способ получения аминокислотной смеси из белкового гидролизата

Формула изобретения

1. Способ получения аминокислотной смеси из белкового гидролизата, полученного путем кислотного, щелочного или ферментативного гидролиза белкового сырья, включающий отделение взвешенных частиц, осветление белкового гидролизата на осветляющем сорбенте, сорбцию аминокислот на катионите в H⁺-форме, элюцию аминокислот с катионита раствором щелочи, микрофильтрацию и сушку продукта, отличающийся тем, что перед сорбцией аминокислот на катионите гидролизат освобождают от аммиака, пропуская его через обессоливающую систему со скоростью от 2 до 3 объемов на объем обессоливающей системы/час, причем обессоливающая система представляет собой систему последовательно соединенных ионообменных колонн с чередованием катионит - анионит, в которой объем анионита обеспечивает избыток его полной ионообменной емкости по сравнению с катионитом на 20-25%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что высота каждой колонны или слоя ионосорбента обессоливающей системы составляет 10% от общей высоты обессоливающей системы, но не более 0,5 м.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в обессоливающей системе в качестве катионита используют сульфостирольный сильносшитый катионит, а в качестве анионита - среднеосновной анионит.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что полная обменная емкость катионита и количество раствора щелочи, взятого для элюции, эквивалентны общему количеству аминокислот, содержащихся в гидролизате.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что элюцию аминокислот осуществляют 2-4 н раствором щелочи, пропуская его со скоростью не более 0,5 объема на объем катионита в час, элюат с концентрацией аминокислот 25-35% подвергают микрофильтрации и распылительному высушиванию.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что при элюции в интервале рН элюата от 3,5 до 8,5 отбирают фракцию моноаминокарбоновых аминокислот, а в интервале рН элюата от 8,5 до 10,5 - фракцию диаминокарбоновых аминокислот, содержащую аргинин, гистидин и лизин.

Описание изобретения к патенту

Данное изобретение относится главным образом к области пищевой промышленности и медицины и касается производства высокоочищенных аминокислотных смесей, используемых в качестве пищевых добавок (БАД) и лекарственных препаратов для повышения иммунитета, борьбы с ишемической болезнью сердца, сахарным диабетом, психическими расстройствами, гепатитом, урогенитальными инфекциями и т.д.

На рынке особенно ценятся препараты, содержащие более 80% свободных аминокислот с зольностью не более 0,2% и чистотой не менее 99%.

Высокая конкуренция БАД, содержащих аминокислоты, требует снижения их себестоимости и продажной цены. Возникает необходимость в новых технологических приемах, повышающих экономическую эффективность производства.

Прототипом изобретения является научно-техническая разработка Московского государственного университета технологий и управления Министерства образования и науки РФ под ред. Филатова O.K. (Москва, 2004 г.)

Недостаток прототипа в том, что, во-первых, используется вакуум-выпарная установка для того, чтобы упарить элюат аминокислот в 1,5 раз и удалить аммиак, который всегда присутствует в любом гидролизате белка, и сконцентрировать раствор перед сушкой. Во-вторых, в том, что емкость катионита используется лишь на 70-80%. Остальные обменные места на смоле занимают аммиак и водород. В-третьих, в том, что в процессе элюции невозможно разделить моноаминокарбоновые аминокислоты и диаминокарбоновые аминокислоты, оказывающие совершенно различное фармакологическое действие на организм.

Целью настоящего изобретения является повышение эффективности ионообменной очистки аминокислот, выделяемых из гидролизатов белка, а вместе с ней и экономической эффективности производства в целом.

