способ получения дигидроксиэфиров и их производных

Формула изобретения

1. Способ получения соединения формулы (1)

включающий а) стереоселективное восстановление соединения формулы (2)

для получения соединения формулы (3) и

b) этерификацию соединения формулы (3) в присутствии соединения формулы R''-O-COR' и фермента липазы для получения соединения формулы (1); либо

с) этерификацию соединения формулы (2) в присутствии соединения формулы R''-O-COR' и фермента липазы для получения соединения формулы (4) и

d) стереоселективное восстановление соединения формулы (4) для получения соединения формулы (1),

где Х представляет необязательно замещенную углеводородную связующую группу;

каждый из R и R'' независимо представляет необязательно замещенную углеводородную группу, а

R' представляет необязательно замещенную углеводородную, предпочтительно необязательно замещенную алкилгруппу.

2. Способ по п.1, в котором Х представляет группу -СН₂-.

3. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором R'' представляет винил- или изопропенилгруппу.

4. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором R' представляет замещенную или незамещенную C_1-6 алкилгруппу.

5. Способ по п.4, в котором R' представляет метилгруппу.

6. Способ по п.1, в котором соединения формул (2) или (4) восстанавливают в результате контакта с организмом, выбранным из группы, включающей Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guilermondii, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosopliarum и Torulospora hansenii либо экстрагированным из него ферментом.

7. Способ по п.6, в котором используют целые клетки микроорганизмов.

8. Способ по любому из пп.6 и 7, в котором соединения формул (2) или (4) восстанавливают при рН, составляющем от 4 до 5.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором соединения формул (2) или (3) этерифицируют в присутствии фермента, выбранного из группы, включающей липазу из поджелудочной железы свиньи, липазу Candida cylindracea, липазу Pseudomonas fluorescens, Candida antarctica, фракция В, а также липазу из Humicola lanuginosa.

10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором соединение формулы R''-O-COR' представляет собой винилацетат.

11. Способ получения соединения формулы (5)

включающий

a) получение соединения формулы (1) способом по любому из предшествующих пунктов;

b) взаимодействие соединения формулы (1) с 2,2-диметоксипропаном для получения ацетонида и

c) удаление группы R'-(C=O)-,

в которой Х представляет необязательно замещенную углеводородную связующую группу;

R представляет необязательно замещенную углеводородную группу, а

R' представляет необязательно замещенную углеводородную, предпочтительно необязательно замещенную алкилгруппу.

12. Способ по п.12, в котором R'-(C=O)- удаляют обработкой основным, спиртовым раствором.

13. Соединение формулы (I)

в которой R' представляет СН₃, R представляет необязательно замещенный углеводород, Х представляет -(CH ₂)_n-, a n равно от 1 до 4.

14. Соединение по п.13, в котором R представляет трет-бутил, а Х представляет -CH₂-.

15. Способ получения соединения формулы (1)

включающий этерификацию соединения формулы (3)

в присутствии соединения формулы R''-O-COR' и фермента липазы для получения соединения формулы (1),

в которой Х представляет необязательно замещенную углеводородную связующую группу;

каждый из R и R'' независимо представляет необязательно замещенную углеводородную группу, а

R' представляет необязательно замещенную углеводородную, предпочтительно необязательно замещенную алкигруппу.

16. Способ получения соединения формулы (4)

включающий этерификацию соединения формулы (2)

в присутствии соединения формулы R''-O-COR' и фермента липазы для получения соединения формулы (4),

где Х представляет необязательно замещенную углеводородную связующую группу;

каждый из R и R'' независимо представляет необязательно замещенную углеводородную группу, а

R' представляет необязательно замещенную углеводородную, предпочтительно необязательно замещенную алкигруппу.

17. Способ по любому из пп.15 или 16, в котором R' представляет СН_з , R представляет трет-бутил, а Х представляет -СН₂ -.

18. Способ по любому из пп.15, 16 или 17, в котором R'' представляет винил- или изопропенилгруппу.

