способ получения полусинтетического инсулина человека

Формула изобретения

Способ получения полусинтетического инсулина человека, включающий получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина с сопутствующими родственными примесями, которую проводят в присутствии трипсина при молярном избытке ди-третбутилового эфира треонина по отношению к свиному инсулину в водно-органической среде, ингибирование реакции снижением рН, очистку эфира инсулина человека, снятие защитных групп и кристаллизацию инсулина человека, отличающийся тем, что транспептидацию проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим получением кристаллов сырого инсулина человека и повторным проведением ВЭЖХ.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биохимии и фармации и может быть использовано в биохимических, иммунологических и биологических исследованиях, а также при производстве препаратов инсулинов для терапевтических целей.

Известны способы получения полусинтетической субстанции инсулина человека из свиного инсулина и из свиного инсулина с сопутствующими родственньми примесями путем обработки исходного сырья избытком эфира треонина в присутствии трипсина в водной среде при рН ниже изоэлектрической точки (патент №4 601 852, США, 1986 год) или из того же исходного сырья с использованием комбинации двух типов ферментов: карбоксипептидазы А и с последующим присоединением ди-трет-бутилового эфира треонина, который катализируется трипсином в свободном или иммобилизованном состоянии (Норре Seylers, Z. Physiol, Chem. 356, 1631).

Недостатками этих способов является образование промежуточного продукта типа Des-(Asp.sup.A21)-инсулин, который имеет низкую биологическую активность и довольно низкий выход конечного продукта за счет расщепления связи Arg.sup.B22-Gly.syp.B23 трипсином в водной среде.

Наиболее близким к данному изобретению по технической сущности и результату, который достигается, является способ получения полусинтетической субстанции инсулина человека, который включает получение эфира инсулина человека транспептидацией свиного инсулина с сопутствующими родственными примесями избытком трет-бутилового эфира треонина в водно-органической среде в присутствии трипсина и органической кислоты. Эта реакция транспептидации проводится при молярном избытке трет-бутилового эфира треонина по отношению к свиному инсулину более 5 и при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина от 1 до 1-200. Ингибирование реакции осуществляется созданием кислой среды с рН 3, очистка полученного эфира инсулина человека производится анионной и/или катионной хроматографией, снятие защитных групп осуществляется известным способом трифторуксусной кислотой, после чего производится кристаллизация сырого инсулина человека. Условия проведения реакции: количество воды в реакционной смеси - более 10% и менее 50% объемных, температура реакции - менее 50°С (патент №4 343 898, США, С 12 Р 021/04).

Данный способ позволяет получить выход эфира инсулина человека, который определяет выход конечного продукта, более 60%-90%, но и ему присущ тот же недостаток - при использовании фермент-субстратного отношения, равного 1:1-200, в условиях проведения реакции транспептидации образуются примеси (до 7%), которые невозможно удалить на последующих стадиях получения инсулина человека известными способами, в результате чего получается конечный продукт, загрязненный этими примесями. Кроме того, данный способ является трудоемким и многостадийным.

Задачей изобретения является создание способа получения полусинтетического инсулина человека, который гарантирует повышение выхода эфира инсулина человека в результате реакции транспептидации, уменьшение количества трудноудалимых примесей в конечном продукте, обеспечение, таким образом, получения применимого для терапевтических целей биохимически активного, иммунологически безопасного инсулина человека и упрощение уже существующего способа за счет сокращения количества операций.

Поставленная задача решается тем, что в способе получения полусинтетического инсулина человека, включающем получение эфира инсулина человека транспептидацей свиного инсулина с сопутствующими родственными примесями, которую проводят в присутствии трипсина при молярном избытке ди-трет-бутилового эфира треонина по отношению к свиному инсулину в водно-органической среде, ингибирование реакции снижением рН, очистку эфира инсулина человека, снятие защитных групп и кристаллизацию инсулина человека, согласно изобретению транспептидацию проводят при весовом соотношении трипсина и свиного инсулина, равном 1:300-1000, осуществляют дополнительное ингибирование реакции разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза, а очистку эфира инсулина человека осуществляют путем проведения ВЭЖХ с последующим получением кристаллов сырого инсулина человека и повторным проведением ВЭЖХ.