С этой целью в способе получения аминокислотной смеси из белкового гидролизата, полученного путем кислотного, щелочного или ферментативного гидролиза белкового сырья, отделяют взвешенные частицы, осветляют белковый гидролизат на осветляющем сорбенте, сорбируют аминокислоты на катионите в H⁺-форме, элюируют аминокислоты с катионита раствором щелочи, микрофильтруют и сушат продукт. Перед сорбцией аминокислот на катионите гидролизат освобождают от аммиака, пропуская его через обессоливающую систему со скоростью от 2-х до 3-х объемов на объем обессоливающей системы/час, причем обессоливающая система представляет собой систему последовательно соединенных ионообменных колонн с чередованием катионит - анионит, в которой объем анионита обеспечивает избыток его полной ионообменной емкости по сравнению с катионитом на 20-25% со скоростью.

При этом высота каждой колонны или слоя ионосорбента обессоливающей системы составляет 10% от общей высоты обессоливающей системы, но не более 0,5 м.

Предпочтительно в обессоливающей системе в качестве катионита используют сульфостирольный сильносшитый катионит, а в качестве анионита - среднеосновной анионит.

При этом:

- полная обменная емкость катионита и количество раствора щелочи, взятого для элюции эквивалентны общему количеству аминокислот, содержащихся в гидролизате;

- элюцию аминокислот осуществляют 2-4 н раствором щелочи, пропуская его со скоростью не более 0,5 объема на объем катионита в 1 час, элюат с концентрацией аминокислот 25-35% подвергают микрофильтрации и распылительному высушиванию;

- в интервале рН элюата от 3,5 до 8,5 отбирают фракцию моноаминокарбоновых аминокислот, а в интервале рН элюата от 8,5 до 10,5 - фракцию диаминокарбоновых аминокислот, содержащую аргинин, гистидин и лизин.

В процессе экспериментальных и теоретических исследований, проведенных заявителем, было установлено, что при любом гидролизе белка вместе с расщеплением аминокислотных цепей происходит частичная деструкция аминокислот с образованием аммиака и других органических веществ, образующих гетероциклические окрашенные соединения. В процессе кислотного гидролиза аммиак находится в форме NH₄CL, а при ферментативном гидролизе - в виде соли с дикарбоновыми аминокислотами: глутаминовой и аспарагиновой. В процессе сорбции аммиак вместе с аминокислотами сорбируется на катионите в виде иона аммония, оказывая конкурирующее влияние.

В процессе элюции аминокислот раствором щелочи с ионообменной колонны сначала выходят моноаминокарбоновые аминокислоты с низкой избирательностью (рН элюата 3,5-8,5). Затем выходят аммиак и диаминомонокарбоновые кислоты с рН 9,5-11,5. Этот процесс изображен на фиг.1.

Как видно из чертежа, выходная кривая элюции имеет плавный характер. Поэтому невозможно разделить диамино- и моноаминокарбоновые аминокислоты.

Фракция диаминомонокарбоновых аминокислот, содержащая лизин, аргинин и гистидин, может использоваться как уникальное средство для лечения сердечных сосудов, сердечной недостаточности и повышения потенции.

Настоящее изобретение позволяет в процессе элюции выделить эту фракцию.

С этой целью аммиак удаляют из гидролизата перед сорбцией аминокислот.

Удаление аммонийной соли может быть сделано с помощью ионообменного обессоливания. Для этого раствор аминокислот и аммиака при рН 6-7 пропускают через систему последовательно соединенных коротких колонн, в которой катионит чередуется с анионитом. В силу большого различия в коэффициентах диффузии аминокислот и аммония (2 порядка) последний задерживается на сильносшитом сульфостирольном катионите, через который аминокислоты свободно проходят между зерен смолы.

Выделившийся протон сорбируется на средне- или слабоосновном анионите. Таким образом, аминокислоты превращаются в цвиттер-ионы и сорбируются на катионите в Н⁺-форме по принципу хемосорбции:

Достоинство этого метода в том, что сток с колонны имеет нейтральную реакцию и может сливаться в канализацию. Кроме того, процесс хемосорбции напоминает реакцию нейтрализации, хотя тепловой эффект составляет всего 3,5-4 ккал/моль вместо 13 ккал/моль при нейтрализации кислоты щелочью.

Большая внутренняя энергия процесса расширяет каркас катионита и позволяет на 100% использовать его обменную емкость.

