способ лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей

Формула изобретения

Способ лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей путем эндоскопического введения культуры фибробластов под слизистую оболочку под устьем мочеточника, отличающийся тем, что вводят культуру ауто- или аллофибробластов в количестве не менее 4 млн. клеток в сочетании с коллагеном, при этом вводят сначала 2,0 мл 7%-ного коллагена, затем в образовавшийся болюс вводят ауто- или аллофибробласты человека в количестве не менее 4,0 млн. клеток, содержащихся в 1,5-2,0 мл физиологического раствора.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области медицины, а именно к хирургии, и может быть использовано в детской урологии для лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей.

Пузырно-мочеточниковый рефлюкс (ПМР), впервые описанный Земблиновым В.И. в 1883 году, является одной из распространенных аномалий развития мочевыводящих путей у детей. Он встречается у 60-75% больных с расстройствами мочеиспускания и рецидивирующей мочевой инфекцией (Джавад-заде М.Д. Сравнительная характеристика антирефлюксных операций, причины рецидивирования пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей. Урология и нефрология, 1998, №6, с.17). ПМР сопровождается лейкоцитурией у 97% девочек и 83% мальчиков. С другой стороны, у 30-50% детей с инфекцией мочевыводящих путей определяется ПМР (Лопаткин Н.А. Пузырно-мочеточниковый рефлюкс. М.: Медицина, 1990, с.187). По данным разных авторов ПМР у детей, больных пиелонефритом, диагностируют от 35% (Соловьев А.Е. Применение эндоскопического метода в лечении пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей с использованием полиакриламидного геля «Интерфалл». Этюды детской урологии. Запорожье, 2001, с.68), до 60-80% случаев (Терещенко А.В. Мочеточниковый рефлюкс. Киев: Здоров'я, 1986).

Возникнув в раннем возрасте, рефлюкс способствует формированию уретерогидронефроза, присоединению вторичного пиелонефрита, а рефлюкс-нефропатия, сохраняющаяся и после излечения ПМР, включает в себя повреждение всех структурных компонентов нефрона и является основной причиной артериальной гипертензии и терминальной почечной недостаточности в детском возрасте. В связи с этим своевременное лечение ПМР является одной из актуальных проблем.

Основным способом лечения ПМР является оперативный, преимущество которого заключается в быстром достижении прекращения регургитации мочи. Однако для детского организма уретероцистонеостомия является сложным, травматичным вмешательством, которое предполагает также длительные сроки госпитализации; по данным литературы, частота рецидивирования рефлюкса колеблется от 3 до 40%. Возможны осложнения: стеноз мочеточника в отдаленные сроки после операции достигает 5,1%; возникновение рефлюкса в контрлатеральное устье - от 8 до 15-20%; обострение хронического пиелонефрита - до 6% (Лопаткин Н.А. Пузырно-мочеточниковый рефлюкс. М.: Медицина, 1990. - с.187).

Альтернативой оперативного лечения ПМР является его эндоскопическая коррекция, предложенная в 1981 г. E.Matoushek и впервые примененная у детей O'Donell и Puri в 1984 г. В качестве фиксирующих веществ, вводимых под устье мочеточника, применяют тефлоновую пасту (Неменова А.А. Эндоскопическая коррекция пузырно-мочеточникового рефлюкса инъецированием тефлоновой пасты. Урология и нефрология, 1993, №2., с.8-9; Kumar R., Puri P. Endoscopic correction of vesicoureteral reflux in failed reimplanted ureters // Eur.Urol. - 1998. - Vol.33(1). - P.98-10), силикон (Herz D. Efficacy of endoscopic subureteral polydimethylsiloxane injection for treatment of vesicoureteral reflux in children: a north american clinical report // J.Urol. - 2001. - 166 (5).- p.1880), препараты декстраномер-гиалуроновой кислоты (Capozza N., Caione P. Dextranomer/hyaluronic acid copolymer implantation for vesicoureteral reflux: a randomized comparison with antibiotic prophilaxis // J. Urol. Pediatr. - 2002. - Vol.140. - P.230-234; Stenberg A., Larsson E., Lackgreen G. Endoscopic treatment with dextranomer-hyaluronic acid for vesiciureteral reflux: histological findings // J. Urol. - 1998. - Vol.160. - №3. - P.1109-1113; Puri P., Chertin В., Velayughan М. et al. Treatment of vesiciureteral reflux by endoscopic injection of dextranomer/hyaluronic acid copolymer: preliminary results // J. Urol. - 2003. - Vol.170. - №4. - P.1541-1544), альбумин (Alfthan O., Ruutu М. Urologia // Kandidaattikustannus Oy, Helsinki, 1990. P.418), полиакриламидный гель «Интерфалл» (Баруховч В.И., Шинкаренко В.Л., Рубизов Ю.П., Ковалев В.Е. Эндоскопический метод лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса с использованием полиакриламидного геля «Интерфалл». // Клиническая хирургия, 1999(3):53-54; Соловьев А.Е. Применение эндоскопического метода в лечении пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей с использованием полиакриламидного геля «Интерфалл» // Этюды детской урологии. - Запорожье, 2001., с.68); гель «Формакрил» (Островский Н.В. Коррекция пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей субуретеральной инъекцией полиакриламидного геля «Формакрил» // Анналы хирургии, 2000, №6, с.70-71), гель ДАМ + (Осипов И.Б., Лебедев Д.А., Соснин Е.В., Осипов А.И., Бурханов В.В. Оптимизация лечебной тактики у детей с пузырно-мочеточниковым рефлюксом. // III Конгресс педиатров-нефрологов России (материалы), Санкт-Петербург, 2003. Стр.139).

