Результаты определений приведены в табл. 2.

Как следует из результатов, представленных в табл. 2, у животных с высоким уровнем тревоги количество подходов к поилке и количество шоков, получаемых животным во период нахождения у поилки, достоверно ниже, чем у животных с низким уровнем тревоги.

При введении заявляемого соединения животным с низким уровнем тревоги регистрируемые показатели не изменяются. При введении же заявляемого соединения животным с высоким уровнем тревоги количество подходов к поилке и количество шоков, получаемых в период нахождения животных у поилки, достоверно возрастает по сравнению с группой, получавшей плацебо, и достигают значений, регистрируемых у животных с низким уровнем тревоги. Эти результаты свидетельствуют, что при периферическом введении заявляемого соединения в дозе 2 мкг/кг веса наблюдается купирование состояния тревоги, что позволяет говорить о наличии у исследуемого соединения анксиолитической активности.

Пример 2. Наличие анксиолитической активности у заявляемого тетрапептида оценивают в тесте "поднятого 4-лучевого радиального лабиринта" (в книге "Методики и основные эксперименты по изучению мозга и поведения", М.,1991). Поднятый 4-лучевой лабиринт состоит из 4-х лучей, перпендикулярно скрепленных между собой. Вся установка поднята на ножке на высоте 70 см от пола. Каждый луч имеет длину 45 см ширину 8 см. Два луча затемнены высокими стенками, два - остаются открытыми, освещенными.

Опыты проводят на животных с высоким и низким уровнем эндогенной тревоги. Разделение животных проводят способом, описанным в примере 1. Далее животных с установленным уровнем тревоги случайным образом разделяют на подгруппы по 10 крыс в каждой. С использованием слепого контроля животным одной подгруппы вводят заявляемое соединение, а другой плацебо - 0,9% раствор NaCl. Заявляемое соединение вводят внутрибрюшинно в дозе 2,0 мкг/кг веса животного за 15 минут до тестирования. Далее животное помещают в центр установки и позволяют исследовать лабиринт в течение 5 минут, регистрируя при этом следующие показатели: число переходов из одного луча на другой (I); число выглядываний из темных лучей (II); число выходов на открытые лучи (ОЛ) (III); время пребывания на открытом луче (IV); время замирания животного (V). Увеличение показателей I, II, III и IV при уменьшении показателя V свидетельствует об уменьшении состояния тревоги у животных. Результаты тестирования представлены в табл. 3.

Как следует из результатов, представленных в табл. 3, у животных с высоким уровнем тревоги показатели I, II, III и IV ниже, а показатель V выше, чем у животных с низким уровнем тревоги. При введении заявляемого соединения животным с низким уровнем тревоги ни один из регистрируемых показателей не изменяется. При введении исследуемого соединения животным с высоким уровнем тревоги показатели I, II, III, IV увеличиваются, а показатель V снижается, достигая при этом значений, регистрируемых у животных с низким уровнем тревоги. Эти результаты свидетельствуют, что при периферическом введении заявляемого соединения в дозе 2 мкг/кг веса наблюдается купирование состояния тревоги, что позволяет говорить о наличии у исследуемого соединения анксиолитической активности.

Пример 3. В эксперименте исследуют способность заявляемого соединения изменять плотность бензодиазепиновых рецепторов тканей мозга крыс. Плотность бензодиазепиновых рецепторов (или число мест связывания специфического лиганда - B_max) является одним из показателей уровня эндогенной тревоги у животных (в журнале Amer. J. Physiology, 1984, v. 246, p.471; в журнале "Экспериментальная и клиническая фармакология", 1999, N3, т.62, стр. 57). Определение B_max выполняют с помощью радиорецепторного метода.

Опыты проводят на животных с высоким и низким уровнем эндогенной тревоги. Разделение животных проводят способом, аналогичным приведенному в примере 1. Животных с установленным уровнем тревоги случайным образом разделяют на подгруппы по 10 крыс в каждой. С использованием слепого контроля животным одной подгруппы вводят заявляемое соединение, а другой - плацебо (0.0% раствор NaCl). Заявляемое соединение вводят внутрибрюшинно в дозе 2 мкг/кг. Через 15 минут после введения заявляемого соединения животных забивают декапитацией и выделяют средний мозг. Ткань мозга гомогенизируют в 25 объемах 50 мМ трис-HCl буфера (pH 7,4; 4^oC) в гомогенизаторе типа Даунса. Полученную суспензию центрифугируют при 30000 g 15 минут при 4^oC. Надосадочную жидкость удаляют, осадок ресуспендируют в первоначальном объеме 50 мМ трис-HCl буфера (pH 7,4; 4^oC) и вновь центрифугируют Процедуру центрифугирования повторяют дважды.

