способ дифференциальной диагностики раннего скрытого сифилиса и ложноположительных серологических реакций крови на сифилис

Формула изобретения

Способ дифференциальной диагностики раннего скрытого сифилиса ложноположительных серологических реакций крови на сифилис, включающий иммунологическое исследование крови, отличающийся тем, что определяют активность фагоцитирующих клеток крови методом люминолзависимой биохемилюминесценции с использованием специфического (живая взвесь бледной трепонемы, 1-я проба) и неспецифического (опсонизированный зимозан, 2-я проба) индукторов фагоцитоза и при значении соотношения уровней светосуммы биохемилюминесценции в 1-й пробе ко 2-й (индекс специфического изменения биохемилюминесценции) более 1,1 диагностируют ранний скрытый сифилис, а при значении менее 1,1 - ложноположительный результат серологических реакций на сифилис.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к венерологии, и может применяться для дифференциальной диагностики ложноположительных серологических реакций крови на сифилис и раннего скрытого сифилиса.

Сифилис - инфекционное заболевание, вызываемое бледной трепонемой (БТ) и передающееся преимущественно половым путем. В классическом варианте диагноз манифестной формы сифилиса устанавливается на основании клинической картины заболевания, нахождения возбудителя в отделяемом с поверхности сифилидов, положительных результатов серологического исследования крови.

В последние годы в связи с повсеместным ростом заболеваемости сифилисом увеличилось и число его скрытых форм. При этом ранний скрытый сифилис (РСС) стал регистрироваться значительно чаще, чем поздний и неуточненный и составляет до 60-96% всех больных латентной формой заболевания (К.К. Борисенко и соавт., Вестник дерматол. и венерол., 1989, 11, 25-29). По данным E.B. Соколовского (Е.В. Соколовский Серологическая резистентность после лечения сифилиса. Автореф. дисс. на соиск. учен. степ. докт. мед. наук, Санкт-Петербург, 1995), удельный вес РСС вырос с 1991 по 1994 год в 1,2 раза. Частота же регистрации позднего скрытого сифилиса снизилась в 6 раз. Установить диагноз РСС с помощью обычных критериев не представляется возможным, и он базируется почти исключительно на данных серологического обследования. Вместе с тем при разноречивых или слабоположительных результатах серологических тестов, отсутствии данных конфронтации и анамнестических указаний на наличие в недавнем прошлом клинических проявлений инфекции постановка этого диагноза вызывает большие затруднения. Сложной в этих условиях представляется дифференциация РСС с так называемыми ложноположительными результатами серологических реакций на сифилис (ЛПР), когда специфическая инфекция в организме отсутствует, а серологические реакции дают положительный результат.

ЛПР на сифилис нередко наблюдаются у пациентов с соматическими, инфекционными заболеваниями, диффузными болезнями соединительной ткани, интоксикациями и другими патологическими, а также физиологическими (беременность, менструация, старческий возраст) состояниями. Причины их появления до сих пор остаются дискутабельными.

К настоящему времени известен ряд методов специфической серодиагностики сифилиса, применяемых для уточнения диагноза при манифестных формах сифилиса и в целях дифференциации скрытых форм заболевания и ЛПР (Н.М. Овчинников, В. Н. Беднова, В.В. Делекторский. Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем М., 1987, 126-157). Это реакция иммобилизации бледных трепонем (РИТ), предусматривающая обнаружение антител-иммобилизинов, реакция иммунофлюоресценции (РИФ), определяющая количество флюоресцирующих антител и, наконец, предложенный одним из последних иммуноферментный анализ (ИФА), выявляющий антитела к бледной трепонеме, сходные с антителами РИФ. Все перечисленные реакции могут быть отнесены к аналогам данного изобретения, т.к. предполагают иммунологическое исследование крови путем определения специфических противотрепонемных антител. Вместе с тем в последние годы стало известно, что каждая из них может давать ложноположительные результаты (Неспецифические положительные результаты серологических реакций на сифилис, количественные модификации современных серологических реакций. Методические рекомендации, М. , 1980, 20 с.). Кроме того, специфическая серодиагностика сифилиса, основанная на использовании реакций гуморального типа, занимает много времени. Так, постановка РИТ после получения антигена с последующим чтением результатов укладывается в 22-24 часа (меланжерный метод), РИФ - в среднем в 7 часов, ИФА с предварительной сенсибилизацией планшета антигеном - в 20 - 22 часа, без сенсибилизации - в 2 - 3 часа (в зависимости от квалификации персонала).