В настоящее время доказано, что тефлон опасен в применении, так как является канцерогеном, имеется риск сосудистой миграции препарата в жизненно важные органы: головной мозг, печень, легкие. Кроме того, возможен стеноз мочеточника в месте введения вещества (Dodat H. Endoscopic treatment of vesicorenal reflux in children // Arch. Pediatr. - 1994. - 1(1). - p.93). Силикон, являясь синтетическим материалом, имеет те же недостатки, что и тефлон, в связи с чем применение данных препаратов в практике должно быть ограниченно.

Известен способ лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей путем эндоскопического введения коллагена под устье мочеточника (Haferkamp A. Pitfalls of reped subureteral boving collagen injection for the endoscopic treatment of vesicoureteral reflux // J. Urology. - 2000. - 163(6). - p.1919). При этом используют бычий коллаген в концентрации 35 мг/мл на 1,5-1,6 мл раствора, который вводится субуретерально. Для пролонгированного действия препарат вводят двукратно.

Использование коллагена по данным литературы имеет высокий процент неудач (Haferkamp A. Failure of subureteral bovine collagen injections for the endoscopic treatment primary vesicoureteral reflux in long-term follow-up // J. Urology. - 2000. - 55(5) - p.759). В связи с частым рецидивом рефлюкса коллаген приходится вводить 2- и 3-кратно. При проведении отдаленных исследований отмечается рецидив ПМР до 9% у пациентов, которым проведена однократная инъекция и рефлюкс отсутствовал через 6 мес после коррекции. Поскольку вещество имеет животное происхождение, возможно развитие иммунной реакции на его введение (Haferkamp A. Pitfalls of reped subureteral boving collagen injection for the endoscopic treatment of vesicoureteral reflux // J. Urology. - 2000. - 163(6). - p.1919).

За прототип предлагаемого изобретения выбран известный способ лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей путем эндоскопического введения культуры ауто- или аллофибробластов под устье мочеточника (РФ, патент №2002129065, публ. 2004.04.27).

Известный способ осуществляют следующим образом.

Клеточные культуры получают традиционным способом. Для трансплантации используют культуры 4-10 пассажей, стерильные, неконтаминированные микоплазмами и вирусами. Стерильность контролируется ежедневно микроскопически, контаминация контролируется с помощью полимеразной цепной реакции в лаборатории перед трансплантацией культуры. В день операции клетки снимают с поверхности культурального сосуда с помощью трипсинизации, дважды отмывают стерильным раствором хлористого натрия, концентрацию клеток доводят в объеме до 3,5-7 млн/мл, помещают в стерильную пробирку и в стерильном биксе доставляют в операционную. Эндоскопию проводят под внутривенным наркозом. С помощью специальной инъекционной иглы, проведенной через рабочий канал цитоскопа, ауто- и аллофибробласты человека в количестве 3,5-7 млн клеток, содержащихся в 1,5-2,0 мл физиологического раствора, вводят под слизистую оболочку мочеточника, отступя 4-5 мл ниже его отверстия, в бессосудистой зоне, на 5-6-7 эндоскопических часах, до полного смыкания устья на вершине образовавшегося подслизистого бугорка. Дренирование мочевого пузыря уретральным катетером Фолея в течение 24 часов. УЗИ почек и мочевого пузыря проводят на 1-2-е сутки после манипуляции. Выписка больных на 2-3 и сутки. Контрольная цистография через 3 месяца.

Применение в известном способе ауто- или аллофибробластов при лечении пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей обеспечивает длительную защиту пузырно-мочеточникового соустья. Использование человеческих клеток, тем более собственных, позволяет значительно снизить число иммунных реакций. Немаловажную роль играет и экономический эффект - получение фибробластов намного дешевле, чем использование других материалов.