Реакционная смесь общим объемом 0,5 мл содержала: 250 мкл трис-HCl буфера, 50 мкл меченого лиганда, 150 мкл суспензии мембранного белка, конечная концентрация которого составляет от 0,2 до 0,8 мг/мл. В качестве специфического лиганда бензодиазепиновых рецепторов используется меченный тритием диазепам (³H-диазепам). Реакцию связывания проводят в течение 1 часа при 4^oC. Специфическое взаимодействие метки с бензодиазепиновыми рецепторами определяют как разницу в количестве связанной с мембранами радиоактивности при общем связывании (в отсутствие немеченого лиганда) и при неспецифическом связывании (в присутствии 1000-кратного избытка немеченого лиганда). Реакцию останавливают быстрой фильтрацией проб через стекловолокнистые фильтры GF/B (Whatman, Англия) с использованием аппарата фирмы Millipore, Франция. Промытые 6 мл трис-HCl буфера, а затем подсушенные на воздухе фильтры помещают во флаконы для сцинтилляционного счета, заливают 7 мл стандартного диоксанового сцинтиллятора. Радиоактивность подсчитывают на сцинтилляционном спектрометре RackBeta 1219 (LKB, Швеция) с эффективностью счета не ниже 30%.

Математическую обработку результатов радиорецепторного анализа проводят с помощью программы LIGAND. Полученные результаты представлены в табл. 4.

Как следует из результатов, представленных в табл. 4, у животных с высоким уровнем тревоги число мест связывания ³H-диазепама ниже, чем у животных с низким уровнем. При введении заявляемого соединения животным с низким уровнем тревоги число мест связывания ³H-диазепама не изменяется, а при введении животным с высоким уровнем тревоги этот показатель достоверно увеличивается, достигая при этом значений, регистрируемых у животных с низким уровнем тревоги. Эти результаты свидетельствуют, что при периферическом введении заявляемого соединения в дозе 2 мкг/кг веса наблюдается купирование состояния тревоги, что позволяет говорить о наличии у него анксиолитической активности. Помимо этого представленные результаты доказывают участие ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса в механизмах реализации анксиолитического эффекта заявляемого соединения.

Пример 4. В эксперименте исследуют влияние заявляемого соединения на двигательную активность животных с низким и высоким уровнем эндогенной тревоги. Для этих целей используют аппарат для мониторинга двигательной активности мелких лабораторных животных фирмы "Coulbourn" (USA). Разделение животных проводят способом, описанным в примере 1. Далее животных с установленным уровнем тревоги случайным образом разделяют на подгруппы по 10 крыс в каждой. С использованием слепого контроля животным одной подгруппы вводят заявляемое соединение, а другой плацебо - 0,9% раствор NaCl. Заявляемое соединение вводят внутрибрюшинно в дозе 2,0 мкг/кг массы животного. Спустя 15 минут животное помещают в исследовательскую камеру и в течение 5 минут регистрируют крупные (large) и мелкие (small) движения. Результаты тестирования представлены в табл. 5.

Как следует из результатов, представленных в табл. 5, при введении заявляемого соединения животным с высоким и низким уровнем тревоги количество регистрируемых движений у животных не изменяется. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии влияния заявляемого соединения на двигательную активность животных с низким и высоким уровнем тревоги, что позволяет говорить об отсутствии у этого соединения побочных эффектов.

Заявляемое соединение - тетрапептид Trp - Nle - Asp - PheNH -CH(CH₃)₂ - имеет преимущества перед известными пептидными соединениями, заключающиеся в наличии более высокой анксиолитической активности и отсутствии побочных эффектов при периферическом способе введения, а также удешевлении способа получения, что позволяет рассматривать его как основу для разработки лекарственного средства для купирования состояния тревоги.