Отсутствие в ионите аммиака, оказывающего буферное действие на раствор, существенно меняет характер выходной кривой при щелочной элюции аминокислот (см. фиг.2).

Как видно из чертежа, выходная кривая дает перегиб в области рН 7-7,5. Таким образом график показывает две области с резкой границей при указанных значениях рН. На практике это позволяет при элюции аминокислот отдельно отбирать фракции моно- и диаминокарбоновых кислот. Процесс может осуществляться автоматически по команде датчика рН.

Строгая эквивалентность количества щелочи, взятой для элюции, емкости смолы или, другими словами, количеству эквивалентов сорбированных аминокислот, позволяет сразу получить чистый раствор аминокислот, концентрация которого пропорциональна концентрации раствора щелочи. Так, при концентрации щелочи 3 н. концентрация аминокислот в растворе составляет 30-35%. Дальнейшее повышение концентрации щелочи приводит к тому, что моноаминокарбоновые аминокислоты начинают кристаллизоваться непосредственно в приемном сборнике.

Сущность предложенного изобретения заключается в следующем.

Гидролизованный и отфильтрованный нейтральный белковый материал осветляют на осветляющем ионосорбенте типа ИА-4, находящемся в колонне.

Осветленный раствор гидролизата пропускают через обессоливающую систему из 10 ионообменных колонн с катионитом и анионитом со скоростью два-три объема на объем обессоливающей системы в час. Раствор вытесняют с колонны водой. Обессоленный раствор практически не содержит неорганических ионов и аммония. Его электропроводность не превышает 0,5 мк8, рН 9,5-10,5. Раствор пропускают через колонну с катионитом КУ 2×8 в Н ⁺-форме и затем вытесняют в том же направлении водой. Элюцию аминокислот осуществляют, пропуская 2-4 н. щелочь, количество которой полностью соответствует емкости катионита в колонне.

Раствор вытесняют с колонны водой. Элюат подтитровывают 36%-ной HCL до рН 6,5-7,0. Его концентрация составляет 28-35%. Распылительную сушку продукта осуществляют при температуре входящего воздуха 170°С и температуре выходящего воздуха 70-75°С. В другом варианте элюции собирают две фракции: до рН 7,5 и от 7,5 до 10,5. Фракции сушат отдельно, получая два различных препарата.

По сравнению с рассмотренным ближайшим аналогом предложенный способ характеризуется следующими отличительными приемами:

- гидролизат после осветления подвергается обессолиавнию перед процессом сорбции на катионите;

- аминокислоты сорбируются до полного насыщения катионита;

- для процесса элюции используется 2-4 н. щелочь;

- при необходимости собираются раздельно две фракции аминокислот.

Использование указанных приемов позволяет исключить процессы вакуум-выпарки и затраты энергоресурсов, получить новые виды препаратов аминокислот и сделать процесс выделения экономически эффективнее.

Более подробно сущность изобретения объясняют следующие примеры.

Пример 1:

В эмалированный реактор емкостью 630 л загружают 250 л 18%-ной HCL и 130 кг рогокопытной муки. Реактор герметизируют и температуру содержимого поднимают до 127°С с помощью подачи пара в рубашку. Данную температуру поддерживают при перемешивании 6 часов. Затем реактор охлаждают до 60°С и в него заливают 290 л воды. Раствор (600 л), содержащий 78 кг аминокислот, фильтруют на фарфоровом нутч-фильтре через бельтинг-ткань под вакуумом. 30 л маслянистого осадка черного цвета загружают в полиэтиленовые пакеты, а 570 л фильтрата, содержащего 77 кг аминокислот, пропускают через ионообменную колонну снизу, загруженную 700 л смолы ЭДЕ-10п в ОН^--форме, со скоростью 500 л/час. Гидролизат вытесняют с колонны, пропуская через нее 400 л воды. Нейтрализованную фракцию аминокислот собирают по рефрактометру, начиная с показания 1,334 и заканчивая этой же величиной. Собирают 600 л раствора, содержащего 75 кг аминокислот. Данный раствор осветляют на колонне, загруженной 200 л смолы ИА-4 в CL^--форме, пропуская со скоростью 150 л/час снизу колонны, и затем вытесняя его водой. Получают 650 л осветленного бесцветного раствора с содержанием аминокислот 72 кг. Раствор с рН 6,8 пропускают снизу через систему последовательно соединенных ионообменных колонн объемом по 20 л каждая, чередующихся следующим образом: катионит КУ 2×20 в Н⁺-форме - анионит ЭДЕ-10п в OH^--форме. Раствор пропускают со скоростью 400 л/час и затем вытесняют его водой. Контроль сбора аминокислотной фракции ведут также по рефрактометру.