19. Способ по любому из пп.15-18, в котором фермент выбран из группы, включающей липазу поджелудочной железы свиньи, липазу Candida cylindracea, липазу Pseudomonas fluorescens, Candida antarctica, фракция В, а также липазу из Humicola lanuginosa.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение относится к стереоселективному способу получения дигидроксиэфиров и их производных.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения разработан способ получения соединения формулы (1)

включающий а) стереоселективное восстановление соединения формулы (2)

для получения соединения формулы (3), и

b) этерификацию соединения формулы (3) в присутствии соединения формулы R"-O-COR' и фермента липазы или гидролазы для получения соединения формулы (1); либо

c) этерификацию соединения формулы (2) в присутствии соединения формулы R"-O-COR' и фермента липазы или гидролазы для получения соединения формулы (4), и

d) стереоселективное восстановление соединения формулы (4) для получения соединения формулы (1),

где Х представляет необязательно замещенную углеводородную связующую группу,

каждый из R и R'' независимо представляет необязательно замещенную углеводородную группу, а

R' представляет необязательно замещенную углеводородную группу, предпочтительно, необязательно замещенную алкильную группу.

Углеводородные группы, представленные X, R, R' или R'', могут быть замещены одним или несколькими заместителями, а также могут быть пер-замещены, например пергалогенированы. Примеры заместителей включают галоген, особенно фтор и хлор, алкокси такой как C _1-4 алкокси, и оксо.

Предпочтительно Х представляет группу формулы -(CH₂)_n-, в которой n равно от 1 до 4, а, наиболее предпочтительно, Х представляет группу -СН₂-.

R" может представлять алкилгруппу, такую как C_1-6 алкилгруппа, или алкилкарбонилгруппу, такую как C_1-6 алкилкарбонилгруппа, например СН ₃(С=O)- или CF₃(С=O)- группа. R'' наиболее предпочтительно представляет винил- или изопропенилгруппу.

R предпочтительно представляет C_1-6 алкилгруппу, которая может быть линейной или разветвленной и замещена одним или несколькими заместителями. Наиболее предпочтительно, R представляет трет-бутилгруппу.

R' может представлять замещенный алкил, зачастую C_1-6 алкилгруппу, такую как CF ₃- или CF₃СН₂- группу, однако он предпочтительно представляет незамещенную C_1-6 алкилгруппу, особенно метилгруппу.

Стереоселективное восстановление соединений формул (2) или (4) предпочтительно включает способы химического или микробиологического восстановления, такие как гидрирование, гидрирование с переносом, восстановление гидрида металла или дегидрогеназы. Примеры подходящего способа гидрирования, например, описанного в Helv. Chim. Acta 69, 803, 1986 (приведен здесь в качестве ссылки), включают применение от 0,01 до 10% (мас./мас.) катализаторов, таких как платина, палладий или родий на гетерогенных подложках, таких как углерод, окись алюминия, диоксид кремния, с применением молекулярного водорода под давлением от 1 до 10 бар, в растворителе, таком как метанол, этанол, трет-бутанол, диметилформамид, трет-бутилметилэфир, толуол или гексан. Альтернативно могут быть использованы гомогенные катализаторы гидрирования, например, описанные в ЕР 0583171 (приведен здесь в качестве ссылки).

Примеры подходящих химических способов гидрирования с переносом включают способы, описанные Zassinovich, Mestroni and Gladiali in Chem. Rev. 1992, 92, 1051 (приведен здесь в качестве ссылки) или Fuji et al. in J. Am. Chem. Soc. 118, 2521, 1996 (приведен здесь в качестве ссылки). Предпочтительные химические способы гидрирования с переносом включают хиральные лигированные комплексы переходных металлов, таких как рутений или родий, особенно хиральные, лигированные диамином, нейтральные, ароматические комплексы рутения. Такое химическое гидрирование с переносом предпочтительно включает кислоту, особенно формиат, такой как формиат триэтиламмония, в качестве источника водорода.

