хлоргидрат тетрапептида trp-nle-asp-phe-nh-ch(ch3)2, подавляющий патологическое влечение к морфину

Формула изобретения

Хлоргидрат тетрапептида Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH₃ )₂, подавляющий патологическое влечение к морфину со следующей химической формулой:

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине и биоорганической химии, а именно к синтезу пептидов, подавляющих патологическое влечение к морфину в период отмены наркотика.

Известны химические соединения (МК-329 и L-365,260), являющиеся антагонистами холецистокининовых рецепторов и подавляющие у животных влечение к морфину (Lu L., Huang M., Ma L., Li J. «Different role of cholecystokinin (CCK)-A and (CCK)-B receptors in relapse to morphine dependence in rats» в журнале: Behav. Brain Res., 2001, V.120, P.105-110). Недостатком этих соединений является то, что этот эффект наблюдается у интактных животных при выработке у них положительного подкрепляющего действия морфина в тесте «предпочтения места», что не позволяет рассматривать эти соединения как средства, подавляющие патологическое влечение к морфину в период его длительной отмены.

Известно соединение - модифицированный тетрапептид холецистокинина в виде трифторацетата Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH₃)₂ ·CF₃ СООН. Это соединение обладает антиалкогольной и анксиолитической активностью (патенты на изобретение RU № 2142470, С1 и RU № 2142813, С1), а также способностью подавлять влечение к морфину в период его отмены при опийной зависимости (Шохонова В.А. в автореферате диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, M., 2007, с.20). Трифторацетат тетрапептида Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH₃)₂ представляет собой белый порошок, растворимый в воде с 20% содержанием этанола или ацетонитрила и в уксусной кислоте. Недостатком этой солевой формы тетрапептида является ограниченная растворимость в дистиллированной воде и физиологическом растворе, которые используются при создании инъекционных форм лекарственных средств. К тому же трифторацет не является разрешенной в фармакологии солевой формой пептидного соединения.

Техническим результатом изобретения является расширение арсенала средств, подавляющих патологическое влечение к морфину, посредством создания допустимой в фармакологии солевой формы синтетического пептидного соединения, способного купировать влечение к морфину в период отмены наркотика.

Этот результат достигается применением хлоргидрата тетрапептида Trp-Nle-Asp-PheNH-СН(СН₃)₂ формулы

Не вытекает из известного уровня техники то, что хлоргидрат тетрапептида Trp-Nle-Asp-PheNH-СН(СН₃ )₂ будет обладать способностью подавлять патологическое влечение к морфину в период его отмены, что делает возможным использование заявляемого соединения в качестве лекарственного средства, подавляющего патологическое влечение к морфину в период его отмены.

Способ получения хлоргидрата тетрапептида Trp-Nle-Asp-PheNH-СН(СН₃)₂ заключается в том, что навеску трифторацетата тетрапептида Trp-Nle-Asp-PheNH-СН(СН ₃)₂ суспендируют в воде, используя только стерильную химическую посуду. К полученной суспензии добавляют 2 эквивалента 2N раствора HCl, далее упаривают досуха в вакууме, растворяют в большом количестве воды до получения опалесцирующего раствора, фильтруют через стеклянный фильтр № 4 и лиофилизируют. Во флакон, содержащий 49,5 мг лиофилизата хлоргидрата тетрапептида Trp-Nle-Asp-PheNH-СН(СН₃) ₂, порциями приливают расчетное количество воды (330 мл), переливая полученный раствор в круглодонную колбу. Эту процедуру повторяют до полного переноса вещества из флакона в колбу. Полученный опалесцирующий раствор в течение 1 минуты нагревают до 30°С на водяной бане, затем обрабатывают на ультразвуковой мешалке. Эти процедуры повторяют несколько раз до получения прозрачного раствора. Полученный раствор хлоргидрата тетрапептида Trp-Nle-Asp-PheNH-СН(СН ₃)₂ подвергают стерильной фильтрации через антибактериальные фильтры и разливают по стерильным ампулам (объемом 2 мл) по 1 мл полученного раствора в каждую ампулу (т.е. по 0,15 мг пептида в ампуле). Автоклавирование не допускается! В табл.1 представлены нормативно-технологические характеристики лекарственной формы хлоргидрата тетрапептида Trp-Nle-Asp-PheNH-СН(СН₃) ₂.