Таким образом, неясность происхождения ЛПР на сифилис, трудность их дифференциации со скрытыми формами сифилиса вызывает необходимость поиска новых критериев дифференциальной диагностики специфической и неспецифической серопозитивности, включающих иммунологическое исследование крови с иными принципами постановки реакции. Одним из таких критериев может быть реактивность фагоцитов периферической крови, преобладающими среди которых являются нейтрофильные гранулоциты.

Нейтрофилы высокочувствительны к разнообразным нарушениям внутренней среды и давно служат их индикатором (А.Н. Маянский и соавт., Журн. мед. микробиол. , и эпидемиол., 1987, 7, 109-115). Стремление улучшить диагностические тесты, основанные на лейкоцитарных реакциях, привело к разработке многочисленных способов маркировки функционального раздражения нейтрофила. Среди них большое внимание привлекает изучение их респираторного аппарата. Включаясь в процесс фагоцитоза возбудителя, нейтрофильные гранулоциты реализуют его с помощью заложенных в них механизмов биоцидности, связанных с образованием и выделением активированных форм кислорода.

Из числа известных методов регистрации кислородзависимого метаболизма нейтрофилов наиболее чувствительным является люминолзависимый хемилюминесцентный метод (А. Н. Маянский. В кн.: Моделирование и клиническая характеристика фагоцитарных реакций. Горький. 1989, 5-15). Он основан на регистрации квантов света, возникающих в процессе свободно-радикального окисления вследствие образования активных форм кислорода, с помощью фотоэлектронных устройств. Энергия, приводящая к электронному возбуждению и излучению света, выделяется в процессе быстрого распада тетраоксида - одного из нестойких промежуточных продуктов свободно-радикального окисления насыщенных жирных кислот. Основными излучателями - эмиттерами хемилюминесценции являются кетоны в триплетном состоянии и синглетный кислород.

Спонтанная хемилюминесценция (ХЛ) клеток наблюдается без их стимуляции и отражает исходное состояние метаболических процессов (Ю. А. Владимиров Сверхслабое свечение при биохимических реакциях М., 1966. 102 с, А.И. Журавлев, А.И. Журавлева Сверхслабое свечение сыворотки крови и его значение в комплексной диагностике M., 1975, 128 с). Оно связано, по-видимому, в первую очередь с образованием липидных свободных радикалов в ходе реакций перекисного окисления липидов в биологических мембранах (Ю.А. Владимиров, А.И. Арганов. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах М., 1972, 252 с).

В ходе реактивной или индуцированной ХЛ лежит мобилизация кислорода, его прямое или опосредованное вовлечение в образование высокореактогенных молекул. При этом в зависимости от задач исследователя в систему с изучаемой реактивной ХЛ могут быть введены различные типы индукторов. Результаты индуцированной ХЛ нейтрофилов свидетельствуют об их готовности к индикации дестабилизирующих воздействий (А.В. Резайкина и соавт., 1997, Вести. дерматол. и венерол. 1997, 2, 39-41), к числу которых при сифилисе может быть отнесена бледная трепонема - возбудитель инфекции.

Недавно проведенные исследования (А.В. Резайкина и соавт., 1997) показали, что биохемилюминесцентный (БХЛ) метод может быть использован для оценки реактивности нетрофилов у больных сифилисом. Авторами обнаружено достоверное (p<0,05) возрастание показателей спонтанной БХЛ у больных манифестным, в особенности вторичным свежим сифилисом наряду с отсутствием изменений индуцированной БХЛ. В качестве индуктора был применен опсонизированный зимозан (03). Сведений о состоянии БХЛ фагоцитов периферической крови при раннем скрытом сифилисе и у лиц с ЛПР на сифилис в литературе не обнаружено.

Целью данного изобретения является повышение точности и упрощения способа дифференциальной диагностики ЛПР и РСС, сокращение времени исследования.

Указанная цель достигается тем, что в периферической крови пациента, взятой из пальца, определяется активность фагоцитирующих клеток крови методом люминолзависимой БХЛ с использованием специфического (живая взвесь бледной трепонемы, 1-я проба) и неспецифического (опсонизированный зимозан, 2-я проба) индукторов фагоцитоза и при значении соотношения уровней светосуммы БХЛ в 1-й пробе ко 2-й (индекс специфического изменения БХЛ) более 1,1 диагностируется ранний скрытый сифилис, а при значении менее 1,1 - ложноположительный результат серологических реакций на сифилис.