Баланс обессоливающей системы сделан в пользу анионита, поэтому аминокислоты в обессоленном растворе находятся в виде цвиттер-иона, а обессоленный раствор имеет рН 9,8.

800 л полученного обессоленного раствора, содержащего 70 кг аминокислот, пропускают снизу колонны, загруженной 280 л смолы КУ 2×8 в Н⁺-форме со скоростью 140 л/час. Раствор вытесняют с колонны водой. Сток с колонны имеет рН 5,9 и сливается в канализацию. Колонну промывают 300 л дистиллированной воды и затем снизу пропускают 180 л 3 н. раствора щелочи NaOH со скоростью 140 л/час. Вслед за щелочью подают дистиллированную воду. Сбор фракций ведут по рефрактометру. Получают 226 л раствора, содержащего 68 кг аминокислот (30%-ный раствор), который затем пропускают через микрофильтрационную установку и сушат на распылительной сушилке, производительностью 25 л/час по испаренной влаге. Получают 65 кг сухого белого порошка, содержащего 86% свободных аминокислот, 1% влаги и 13% ди- и три-пептидов.

Пример 2:

8 м молочной творожной сыворотки подвергают нанофильтрации на микрофильтрационной установке с мембранами ЭРУ-200-1016, с порогом отсечки 20 кДа и площадью поверхности 26 м². Через 5 часов сыворотка концентрируется до 300 л с содержанием белка 15%. Суспензию загружают в реактор объемом 500 л, вносят 4,5 кг фермента протооризина и перемешивают при температуре 50±1°С в течение 12 часов. Осадок удаляют путем микрофильтрации на установке ММТ-2 на керамических фильтрах. При этом получают 295 л фильтрата, содержащего 35 кг аминокислот. Фильтрат обессоливают на ионообменной системе из последовательно соединенных колонн емкостью по 5 л с катионитом КУ 2×8 в H⁺-форме и анионитом ЭДЕ-10п в ОН^--форме. Раствор пропускают снизу со скоростью 100 л/час, затем его вытесняют с колонны водой. Получают 380 л раствора с электропроводностью 150 мк8, рН 9,6 и содержанием аминокислот 34,5 кг.

Сорбцию аминокислот на катионите КУ 2×8 в H⁺-форме осуществляют, пропуская раствор снизу на колонну с 150 л катионита со скоростью 100 л/час. Раствор вытесняют водой.

Для элюции используют 100 л 3 н. раствора щелочи, который пропускают снизу колонны со скоростью 50 л/час и далее вытесняют водой. Получают 200 л элюата с рН 8,7, содержащего 33,4 кг аминокислот. Раствор подтитровывают до рН 7,0 с помощью 36%-ной HCL и осветляют на колонне, загруженной 50 л смолы ИА-4 в CL^--форме.

250 л раствора подвергают микрофильтрации на керамических мембранах с поверхностью фильтрации 2 м².

Отфильтрованный раствор, не содержащий взвешенных частиц, с концентрацией 13% подвергают распылительному высушиванию. Получают 30 кг препарата аминокислот с чистотой 98,5% и содержанием свободных аминокислот 88,5%.