Однако несмотря на хорошие отдаленные результаты лечения применение в качестве фиксирующего вещества культуры аллофибробластов имеет некоторые недостатки: невозможно визуализировать болюс («валик») в ближайшие сроки после введения препарата, что может косвенно говорить о сохранности ПМР до выработки фибробластами коллагена в количестве, достаточном для достижения антирефлюксного эффекта. Физические свойства препарата (взвесь клеток в физиологическом растворе) повышают риск элиминации его из места введения с током мочи и межтканевой жидкостью.

Задачей предлагаемого изобретения является повышение эффективности лечения путем обеспечения пролонгированного действия фиксирующего вещества и обеспечения условий для создания более надежного антирефлюксного механизма в области устья мочеточника.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе лечения пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей путем эндоскопического введения культуры ауто- или аллофибробластов под устье мочеточника культуру ауто- или аллофибробластов вводят в количестве не менее 4.0 млн клеток в биологических веществах, обеспечивающих адгезию фибробластов, например коллагена, при этом вводят сначала 2.0 мл 7% коллагена, затем через ту же иглу культуру ауто- или аллофибробластов в объеме 2,0 мл физиологического раствора.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию «новизна», так как проведенные патентно-информационные исследования не выявили источников, порочащих новизну предлагаемого способа.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию «изобретательский уровень», так как проведенный поиск не выявил технических решений с существующими признаками предлагаемого способа.

Известно, что при эндоскопическом лечение ПМР используют аутологичные субстанции: хондроциты, мышечные клетки (Diamond D.A. Endoscopic correction of vesicoureteral reflux in children using autologic chondrocytes: preliminary results // J. Urol. - 1999. - 162(3 Pt 2). - p.1185). Diamond D.A., 2001 г., применил эндоскопическое трансуретеральное введение аутологичных хондроцитов в тригональную зону у 29 детей с ПМР 2-4 степени с хорошим эффектом.

Эффект от применения бычьего коллагена может быть непродолжителен. В норме фибробласты продуцируют компоненты экстрацеллюлярного матрикса, одним из которых является коллаген I типа и более 140 различных факторов роста. Естественные коллагеновые волокна более резистентны к разрушению протеазами, чем недавно используемый бычий коллаген, в котором телопептиды разрезаны. В эксперименте in vitro показано, что культивированные фибробласты сохраняют способность размножаться и продуцировать коллаген и не являются онкогенными in vivo для животных. У пациентов введение культивированных фибробластов внутрикожно не вызвало образования рубцов и фиброза (Келлер Г. Сохранность инъецируемых аутологичных человеческих фибробластов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2000. - т.130, №8. - с.203). Живой клеточный трансплантат будет длительно продуцировать необходимое количество коллагена.

Предлагаемый способ позволяет получить при использовании следующий положительный эффект.

Эндоскопическое субуретеральное введение культуры ауто- или аллофибробластов человека в коллагеновый болюс, то есть практически одновременное введение культуры фибробластов и коллагена является не простым механическим смешиванием данных фиксирующих веществ. Во-первых, обеспечивается максимальная сохранность клеток за счет того, что к коллагену у фибробластов имеется тропизм, вследствие чего до 90% клеток адгезируются на нем и не вымываются из места инъекции мочой и межтканевой жидкостью, что улучшает их приживление. Во-вторых, создание коллагенового валика обеспечивает моментальный антирефлюксный эффект, а ко времени его естественной элиминации фибробласты успевают выработать ауто-коллаген в необходимом для фиксации мочеточника количестве. В третьих, упрощается контроль за антирефлюксным механизмом устья мочеточника за счет улучшения визуализации валика при проведении УЗИ.

Таким образом, применение ауто- или аллофибробластов одновременно с коллагеном при лечении пузырно-мочеточникового рефлюкса у детей обеспечивает более надежную и длительную защиту пузырно-мочеточникового соустья, улучшаются как непосредственные, так и отдаленные результаты лечения, отпадает необходимость в повторных инъекциях фиксирующих веществ, что упрощает и удешевляет лечение данной категории больных, снижает риск иммунных и других побочных реакций и осложнений.

Следовательно, рефлюкс ликвидируется сразу же после проведения коррекции, улучшаются отдаленные результаты и снижается риск возникновения рецидива за счет пролонгированного действия фиксирующего вещества, упрощается контрольное обследование пациентов за счет улучшения визуализации антирефлюксного валика. Обладая минимальной инвазивностью, предлагаемый способ является простой и эффективной процедурой коррекции ПМР, как впервые выявленного, так и при рецидиве рефлюкса после неудачного оперативного лечения.

Таким образом, высокая эффективность предлагаемого метода делает целесообразным его внедрение в широкую клиническую практику.

Способ осуществляют следующим образом.