В качестве исходного сырья в заявляемом способе используют свиной инсулин с сопутствующими родственными примесями, такими как свиной проинсулин (до 2%) и продукты модификации и деградации свиного инсулина. Такой инсулин еще называют сырым инсулином.

Водно-органическая среда, которая представляет собой воду со смесью апротонных (например, диметилацетамид, диметилсульфоксид) и протонных (наример, 1,2 этандиол, 1,4 бутандиол, 1,5 пентадиол) растворителей.

Трипсин в представленном техническом решении может быть свиным или бычьим с активностью 40-60 U/мг.

В реакции транспептидации может использоваться ди-трет-бутиловый эфир треонина или его соль.

Дополнительное ингибирование реакции транспептидации разбавлением реакционной смеси водой в 2-3 раза позволяет непосредственно наносить разбавленную смесь на колонку системы высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), что устраняет необходимость выполнения ряда технологических операций, которые описаны в прототипе: то есть осаждения реакционной смеси, отделения осадка центрифугированием, растворения осадка. Необходимость выполнения этих операций после снятия защитных групп также устраняется благодаря прямой кристаллизации.

Кроме того, использование системы ВЭЖХ позволяет эффективно очистить эфир инсулина человека от свиного инсулина, который не прореагировал, и от примесей-спутников реакции транспептидации.

Заключительная очистка уже конечного продукта - инсулина человека, который получается после снятия защитных групп известным способом трифторуксусной кислотой и прямой кристаллизации сырого инсулина человека, также производится на колонке системы высокоэффективной жидкостной хроматографии и позволяет достичь еще лучших результатов.

Условия реакции транспептидации, в частности заявляемое фермент-субстратное соотношение, которое отличает заявляемое решение, позволяют увеличить степень конверсии свиного инсулина или выход эфира инсулина человека до 98% и уменьшить количество трудноудаляемых примесей до 1,5%. На повышение степени устранения примесей направлена и дополнительная очистка конечного продукта системой ВЭЖХ - до 0,9%.

Для постадийного контроля способа получения полусинтетического инсулина человека, оценки конечного продукта и его идентификации были использованы различные методики ВЭЖХ, пептидного картирования и иммуноферментного анализа.

Решение поставленных задач иллюстрируется примерами конкретного выполнения.

Пример 1

100 мг сырого свиного инсулина суспендировали в 0,4 мл воды, добавили 0,05 мл уксусной кислоты, 3 мл 0,63 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 0,25 мг трипсина с активностью 50 U/мг в 0,2 мл 0,05 М кальция ацетата, реакционную смесь перемешивали в течение 16 часов при температуре 23°С. Реакцию ингибировали разбавлением водой в два раза по отношению к объему реакционной смеси, и рН смеси довели до 2,5 10% НСl. Анализ реакционной смеси показал, что выход эфирной производной инсулина составил 98%. Разбавленную реакционную смесь профильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм для нанесения на колонку системы ВЭЖХ. В качестве неподвижной фазы использовали сорбент DAISOGEL ODS-AP (С-18) с размером частиц 15 мкм и размером пор 120 Å. Для подвижной фазы использовали 0,06 М глицин-НСl буфер, который содержал 0,015 М аммония сульфат и пропанол-2 с концентрацией от 20 до 35% при рН 2,5. Фракцию эфирной производной осадили в присутствии ионов цинка при рН от 6,8 до 7,0, отцентрифугировали, полученный осадок промыли водой и высушили в вакуумном сушильном шкафу. 82 мг полученного эфира инсулина человека растворили в 1,0 мл трифторуксусной кислоты, выдержали смесь в течение 40 минут при температуре 25°С, трифторуксусную кислоту отогнали на роторном испарителе при температуре не выше 30°С, полученный сырой инсулин человека растворили в воде и провели прямую цитратную кристаллизацию при рН 5,8.

