способ получения поли-dl-лактид-со-гликолидных наночастиц с инкапсулированными в них противотуберкулезными лекарственными средствами

Формула изобретения

1. Способ получения композиции, содержащей поли-DL-лактид-со-гликолидные наночастицы с инкапсулированными в них противотуберкулезными лекарственными средствами, где способ включает следующие стадии:

стадия 1: получение лиофилизированных частиц стабильных лекарственных средств, включая

(i) получение водного раствора водорастворимых стабильных лекарственных средств;

(ii) получение раствора полимера и раствора гидрофобного лекарственного средства в органическом растворителе;

(iii) смешивание раствора со стадии (i) с раствором со стадии (ii) с последующей обработкой полученного раствора ультразвуком при 4-15°С с получением эмульсии;

(iv) добавление полученной эмульсии к водному раствору поливинилового спирта и повторная обработка ультразвуком при 4-15°С;

(v) перемешивание эмульсии и центрифугирование ее;

(vi) промывание указанных частиц, воспроизведение их эмульсии и лиофилизацию;

стадия 2: получение лиофилизированных частиц нестабильных лекарственных средств, включая

(i) получение водного раствора нестабильных лекарственных средств;

(ii) получение раствора полимера в органическом растворителе;

(iii) смешивание раствора со стадии (i) с раствором со стадии (ii) с последующей обработкой ультразвуком при 4-15°С с получением эмульсии;

(iv) добавление полученной эмульсии к водному раствору поливинилового спирта и повторная обработка ультразвуком при 4-15°С;

(v) перемешивание эмульсии и центрифугирование ее;

(vi) промывание указанных частиц, воспроизведение их эмульсии и лиофилизацию;

стадия 3: объединение лиофилизированных частиц, полученных на стадиях 1 и 2 с получением указанной композиции.

2. Способ по п.1, где указанную композицию суспендируют с получением суспензии лиофилизированных частиц.

3. Способ получения поли-DL-лактид-со-гликолидных наночастиц с инкапсулированным в них этамбутолом, где способ включает следующие стадии:

(i) получение водного раствора этамбутола;

(ii) получение раствора полимера органическом растворителе;

(iii) смешивание раствора со стадии (i) с раствором со стадии (ii) с последующей обработкой ультразвуком при 4-15°С с получением эмульсии;

(iv) добавление полученной эмульсии к водному раствору поливинилового спирта и повторная обработка ультразвуком при 4-15°С;

(v) перемешивание эмульсии и центрифугирование ее;

(vi) промывание указанных частиц, воспроизведение их эмульсии и лиофилизацию.

4. Способ по любому из пп.1 или 3, где указанный органический растворитель представляет собой дихлорметан.

5. Способ по любому из пп.1 или 3, причем указанный полимер растворен в указанном растворителе в соотношении 1:0,3-1 в/о.

6. Способ по любому из пп.1 или 3, причем указанное лекарственное средство растворяют в смеси дистиллированная вода/изотонический раствор/фосфатный буфер в соотношении 1:1-1000 в/о и в дихлорметане в соотношении 1:0,5-5 в/о.

7. Способ по любому из пп.1 или 3, причем указанные водный и органический растворы смешивают в соотношении 1:5-20 о/о.

8. Способ по любому из пп.1 или 3, причем соотношение указанного лекарственного средства и полимера составляет 1:1 в/в.

9. Способ по любому из пп.1 или 3, причем первую обработку ультразвуком проводят в течение 45-120 с, а вторую обработку ультразвуком - в течение 2-5 мин, каждую при 4-15°С.

10. Способ по любому из пп.1 или 3, причем указанный поливиниловый спирт имеет концентрацию 0,8-2,5% и соотношение дихлорметан : поливиниловый спирт составляет 1:0,5-1,5.

11. Способ по любому из пп.1 или 3, причем центрифугирование осуществляют при 8000-12000 об/мин в течение 15-30 мин при 4-20°С.