Могут быть использованы реагенты из гидрида металла, например, описанные в Tet. 1993, 1997, Tet. Asymm. 1990, 1, 307 (приведен здесь в качестве ссылки) или J. Am. Chem. Soc. 1998, 110. 3560 (приведен здесь в качестве ссылки).

Примеры подходящего микробиологического восстановления включают взаимодействие соединения формул (2) или (4) с организмом, имеющим свойства микроорганизма и выбранным из Beauveria, предпочтительно, Beauveria bassiana; Pichia, предпочтительно, Pichia angusta или Pichia pastoris, trehalophila, haplophila или membranefaciens; Candida, предпочтительно, Candida humicola, solani, guillermondii, diddenssiae или friedrichii; Kluyveromyces, предпочтительно, Kluyveromyces drosophilarum, или Torulaspora, предпочтительно, Torulaspora hansenii. Восстановление может быть осуществлено путем контакта соединений формул (2) или (4) с ферментом, экстрагированным из вышеперечисленных микроорганизмов. Наиболее предпочтительно, соединения формул (2) или (4) подвергают взаимодействию с микроорганизмом, выбранным из Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guillermondii, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosopliarum и Torulospora hansenii, либо экстрактом из вышеперечисленных организмов.

Данное изобретение предпочтительно включает получение соединения формулы (3) путем селективного восстановления соединения формулы (2) с применением целых клеток или экстрактов из вышеперечисленных микроорганизмов, предпочтительно, Pichia angusta, Pichia pastoris, Candida guillermondii, Saccharomyces carlsbergensis, Pichia trehalophila, Kluyveromyces drosopliarum и Torulospora hansenii.

Данное изобретение наиболее предпочтительно осуществляют, применяя целые клетки организмов, поскольку это устраняет необходимость отделения нужного фермента и обеспечивает кофакторы для взаимодействия.

Возможно применение любых из вышеуказанных видов, однако было установлено, что во многих вариантах осуществления данного изобретения высокий уровень превращения и высокая селективность могут быть достигнуты в результате применения фермента или целых клеток Pichia angusta.

В целом, кофактор, обычно NAD(P)H (никотинамидадениндинуклеотид или никотинамидадениндинуклеотидфосфат) и систему для регенерации кофактора, например глюкозы и дегидрогеназы глюкозы, применяют с ферментами для направления реакции. Поскольку подходящие кофакторы и механизмы восстановления присутствуют в целых клетках, то предпочтительным является применение целых клеток в питательной среде, предпочтительно содержащей подходящий источник углерода, который может включать одно или несколько из следующих соединений: сахар, например мальтоза, сахароза или, предпочтительно, глюкоза; полиол, например глицерин или сорбит; лимонная кислота или низший спирт, например метанол или этанол.

Если во время реакции предполагается рост целых клеток, то в среде должны присутствовать источники фосфора и азота, а также микроэлементы. Это могут быть микроэлементы, обычно применяемые для культивирования организма.

Способ может быть осуществлен путем добавления соединения формул (2) или (4) к культуре растущего организма в среде, способной поддерживать рост, либо к суспензии живых клеток в среде, предпочтительно содержащей источник углерода, но не включающей одно или несколько питательных веществ, необходимых для роста. Также могут быть использованы неживые клетки при наличии необходимых ферментов и кофакторов; при необходимости, они могут быть добавлены к неживым клеткам.

При желании, клетки могут быть иммобилизованы на подложке, подвергаемой взаимодействию с соединением формулы (2) или (4), предпочтительно, в присутствии подходящего вышеописанного источника углерода.

Подходящая величина рН составляет от 3,5 до 9, например от 4 до 9, предпочтительно, максимум 6,5, и, более предпочтительно, максимум 5,5. Наиболее подходящей является величина рН, составляющая от 4 до 5. Целесообразно осуществление способа при температуре, составляющей от 10 до 50°С, предпочтительно, от 20 до 40°С, и, более предпочтительно, от 25 до 35°С. При наличии живых целых клеток вышеуказанных организмов предпочтительно осуществление способа в аэробных условиях. Целесообразно применение скорости аэрации, эквивалентное величине, составляющей от 0,01 до 1,0 объемов воздуха, измеряемого при обычной температуре и давлении, на объем культурной среды в минуту при вышеуказанных значениях рН и температуры, однако следует отметить, что возможны существенные отклонения. Указанные рН, температура и условия аэрации могут применяться во время роста организмов, осуществляемого отдельно от способа.