Пример 1. В эксперименте исследуют наличие у заявляемого соединения способности подавлять влечение к морфину гидрохлориду в период отмены наркотика в опытных группах по сравнению с контрольными животными. Показателем наличия такой способности у заявляемого соединения является снижение потребления морфина гидрохлорида животными в условиях свободного выбора между 0,05% раствором морфина гидрохлорида и 0,05% раствором хинина.

Моделирование зависимости от морфина гидрохлорида у животных (крыс породы Вистар с начальным весом 180-200 г) осуществляют путем внутрибрюшинного введения раствора морфина гидрохлорида в возрастающих концентрациях от 10 до 50 мг/кг веса животного в течение 14 дней дважды в сутки с интервалом в 8 часов (Шохонова В.А. в автореферате диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук, М., 2007, с.20).

Таблица 1
Нормативно-технические характеристики лекарственной формы хлоргидрата тетрапептида Trp-Nle-Asp-Phe-NH-CH(CH3)2
Молекулярная масса	601(C 33H35N5O5Cl)
Метод синтеза	классический метод синтеза пептидов в растворе
Метод очистки	кристаллизация
Описание	белый порошок или пористая масса без запаха, возможен желтый оттенок
Растворимость	частично растворим в воде - 1 мг пептида в 1.5 - 2 мл деионизованной воды
Прозрачность и цветность	раствор в воде бесцветен, возможна опалесценция
рН	5.5
Чистота по ВЭЖХ	97,3%
Посторонние примеси по ВЭЖХ	менее 3%
Упаковка	ампула из прозрачного стекла
Хранение	при температуре не выше 2-8°С в защищенном от света месте

После формирования зависимости от морфина гидрохлорида животные в течение двух недель получают 0,05% раствор морфина гидрохлорида в качестве единственного источника жидкости без ограничения в потреблении стандартного брикетированного корма. Далее в течение 5-ти дней животных тестируют на потребление морфина гидрохлорида в условиях свободного выбора между 0,05% раствором морфина гидрохлорида и 0,05% раствором хинина, регистрируя суточное потребление жидкостей (1-е тестирование). Затем животных разделяют на три группы: одной группе животных внутрибрюшинно вводят заявляемое соединение в дозе 2,0 мкг/кг (1-я группа). Другой группе животных заявляемое соединение вводят внутрибрюшинно в дозе 20 мкг/кг (2-я группа). Введение заявляемого соединения осуществляют в течение двух недель в условиях отмены морфина гидрохлорида. Третью группу составляют контрольные животные, которым внутрибрюшинно вводят эквивалентный объем 0,9% раствора NaCl (3-я группа). Введение 0,9% раствора NaCl также осуществляют в течение двух недель в условиях отмены морфина гидрохлорида.

По окончании введения заявляемого соединения и 0,9% раствора NaCl животных всех трех групп тестируют на потребление морфина гидрохлорида в условиях свободного выбора между 0,05% раствором морфина гидрохлорида и 0,05% раствором хинина в течение 5-ти дней (2-е тестирование). Полученные результаты представлены в табл.2 и на фиг.1. Символ * обозначает достоверность различий показателей сравниваемых групп животных с доверительной вероятностью Р 0,95 по Стьюденту.