В качестве прототипа был выбран метод, наиболее часто используемый для дифференциации РСС и ЛПР на сифилис, являющийся "золотым стандартом" специфической серодиагностики сифилиса - РИФ абс. В сравнении с прототипом предлагаемый способ позволяет повысить точность дифференциальной диагностики ЛПР на 15%, упростить ход исследования и сократить его время с 7 до 1,5-2 часов.

Способ осуществляется следующим образом.

В пробирки, содержащие 4,95 мл раствора Хенкса, набирают 0,05 мл крови из пальца (разведение 1: 100) с гепарином (10 ЕД/мл). Люминол готовят из расчета 17,8 мг на 100 мл физиологического раствора с добавлением 1,5 мл 1н. КОН.

В качестве неспецифического индуктора БХЛ используют зимозан, опсониэированный пулом сывороток доноров.

В качестве специфического индуктора БХЛ применяется живая взвесь БТ, полученных из яичка кролика при раннем сифилитическом орхите (7-9 суток после заражения), используемая для постановки РИТ и РИФ (Н.М. Овчинников и соавт, В кн.: Лабораторная диагностика заболеваний, передающихся половым путем, М, 1987, с. 146-148). Взвесь разводится стерильным физ. раствором до концентрации 15-25 особей в поле зрения. Указанное количество ВТ выбрано нами на основании данных литературы: известно, что чувствительность реакций, в частности РИТ и РИП, снижается при увеличении количества возбудителя (Н.М. Овчинников и соавт., 1987), а также опытным путем: установлено, что данная концентрация спирохет является оптимальной и не подавляет хемилюминесцентный ответ фагоцитов. Нами выявлена также возможность использования в реакции не только полученных в день постановки БТ, но и предварительно замороженных и помещенных в пробирки возбудителей.

При изучении реактивности фагоцитов используют следующие комбинации проб: 1 мл крови в разведении 1:100, 0,1 мл люминола и 0,1 мл раствора Хенкса - контроль; 1 мл крови в разведении 1:100, 0,1 мл люминола и 0,1 мл индуктора (03 или взвесь БТ) - опыт.

Пробы с люминолом выдерживают в термостате при 37^oC в течение 15 мин, после чего к ним на 5 мин добавляется соответствующий индуктор (опыт) или раствор Хенкса (контроль).

Хемилюминесцентный ответ фагоцитов регистрируют в течение 60 мин с 10-минутными интервалами. БХЛ каждой пробы измеряется в течение 30 с и записывается как светосумма свечения за 30 с; подсчитывается среднее значение БХЛ по результатам 7-ми измерений. Полученные данные переводятся в число импульсов за 1 мин измерения (умножаются на 2). Для удобства расчетов последняя величина уменьшена в 10 000 раз.

Учет результатов реакции проводится путем вычисления средней величины результатов всех 7-ми измерений за 60 мин (спонтанная БХЛ, имп/мин) и подсчета индекса специфического изменения БХЛ (ИСИ бхл), который рассчитывается следующим образом:



С помощью предлагаемого способа в сифилидологическом отделении Нижегородского НИКВИ обследовано 16 больных ранним скрытым сифилисом и 26 лиц с ложноположительными серологическими реакциями на сифилис. Диагноз устанавливался на основании общепринятых анамнестических, клинических и серологических критериев. Контролем служили данные измерения БХЛ у 10 здоровых лиц.

Проведенные исследования выявили, что средний уровень ИСИ бхл у больных РCС достоверно превышал соответствующие значения у лиц с ЛПР (p< 0,001, табл. 1).

Колебания показателя (М1 ) в группах здоровых, лиц с ЛПР и больных с РСС составили соответственно 0,44 - 0,88; 0,46 -1,08; 1,14 - 5,06.

В связи с тем, что различия в значении изучаемого показателя между здоровыми и лицами с ЛПР были недостоверны (р>0,05), а данные клинического и серологического наблюдения в динамике позволили установить этим пациентам ЛПР, за отрицательный результат теста было принято считать его значения ниже 1,1, что соответствовало верхней границе показателя у лиц с ЛПР. Посколько значение 1,1 практически (после округления цифры) совпадало с нижней границей колебания ИСИбхл у больных РСС, данный результат (1,1) предложено считать сомнительным и при его выпадении исследование повторить.

Специфичность предлагаемого теста при обследовании здоровых (число отрицательных результатов) составила 90% чувствительность у больных РСС (число положительных результатов) - 81,3%.

Сравнительный анализ предлагаемого способа и известного (РИФабс) представлен в табл. 2.

Как видно из данной таблицы, предлагаемый способ дифференциальной диагностики позволяет достигнуть положительного эффекта, который выражается в том, что точность дифференциальной диагностики ЛПР возрастает с 73% при использовании известного способа до 88% при использовании предлагаемого.