12. Способ по любому из пп.1 или 3, причем указанные частицы промывают 3-4 раза в смеси дистиллированная вода/изотонический раствор/ фосфатный буфер (рН 7,2-7,4) и лиофилизируют.

13. Композиция, полученная по п.1, для лечения туберкулеза.

14. Композиция по п.13, представленная в форме суспензии в изотоническом растворе.

Описание изобретения к патенту

Область изобретения

Данное изобретение относится к получению поли-DL-лактид-со-гликолидных наночастиц (ПЛГ-НЧ) с активным веществом или веществами (ПТЛС), инкапсулированными в них, где инкапсулированные вещества являются стабильными относительно друг друга. В частности, это изобретение относится к препарату, содержащему первые инкапсулированные активные вещества, которые стабильны, и вторые инкапсулированные активные вещества, которые нестабильны в отношении к указанному первому веществу. Упоминание активных веществ, как подразумевается, включает терапевтические и/или биологически активные вещества. Так, и в качестве примера, наночастицы можно использовать для инкапсулирования противотуберкулезных лекарственных средств (ПТЛС).

Предпосылки создания изобретения

Необходимость применять многие ПТЛС ежедневно в течение 6-9 месяцев приводит к несоблюдению схемы лечения пациентом, а также к связанной с приемом лекарств гепатотоксичности, что ведет к неудачам терапии. Другим следствием неполного/нерегулярного лечения является появление лекарственной резистентности.

В нанотехнологии на основе систем доставки лекарственных веществ с использованием биологически разлагаемых полимеров проводились интенсивные исследования в последнее десятилетие. Из нескольких доступных методик получения наночастиц, таких как двойное эмульгирование-выпаривание растворителя, диффузия раствора в масло, микроэмульгирование, осаждение газом, снижающим растворимость, гелификация анионных полисахаридов и т.д., ни одна не является совершенной в отношении размера частиц, эффективности инкапсулирования лекарственного вещества и кинетики высвобождения лекарственного вещества. Кроме того, об инкапсулировании многих лекарственных веществ в одном препарате еще не сообщалось.

Наиболее широко применяемый метод двойного эмульгирования-выпаривания растворителя включает 2 главные стадии - образование капелек в первичной эмульсии и последующее удаление растворителя из капелек вторичной эмульсии с последующим осаждением полимера. Стабильность частиц, а также кинетика высвобождения лекарственного вещества регулируется путем использования эмульгаторов/стабилизаторов, таких как поливиниловый спирт (ПВС).

В основном известно, что изониазид (INН), пиразинамид (РZА) и рифампицин (RIF) являются активными веществами или лекарственными веществами, применяемыми для лечения туберкулеза. Так, в патентной заявке № 765/Dеl/2003 предложен способ одновременного или совместного инкапсулирования двух или более из вышеназванных лекарственных веществ, но которые стабильны в отношении друг друга.

Помимо трех вышеназванных лекарственных веществ или активных веществ, известно также, что этамбутол (EMB) является лекарственным средством, которое также используется для лечения туберкулеза. Однако EMB является нестабильным в присутствии INН, РZА или RIF и, в частности, в присутствии INН. Таким образом, было обнаружено, что EMB нельзя было совместно инкапсулировать одновременно с INН, так как любое такое совместное инкапсулирование привело бы к разложению EMB. Так, патентная заявка № 765/Dеl/95 имела полезное применение для совместного инкапсулирования активных веществ или лекарственных веществ, которые были совместимы друг с другом в отношении стабильности. Инкапсулирование EMB до сих пор не было известно.

Объекты изобретения

Цель данного изобретения состоит в предложении композиции и способа получения ПЛГ-НЧ, включающих инкапсулированные активные вещества, которые нестабильны в отношении друг друга.

Другой объект этого изобретения состоит в предложении композиции и способа получения ПЛГ-НЧ с ПТЛС, инкапсулированными в них, и при которых устранены недостатки, связанные с известным уровнем техники, и причем ПТЛС состоят из комбинации или рифампицина (RIF)+изониазид (INH)+пиразинамид (PZA)+этамбутол (EMB), или рифампицин (RIF)+изониазид (INH).