Очищенные ферменты могут быть выделены известными способами, такими как центрифугирование суспензии распавшихся клеток и отделение прозрачного раствора от дебриса, отделение нужных ферментов от раствора, например, путем ионообменной хроматографии, предпочтительно, с элюированием из колонки жидкостью с нарастающей ионной силой, и/или селективным осаждением в результате добавления ионного материала, например сульфата аммония. Такие действия могут быть повторены многократно при необходимости улучшения чистоты.

Особенно предпочтительным является микробное восстановление соединений формул (2) или (4), которое составляет второй аспект настоящего изобретения.

Этерификацию соединений формул (2) или (3) предпочтительно осуществляют, применяя другой сложный эфир, который присутствует по меньшей мере в молярно-эквивалентном количестве по отношению к спирту и, предпочтительно, представляет собой виниловый эфир (как побочный продукт, ацетальдегид не участвует в обратной реакции). Возможно альтернативное применение ангидрида, такого как уксусный или трифторуксусный ангидрид, либо сложного эфира, такого как этилацетат или фторированный эфир, такой как трифторэтилацетат. Предпочтительно осуществление участкоспецифичной этерификации в органическом растворителе, содержащем менее 1% (мас./мас.) воды, таком как ацетонитрил, этилацетат, тетрагидрофуран, трет-бутилметилэфир, толуол, бутанон, пентанон или гексанон, при температуре, составляющей предпочтительно от 20 до 75°С, более предпочтительно, от 25 до 50°С. Сложные эфиры предпочтительно представляют собой сложные эфиры низших алкановых кислот, имеющих от 2 до 8 атомов углерода, либо их замещенные производные. Может быть необязательно использована инертная атмосфера, например, через раствор может быть пропущен поток азота.

Ферменты могут присутствовать как таковые либо в виде включающих их целых клеток. Предпочтительна их иммобилизация таким образом, чтобы облегчить их отделение от продукта и, при желании, обеспечить их повторное использование.

Предпочтительные ферменты включают липазы, такие как липаза поджелудочной железы свиньи, липаза Candida cylindracea, липаза Pseudomonas fluorescens, Candida antarctica, фракция В, например, выпускаемая под товарным знаком '"Chirazyme L2", липаза из Humicola lanuginosa, например, продаваемая под товарным знаком "Lipolase", либо липаза из Pseudomonas, например липаза, продаваемая под торговым знаком "SAM II", и, более предпочтительно, липазы из Candida antarctica, например, продаваемые под торговым знаком "Chirazyme".

Соединения формулы (1), в которых R' представляет СН₃, R представляет необязательно замещенный гидрокарбил, Х представляет -(CH₃) _n-, a n равно величине от 1 до 4, составляют третий аспект настоящего изобретения. R предпочтительно представляет трет-бутил, а Х наиболее предпочтительно представляет -СН₂-.

Соединения формулы (1) представляют собой промежуточные соединения, применимые для получения фармацевтических соединений. Обычно их подвергают взаимодействию с защитной группой для остатков 1,3-дигидроксила, таких как 2,2-диметоксипропан, с целью получения ацетонида в соответствии с описанием, приведенным в Synthesis 1998, 1713. Затем группа R'-(C=O)- может быть селективно удалена обработкой слабоосновным спиртовым раствором, например К₂СО₃, в соответствии с описанием, приведенным в. патенте США 5278313, либо липазой в водном или органическом растворе, содержащем достаточное количество воды для поддержания гидролиза, с получением соединения формулы (5):

Данный способ получения соединений формулы (5) составляет четвертый аспект настоящего изобретения.