Ауто- и аллофибробласты человека получают в лаборатории консервации тканей научно-лабораторного отдела Нижегородского НИИ травматологии и ортопедии МЗ РФ. Источником фибробластов служит кожа, полученная после операции «circumcisio» у соматически здоровых пациентов. При культивировании использовали среду Игла с добавлением антибиотиков, 2% глутамина, 5% телячьей эмбриональной сыворотки. Культивирование проводили при 37°С в атмосфере 5% СО₂, на последнем этапе - на коллагенсодержащей пленке. Для трансплантации использовали 10-17 культуры пассажей хорошего качества, сформировавшие конфлюэнтный монослой, клетки четко очерченные с плотными ядрами, выраженными отростками, стерильные, неконтаминированные микоплазмами и вирусами. В день операции клетки снимают с поверхности. Стерильность контролировалась ежедневно микроскопически, контаминация контроливалась с помощью полимеразной цепной реакции в лаборатории Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии перед трансплантацией культуры через 1-3 дня после пассажа. За 1-2 часа до трансплантации культуры дважды отмывали от культуральной среды стерильным теплым физиологическим раствором, после чего суспензию клеток передавали в операционную в стерильной пробирке. Концентрация клеток составляла 4 млн в мл. Рост клеток контролировался с помощью инвертированного микроскопа Leica type 090-135.001 фирмы Leica Microsystems Wetzlar GmbH с видеокамерой и компьютерной программой слежения за ростом культуры.

Для выполнения операции используют цистоскопы фирмы «Karl Storz» соответствующих возрастных диаметров. Эндоскопию проводят под внутривенным наркозом калипсолом. С помощью специальной инъекционной иглы, проведенной через рабочий канал цистоскопа, коллаген производства фирмы «МИТ» в количестве 2.0 мл вводят под слизистую оболочку мочеточника, отступя 4-5 миллиметров ниже его отверстия, в бессосудистой зоне, на 5-6-7 эндоскопических часах, до полного смыкания устья на вершине образовавшегося подслизистого бугорка. Затем в образовавшийся болюс вводят ауто- или аллофибробласты человека в количестве 4.0 млн клеток, содержащихся в 1,5-2,0 мл физиологического раствора. Дренирование мочевого пузыря уретральным катетером Фолея в течение 24 часов. УЗИ почек и мочевого пузыря проводят на 1-2-е сутки после манипуляции. Выписывают больных на 2-3-и сутки. УЗИ почек и мочевого пузыря проводят через 1 и 3 месяца после операции. Контрольную цистографию выполняют через 3 месяца.

Примеры конкретного выполнения даны в виде выписок из истории:

1. Люба П., 9 лет, история болезни №4579, поступила в хирургическое отделение ГУ НОДКБ 03.04.06. Наблюдается урологом с сентября 2004 года по поводу пузырно-мочеточникового рефлюкса 2 степени с обеих сторон. 02.09.04 выполнена операция Коэна справа, введение коллагена под устье правого мочеточника интраоперационно. При обследовании в марте 2005 года на цистограммах ПМР не было с 2 сторон, однако при обследовании апреле 2006 отмечается рецидив ПМР 2 степени справа. После проведения клинико-лабораторного обследования, УЗИ почек, цистографии 14.04.06 выполнена эндоскопическая фиксация устья правого мочеточника по описанной выше методике путем введения 4 млн клеток аллофибробластов и коллагена фирмы «МИТ» в объеме 2 мл. При проведении УЗИ мочевого пузыря на 2 сутки после операции под правым устьем определяется антирефлюксный валик. Осложнений не наблюдалось, выписана домой в удовлетворительном состоянии 17.04.06. Контрольное УЗИ выполнено через 1 месяц, признаков ПМР нет, валик под правым устьем четко определяется. При УЗИ почек и мочевого пузыря через 3 месяца после операции признаков ПМР нет.

2. Валерия Е., 12 лет, история болезни №4532, поступила в хирургическое отделение ГУ НОДКБ 03.04.06. Наблюдается урологом с 1999 года, в апреле 1999 года выполнена операция Коэна слева по поводу обструктивного уретерогидронефроза. После операции не обследовалась. Проведено клинико-лабораторное обследование, УЗИ почек и мочевого пузыря, внутривенная урография, цистография. Выявлен пузырно-мочеточниковый рефлюкс 3 степени слева. 07.04.06 выполнена эндоскопическая фиксация устья левого мочеточника по описанной выше методике с использованием культуры аллофибробластов 4 млн клеток и 2.0 мл коллагена. При проведении УЗИ мочевого пузыря на 2 сутки после операции под левым устьем четко определяется антирефлюксный валик. Выписана на 3 сутки после эндоскопической коррекции, осложнений не наблюдалось. Контрольное УЗИ выполнено через 1 месяц: признаков ПМР нет, под левым устьем сохраняется антирефлюксный валик. При УЗИ почек и мочевого пузыря через 3 месяца после операции признаков ПМР нет.