Кристаллическую суспензию отфильтровали, кристаллы промыли водой, растворили в 0,25 М уксусной кислоте и нанесли на колонку системы ВЭЖХ. В качестве подвижной фазы использовали 0,05 М ацетатный буфер, который содержал пропанола-2 от 10 до 20% при рН 2,5. Фракцию инсулина человека кристаллизовали при рН 5,8, суспензию кристаллов отфильтровали, промыли водой и лиофильно высушили. Выход инсулина человека составил 75 мг. Методом пептидного картирования было доказано, что этот продукт действительно является инсулином человека. Затем методом иммуноферментного анализа было установлено, что остаток свиного проинсулина в конечном продукте составлял менее 1 мкг/г, что отвечает фармакопейным требованиям, согласно которым содержание свиного проинсулина в инсулине человека не должно превышать 10 мкг/г. Что касается других сопутствующих примесей, то с помощью аналитической системы ВЭЖХ было установлено их содержание - не более 0,85%.

Пример 2

50 мг сырого свиного инсулина суспендировали в 0,2 мл воды, добавили 0,025 мл уксусной кислоты, 1,5 мл 0,858 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,5 пентадиола, 0,165 мг трипсина с активностью 40 U/мг в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Реакционную смесь перемешивали в течение 23 часов при температуре 18°С. Дальше поступали, как в примере 1, но реакционную смесь разбавляли водой в три раза по отношению к объему реакционной смеси. Выход эфира инсулина человека составил 40,5 мг, содержание сопутствующих примесей 0,8%.

Пример 3

75 мг сырого свиного инсулина суспендировалии в 0,3 мл воды, добавили 0,04 мл уксусной кислоты, 2,25 мл 1,14 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилсульфоксида и 1,2 этандиола, 0,08 мг трипсина с активностью 60 U/мг в 0,15 мл 0,05 М кальция ацетата. Дальше поступали, как в примере 1. Выход эфира инсулина человека по данным аналитической ВЭЖХ составил 97%. Анализ конечного продукта показал, что содержание в нем сопутствующих родственных примесей составляет 0,84%.

Пример 4

Реакционная смесь и условия реакции, как в примере 2, за исключением количества трипсина - трипсина добавили 0,25 мг в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Реакцию проводили в течение 10 часов при температуре 23°С. По данным ВЭЖХ выход эфира инсулина человека составил 75%, количество трудно устранимых примесей составляло 5%.

Пример 5

Реакционная смесь, как в примере 4, за исключением количества трипсина. Для реакции использовали 0,04 мг трипсина в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Реакционную смесь перемешивали в течение 20 часов при температуре 20°С. Выход эфира инсулина человека составил 70%, а количество свиного инсулина, который не прореагировал, равнялось 10%.

Пример 6

50 мг свиного проинсулина суспендировали в 0,25 мл воды, добавили 0,022 мл уксусной кислоты, 1,5 мл 0,7 М ди-трет-бутилового эфира треонина в смеси диметилацетамида и 1,4 бутандиола, 0,17 мг трипсина в 0,1 мл 0,05 М кальция ацетата. Условия проведения реакции были, как в примере 4. Реакционную смесь осадили 10 объемами ацетона и высушили. Анализ осадка по данным ВЭЖХ показал 85% выход эфирной производной инсулина человека.

Таким образом, как показывают примеры конкретного выполнения, использование заявляемого способа обеспечивает увеличение выхода эфира инсулина человека до 98% и уменьшение содержания сопутствующих родственных примесей в конечном продукте до 0,9% (примеры 1-3). В то же время, как показывают примеры 4 и 5, в которых ферментсубстратное соотношение трипсина и свиного инсулина находятся за заявляемыми пределами, поставленные задачи в отношении качества и количества выходного продукта решить не удается. Пример 6 доказывает, что при оптимальных условиях проведения реакции транспептидации свиной проинсулин, который является примесью в исходном сырье, на 85% конвертируется в эфир инсулина человека, что, как понятно, также способствует увеличению выхода конечного продукта.