Пример 1

Получение (3R, 5S) трет-бутил 3,5,6-тригидроксигексаноата

В 250-мл круглодонную колбу при перемешивании помещают 20 мл ацетонитрила, 0,405 г (0,662 ммол) ди-mu-хлорбис[(n-цимол)хлоррутений (П)] и 0,492 г (1,34 ммол) ((1S,2S)-(+)-N-(4-толуолсульфонил)-1,2-дифенилэтилендиамина. Раствор обескислороживают, орошая его азотом, а затем поддерживая орошение. Обескислороженный раствор 26 г (0,119 мол) оптически чистого (5S) трет-бутил 3-кето-5,6-дигидроксигексаноата в 15 мл ацетонитрила помещают в реактор и перемешивают при температуре окружающей среды в течение 20 минут. Затем в течение свыше 10 минут добавляют 65 мл 5:2 (мол/мол) смеси дистиллированной муравьиной кислоты и триэтиламина и реакционную смесь перемешивают при температуре окружающей среды в течение 48 часов. К полученному раствору медленно добавляют 80 мл дихлорметана и 120 мл насыщенного бикарбоната натрия. К водному слою добавляют 70 г хлорида аммония и органический слой отделяют. Водный слой промывают еще трижды 90 мл этилацетата, органические фракции объединяют, сушат над сульфатом натрия, а растворитель удаляют, получая 21,1 г сырого масла, в основном содержащего (3R, 5S) трет-бутил 3,5,6-тригидроксигеканоата. Результаты ¹³СЯМР показывают, что соотношение диастереомеров составляет 5,2:1 (3R, 5S):(3S:5S). При последующем взаимодействии материал используют в сыром виде, однако он может быть очищен колоночной хроматографией.

Получение (3R, 5S) трет-бутил 6-ацетокси-З,5-дигидроксигексаноата

В литровую круглодонную колбу при перемешивании помещают 700 мл тетрагидрофурана и 70,7 г (0,32 мол) (3R, 5S) трет-бутил 3,5,6-тригидроксигеканоата, 41 мл (0,46 мол) винилацетата и 6,3 г липазы на подложке Chirazyme L2^TM. После 3-х часов перемешивания при температуре окружающей среды липазу удаляют скринингом, а летучие вещества удаляют дистилляцией в вакууме. Масса сырого масла составляет 78,7 г, а основным компонентом является (3R, 5S) трет-бутил 6-ацетокси-3,5-дигидроксигексаноат. Полученный материал применяют непосредственно на следующей стадии.

Получение (4R, 6S)-6-[(ацетилокси)метил]-2,2-диметил-1,3-диоксан-4-уксусной кислоты, 1,1-диметилэтилэфир

В литровую круглодонную колбу при перемешивании помещают 78,7 г (3R, 5S) трет-бутил 6-ацетокси-3,5-дигидроксигексаноата, 800 мл 2,2-диметоксипропана и 5,7 г n-толуолсульфоновой кислоты. Через 35 минут реакционную массу концентрируют до половины ее объема и добавляют 300 мл дихлорметана и 300 мл 1М бикарбоната натрия. Органический слой отделяют, а водный слой промывают еще трижды, применяя 150 мл этилацетата. Органические фракции объединяют, сушат над сульфатом натрия, а летучие вещества удаляют дистилляцией в вакууме. Получают 92 г сырого масла. Его очищают, вначале пропуская через невысокую колонку из флэш-окиси кремния и элюируя гексаном, а затем гексаном:этилацетатом 85:15 (об./об.), после чего кристаллизуют материал 3 раза из гексана, получая 22,17 г (4R, 6S)-6-[(ацетилокси)метил]-2,2-диметил-1,З-диоксан-4-уксусной кислоты, 1,1-диметилэтилэфир, имеющий, по результатам газовой хроматографии, 99,9%de.