Пример 1.

Больная Ж., 21 года, история болезни N 1426, не замужем, имеет случайные половые связи, выявлена при мед. осмотре. Объективно: кожные покровы, половые органы, слизистые оболочки, перианальная область от специфических высыпаний свободны. Патологии внутренних органов не выявлено. Результаты серологического исследования крови: КСР с кардиолипиновым антигеном 4+, титр 1: 40, с трепонемным антигеном 4+, (титр 1:160, микрореакция 4+, титр 1:16, РИТ - 24%, РИФабс и РИФ 200 по 4+, ИСИбхл 2,3 (>1,1). Больной установлен диагноз сифилиса раннего скрытого серопозитивного.

У данной пациентки с классической серологической картиной скрытого сифилиса имеет место типичное для данного заболевания изменение ИСИбхл.

Пример 2.

Больной P. , 76 лет консультирован амбулаторно, (N 566), женат, посторонних половых связей не имеет. Клинических данных за сифилис нет. Выявлена соматическая патология: хронический холецистит, хронический гастрит, хронический панкреатит, облитерируюший эндартериит, гипертоническая болезнь, аденома предстательной железы. Данные серологического обследования: КСР с кардиолипиновым антигеном 4+, титр 1:5, КСР с трепонемным антигеном отрицательная, микрореакция 4+, титр 1: 4, РИТ 16%, РИФабс и РИФ 200 - отрицательные. Значение показателя ИСИбхл 0,9 (<1,1). Больному установлен диагноз: ложноположительные серологические реакции крови.

У данного пациента с типичной клинико-серологической картиной, свидетельствующей о ложной позитивности серологических реакций (обширная внутренняя патология, пожилой возраст, отсутствие "полового" анамнеза, невысокие титры КСР с кардиолипиновым антигеном и микрореакции, отрицательные КСР с трепонемным антигеном, РИТ и РИФ) значения ИСИбхл соответствуют выявленным у подобных пациентов, что подтвердило клинический диагноз.

Пример 3.

Больной А. , 23 года, история болезни N 1094, холост, выявлен при мед. осмотре. Половая жизнь с разными (случайными) половыми партнершами. Объективных клинических данных за сифилис не обнаружено. Данные серологического обследования: КСР с кардиолипиновым антигеном 4+, титр 1:20, с трепонемным антигеном 4+, титр 1:40, микрореакция 4+, титр 1:16, РИТ 26%, РИФ абс и РИФ 200 по 2+, ИСИбхл 2,6 (>1,1). Осуществлялась дифференциальная диагностика между ранним скрытым сифилисом и ложноположительными серологическими реакциями на сифилис (РИТ сомнительная, РИФ - слабоположительные). ИСИбхл положительный (2,6, т.е.> 1,1), что дало возможность поставить диагноз раннего скрытого сифилиса и назначить адекватное лечение.

Пример 4.

Пациентка Л., 29 лет, замужем, амбулаторный N 565. Обратилась в связи с колебаниями серологических реакций крови, которую регистрируются у нее периодически (в том числе во время беременности) с 1987 года. Половая жизнь только с мужем, сопутствующее заболевание: варикозная болезнь. При осмотре объективных данных за сифилис не выявлено. Данные серологического обследования: КСР с кардиолипиновым антигеном 4+, титр 1:5, с трепоноемным 4+, титр 1: 4, РИТ 32%, РИФабс 2+, РИФ 200 отрицательная. ИСИбхл 0,2 (< 1,1). В связи с сомнительными данными серологического обследования (слабоположительные РИТ и РИФабс) проводилась дифференциальная диагностика с ранним скрытым сифилисом. Результат ИСИбхл оказался отрицательным, что позволило установить у пациентки ложную позитивность серологических реакций крови.

Таким образом, учитывая достаточно высокую для реакций клеточного типа чувствительность (81,3%) и специфичность (90%) предлагаемого способа, его информативность (число положительных результатов ИСИбхл в группе лиц со скрытым сифилисом более чем в 6 раз превышало число аналогичных показателей у пациентов с ЛПР), быстроту постановки (1,5 часа от момента взятия крови), малую травматичность (кровь берется из пальца), а также повышение точности диагностики ЛПР на 15% в сравнении с прототипом, можно рекомендовать его использование для дифференциальной диагностики истинной и ложной серопозитивности у пациентов с РСС и ЛПР. Способ может быть дополнением к имеющимся методам исследования в трудных случаях.