Как следует из результатов, представленных в табл.2 и на фиг.1, после внутрибрюшинного введения заявляемого соединения в дозе 2,0 мкг/кг и 20 мкг/кг показатели потребления морфина гидрохлорида снижаются более чем в два раза. Так, после введения заявляемого соединения в дозе 2,0 мкг/кг потребление морфина гидрохлорида снижается с 16,5±1,0 мг до 6,9±1,0 мг (р 0.05), а после введения заявляемого соединения в дозе 20,0 мкг/кг потребление морфина гидрохлорида снижается с 15,0±6,6 мг до 6,2±0,9 мг (р 0.05). При этом снижаются и показатели индекса предпочтения морфина гидрохлорида, который рассчитывают как отношение количеств потребляемого морфина гидрохлорида к общему количеству потребляемых жидкостей (морфина гидрохлорида и хинина). После введения заявляемого соединения в дозе 2,0 мкг/кг индекс предпочтения морфина гидрохлорида снижается с 0,86±0,03 до 0,26±0,03 (р 0.05), а после введения заявляемого соединения в дозе 20,0 мкг/кг индекс предпочтения морфина гидрохлорида снижается с 0,87±0,09 мг до 0,22±0,04 (р 0.05).

В контрольной группе животных потребление морфина гидрохлорида и индекс предпочтения морфина гидрохлорида после введения 0,9% раствора NaCl остаются на уровне показателей, регистрируемых до введения 0,9% раствора NaCl.

Представленные результаты свидетельствуют о наличии у заявляемого соединения способности подавлять влечение к морфину гидрохлориду в период отмены наркотика. Это действие наблюдается при введении заявляемого соединения в дозе 2,0 мкг/ кг и не усиливается с увеличением дозы заявляемого соединения до 20,0 мкг/ кг.

Пример 2. В эксперименте исследуют динамику потребления морфина гидрохлорида при тестировании опытных групп животных в условиях свободного выбора между 0,05% раствором морфина гидрохлорида и 0,05% раствором хинина до и после 2-недельного введения заявляемого соединения Аналогичные исследования выполняют и в контрольной группе животных до и после введения 0,9% раствора NaCl.

На фиг.2 представлены данные по динамике потребления морфина гидрохлорида животными при тестировании животных в условиях свободного выбора до и после введения заявляемого соединения в дозе 2 мкг/кг веса. Как следует из представленных результатов, потребление морфина гидрохлорида после введения заявляемого соединения (2-е тестирование) достоверно ниже, чем до его введения (1-е тестирование).

На фиг.3 представлены данные по динамике потребления морфина гидрохлорида при тестировании животных в условиях свободного выбора до и после введения заявляемого соединения в дозе 20 мкг/кг веса. Можно видеть, что потребление морфина гидрохлорида после введения заявляемого соединения (2-е тестирование) достоверно ниже, чем до его введения (1-е тестирование). Представленные результаты свидетельствуют о том, что после введения заявляемого соединения в дозах 2,0 мкг/кг и 20 мкг/кг в период отмены наркотика снижается патологическое влечение к морфину гидрохлориду

На фиг.4 представлены данные по динамике потребления морфина гидрохлорида при тестировании животных в условиях свободного выбора до и после введения 0,9% раствора NaCl. Как следует из представленных данных, потребление морфина гидрохлорида после введения 0,9% раствора NaCl, начиная со второго дня 2-го тестирования, достоверно выше, чем до введения 0,9% раствора NaCl (1-е тестирование). Эти данные свидетельствуют о том, что введение 0,9% раствора NaCl в период отмены морфина гидрохлорида приводит к актуализации у животных патологического влечения к морфину гидрохлориду.

Заявляемое соединение - хлоргидрат тетрапептида Trp-Nle-Asp-PheNH-СН(СН ₃)₂ имеет преимущества перед известными соединениями такого же действия, заключающиеся в наличии способности в низких концентрациях (2,0 мкг/кг) подавлять патологическое влечение к морфину гидрохлориду в период отмены наркотика и в отсутствие побочных эффектов. Заявляемое соединение малотоксично. LD ₅₀ у мышей при внутрибрюшинном введении заявляемого соединения в диапазоне доз 2,0-200,0 мкг/кг не определяется.

Заявляемое соединение может быть использовано в качестве лекарственного средства, подавляющего влечение к морфину в период длительной отмены наркотика, что будет способствовать достижению длительных ремиссий одной из форм опийной наркомании - зависимости от морфина - и препятствовать возникновению рецидивов заболевания.