Получение (4R, 6S)-6-(гидроксиметил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-4-уксусной кислоты, 1,1-диметилэфир

В круглодонную колбу емкостью 500 мл при перемешивании помещают 22,17 г (4R, 6S)-6-[(ацетокси)метил]-2,2-диметил-1,3-диоксан-4-уксусной кислоты, 1,1-диметилэтилэфир, 250 мл метанола и 5,05 г дробленого карбоната калия. Реакционную смесь перемешивают в течение 35 минут до завершения гидролиза, затем карбонат калия удаляют скринингом, реакционную массу концентрируют и добавляют к ней 150 мл 5% (мас./мас.) солевого раствора и 150 мл толуола. Органический слой отделяют, а водный слой промывают еще дважды, применяя 250 мл толуола. Органические слои объединяют, промывают три раза 15% (мас./мас.) солевым раствором, а растворитель удаляют вакуумной дистилляцией, получая 17,78 г прозрачного масла, результаты анализа которого показывают, что оно содержит >99% (4R, 6S)-6-(гидроксиметил)-2,2-диметил-1,3-диоксан-4-уксусной кислоты, 1,1-диметилэтилэфир.

Пример 2

Получение (5S) трет-бутил 6-ацетокси-5-гидрокси-3-кетогексаноата

В 250-мл круглодонную колбу при перемешивании помещают 2,32 г (0,0106 мол) (5S) трет-бутил 5,6-дигидрокси-3-кетогексаноата, 40 мл тетрагидрофурана, 0,98 мл (0,0106 мол) винилацетата и 0,22 г липазы на подложке Chirazyme L2^TM. Через 20 минут липазу удаляют скринингом, а летучие вещества удаляют дистилляцией в вакууме, получая 2,96 г сырого масла, определяемого при помощи ЯМР как (5S) трет-бутил 6-ацетоки-5-гидрокси-3-кетогексаноат.

Пример 3

Получение (3R, 5S) трет-бутил 3,5,6-тригидроксигексаноата

Pichia angusta NCYC R230 (размещена в соответствии с Будапештским договором 18 мая, 1995 года) выращивают в мультиферментерной системе Brown Biostat Q в следующей среде (на литр): глюкоза 40 г; MgSO₄ 1,2 г; K₂SO₄ 0,21 г; КН₂PO₄ 0,69 г; Н₃PO₄ (концентрированный) 1 мл; дрожжевой экстракт (Oxoid) 2 г; FeSO₄·7H₂O 0,05 г; пеногаситель (ЕЕА 142 Foammaster), раствор микроэлементов 1 мл (данный раствор содержит на литр CuSO₄·5H₂O 0,02 г; MnSO₄·4Н₂O 0,1 г; ZnSO₄ ·7Н₂O 0,1 г; СаСО₃ 1,8 г).

В каждый из 4-х ферментеров помещают по 250 мл среды и стерилизуют автоклавированием. рН Доводят до 4,5, применяя 7-молярный раствор гидроксида аммония, температуру устанавливают на уровне 28°С, скорость потока воздуха устанавливают на уровне 300 мл/мин, а скорость смесителя - 1200 об./мин. Ферментеры инокулируют клетками, взятыми из чашек с агаром (2% агара), содержащих такую же среду, как описано выше, за исключением того, что концентрация глюкозы составляет 20 г/л. Через 22 часа роста в ферментерах начинают реакцию биовосстановления, добавляя (53) трет-бутил 3-кето-5,6-дигидроксигексаноат; в два ферментера помещают по 3,75 мл, а в остальные два - по 5 мл.

Реакцию продолжают еще в течение 78 часов, до 100% конверсии субстрата. На протяжении данного периода времени к культуре добавляют 50%-ный раствор глюкозы со скоростью, составляющей 1-3 г глюкозы/литр культуры/час, для поддержания жизнеспособности клеток и обеспечения источника восстанавливающей силы. Реакции прекращают, удаляя клетки центрифугированием. К восстановленной, свободной от клеток надосадочной жидкости, добавляют хлорид натрия до конечной концентрации, составляющей 20% мас./об., и смесь экстрагируют три раза равными объемами ацетонитрила. Объединенные экстракты ацетонитрила сушат безводным сульфатом натрия, а растворитель удаляют при пониженном давлении в роторном испарителе (температура водяной бани составляет 45°С), получая вязкое, бледно-желтое масло. Анализы подтверждают, что продуктом каждой реакции является (3R, 5S) трет-бутил 3,5,6-тригидроксигексаноат, а диастереомерный избыток каждого образца указан в нижеприведенной таблице.