Пример 3:

5 м³ суспензии пивных дрожжей с концентрацией сухих веществ 10% загружают в аппарат с мешалкой и рубашкой емкостью 6,3 м³ . Затем в аппарат вносят 10 л водной суспензии, содержащей 4 кг фермента амилопротооризина. Температуру смеси повышают до 50°С и поддерживают ее при перемешивании в течение 10 часов. По окончании процесса ферментативного гидролиза суспензию подвергают двухступенчатой микрофильтрации на установке с керамическими мембранами с поверхностью фильтрации 35 м² .

5,5 м³ суспензии, содержащей 130 кг свободных аминокислот, 50 кг пептидов и 20 кг аммиака, пропускают снизу со скоростью 2 м³/час через систему последовательно соединенных колонн, содержащих по 100 л катионита КУ 2×20 и анионита ЭДЕ-10 п. Раствор вытесняют с колонн 1 м³ воды с той же скоростью.

Выход аминокислот контролируют по коэффициенту рефракции, отсутствие солей - по кондуктометру. Предельно допустимый показатель удельной электропроводности составляет 0,1 mS.

Обессоленный раствор аминокислот и пептидов с рН 9,7 пропускают через ионообменную колонну, загруженную 500 л катионита КУ 2×8 в H ⁺-форме со скоростью 250 л/час. Все аминокислоты поглощаются на смоле. С колонны выходит нейтральный сток, содержащий небольшое количество длинноцепочечных пептидов. После промывки колонны 1 м³ воды аминокислоты элюируют с колонны, пропуская снизу 400 л 2,5 н. раствора щелочи со скоростью 200 л/час. Вслед за щелочью на колонну подают деионизованную воду. Сбор фракции аминокислот контролируют по рефрактометру и рН-метру. Собирают 610 л 20%-го раствора аминокислот с рН 9,5, который нейтрализуют 90 л 36%-ной HCL (х.ч.) до рН 6,0.

700 л раствора пропускают снизу через ионообменную колонну, загруженную 150 л осветляющего сорбента ИА-4 в CL^--форме со скоростью 150 л/час. Раствор вытесняют с колонны деионизованной водой. Сбор фракции аминокислот ведут по рефрактометру. В результате получают 780 л 15%-го раствора аминокислот. Его пропускают через микрофильтрационную установку УМТ-6 с полимерными мембранами площадью 2 м² для удаления микровзвесей и микрофлоры.

Стерильный раствор подвергают распылительному высушиванию при температуре входящего воздуха 175°С и выходящего - 70°С. Пылевидные частички улавливаются рукавным фильтром.

Получают 138 кг белого порошка без запаха, содержащего:

- влаги - 1%;

- аминокислот - 87%;

- 2 - 3-звенных пептидов - 12%;

- золы - 0,15%.

Выход продукта от белка, содержащегося в дрожжах, составляет 69%. Аминокислотный состав всех рассмотренных препаратов представлен в таблице.

Таблица
Состав высокоочищенных аминокислотных смесей, полученных путем гидролиза или ферментолиза белковых отходов пищевой промышленности
Аминокислота в % от общей суммы аминокислот	Гидролизат кератина	Ферментолизат пивных дрожжей	Ферментолизат молочной сыворотки
1	2	4	5
Аспарагиновая кислота	8,5	6,25	5,1
Глутаминовая кислота	14,2	8,00	9,8
Серии	5,2	6,95	5,0
Треонин	4,3	6,37	4,8
Глицин	4,8	2,65	2,3
Аланин	4,7	8,15	3,2
Цистин	4,0	1,25	-
Валин	4,2	9.00	7,0
Метионин	2,1	5,20	2,5
Изолейцин	4,5	8,55	4,9
Лейцин	8,2	13,92	11,8
Тирозин	4,9	3,92	3,8
Фенилаланин	6,2	5,77	5,8
Гистидин	4,5	4,07	3,2
Лизин	5,7	2,60	10,5
Аргинин	8,8	3,05	4,7
Пролин	5,1	2,67	10,8
Триптофан	-	-	-