Эксперимент	Диастереомерный избыток (%)
1	99,6
2	99,6
3	99,4
4	99,6

Пример 4

Получение (3R, 5S) трет-бутил 3,5,6-тригидроксигексаноата

Pichia angusta NCYC R230 (размещена в соответствии с Будапештским договором 18 мая, 1995 года) выращивают в мультиферментерной системе Brown Biostat Q в следующей среде (содержащей на литр): глюкоза 20 г; сульфат аммония 10 г; дрожжевой экстракт (Oxoid) 2 г; MgSO₄·7H₂O 1,2 г; КН₂ PO₄ 0,69 г; К₂SO₄ 0,21 г; FeSO ₄·7H₂O 0,05 г; Н₃PO ₄ (концентрированный) 1 мл; пеногаситель ЕЕА 142 "foammaster" 0,5 мл; раствор микроэлементов 1 мл (данный раствор содержит на литр Са(СН₃CO₂)₂ 2,85 г; ZnSO₄·7H₂O 0,1 г; MnSO₄ ·H₂O 0,075 г; CuSO₄·5Н₂ O 0,02 г; серная кислота (концентрированная) 1 мл).

В один из ферментеров помещают 250 мл среды и стерилизуют автоклавированием. рН доводят до 5,0, применяя 2-молярный раствор гидроксида натрия. Температуру устанавливают на уровне 28°С, скорость потока воздуха устанавливают на уровне 250 мл мин^-1, а скорость смесителя - 1200 об./мин. Ферментер инокулируют 2,5 мл суспензии клеток в стерильной деионизированной воде, полученной из чашки с агаром, содержащей Pichia angusta NCYC R320. Через 17 часов роста начинают биовосстановление, добавляя 6,36 г (53) трет-бутил 3-кето-5,6-дигидроксигексаноата в виде водного раствора. Одновременно начинают подачу глюкозы в ферментер со скоростью, составляющей 2 г глюкозы л^-1 ч^-1.

Реакцию продолжают еще в течение 78 часов, при этом конверсия субстрата достигает 96%. Исходный материал и продукт подвергают анализу при помощи ВЭЖХ (колонка 'Hichrom S5 CN-250A, температура 35°С, подвижная фаза: водная ТФУ (0,1%):ацетонитрил 95:5, скорость потока 1 мл мин^-1, объем впрыскивания - 5 мл, детектор с показателем преломления). Реакцию прекращают, удаляя клетки центифугированием при 4000 × г в течение 20 минут. рН восстановленной, свободной от клеток надосадочной жидкости доводят до 7,5, применяя 2М NaOH·MgSO₄·1,6H₂O (15% мас./об. от безводного) растворяют в свободной от клеток надосадочной жидкости, а полученный раствор экстрагируют дважды равным объемом 2-пентанона. Фазы с растворителем собирают, а растворитель удаляют при пониженном давлении в роторном испарителе при 45°С, получая оранжевое вязкое масло. Его вновь растворяют в 50 мл сухого, дистиллированного 2-пентанона, а растворитель выпаривают роторным испарением, получая трет-бутил 3,5,6-тригидрокси-гексаноат (5,08 г, 80% выделенный выход). Диастереомерный избыток определяют следующим образом: образец трет-бутил 3,5,6-тригидроксигексаноата (30 мг) подвергают дериватизации взаимодействием в течение по меньшей мере 10 минут при комнатной температуре в избытке трифторуксусного ангидрида, избыточный ангидрид удаляют в потоке сухого азота, а оставшееся масло разбавляют дихлорметаном (1 мл). Образец анализируют, применяя колонну Chiralcel Dex CB (25 м) при температуре 140°С (изотермальная). Диастереомеры элюируют через 14,4 минут (3R, 5S диастереомер) и 15,7 минут (33,53 диастереомер). Данным способом установлено, что диастереомерный избыток образца составляет 99,7%.