Еще один объект этого изобретения состоит в предложении композиции и способа получения ПЛГ-НЧ с ПТЛС, инкапсулированными в них, которые обеспечивают продолжительное и постоянное высвобождение лекарственных средств.

Еще один объект этого изобретения состоит в предложении композиции и способа получения ПЛГ-НЧ с ПТЛС, инкапсулированными в них, которые можно изменять так, чтобы захватить максимум лекарственного вещества.

Дополнительный объект этого изобретения состоит в предложении композиции и способа получения ПЛГ-НЧ с ПТЛС, инкапсулированными в них, которые способны распределить лекарственное(ые) средство(а) равномерно по разным органам, где находятся туберкулезные бактерии.

Еще один дополнительный объект этого изобретения состоит в предложении композиции и способа получения ПЛГ-НЧ с ПТЛС, инкапсулированными в них, которые можно лиофилизировать и воспроизводить для использования в виде композиции для перорального приема.

Еще один дополнительный объект этого изобретения состоит в предложении композиции и способа получения ПЛГ-НЧ с ПТЛС, инкапсулированными в них, которые не проявляют гепатотоксичности.

Краткое описание изобретения

В соответствии с этим изобретением представлен способ получения поли-DL-лактид-со-гликолидных наночастиц с противотуберкулезными лекарственными средствами, инкапсулированными в них, включающий:

(I) получение водного раствора стабильных, растворимых в воде лекарственных веществ в DW/NS/PBS (DW-дистиллированная вода, NS-изотоничный раствор, PBS-фосфатный буферный раствор),

(II) получение раствора нестабильных лекарственных веществ в DW/NS/PBS,

(III) получение раствора полимера и гидрофобного лекарственного вещества в органическом растворителе,

(IV) смешивание отдельно растворов со стадий (I) и (II) с растворами со стадии (III) и обработка ультразвуком в условиях холода,

(V) добавление указанной выше эмульсии в водном растворе ПВС и повторную обработку ультразвуком в условиях холода,

(VI) перемешивание эмульсии и центрифугирование ее,

(VII) промывание указанных частиц, воспроизведение их эмульсии и лиофилизацию.

В соответствии с данным изобретением водный раствор гидрофильного лекарственного вещества получают в DW/NS/PBS в соотношении 1:0,1-100 по объемному весу. Раствор полимера получают в органическом растворителе, предпочтительно, дихлорметане (ДХМ), в отношении 1:0,3-1 по объемному весу, содержащем также гидрофобное лекарственное вещество в соотношении 1:0,5-5 по объемному весу. Водный раствор выливают в органический раствор в соотношении 1:5-20 по объему и обрабатывают ультразвуком в течение 45-120 сек при 4°-15°С. Первичную эмульсию выливают в 0,8-2,5% раствор ПВC, содержащий ДХМ:ПВС в соотношении 1:0,5-1,5, обрабатывают в течение 2-5 минут при 4°-15°С и перемешивают в течение 18-30 часов. Перемешиваемую смесь центрифугируют при 8000-12000 об/мин в течение 15-30 мин при 4°-20°С с получением капли осадка и промывают 3-4 раза DW/NS/PBS, снова суспендируют в том же растворе и лиофилизируют. Отношение лекарственного вещества и полимера сохраняют равным 1:1 вес/вес. Таким образом, получают три вида препаратов, т.е. ПЛГ-НЧ, инкапсулирующие RIF+INH+PZA, ПЛГ-НЧ, инкапсулирующие RIF+INH, и ПЛГ-НЧ, инкапсулирующие EMB.

Было обнаружено, что этамбутол в высокой степени нестабилен в присутствии изониазида. Таким образом, если необходимо инкапсулирование четырех активных веществ или необходимо инкапсулирование двух или более активных веществ, и из которых этамбутол является одним из активных веществ, было бы удобно соинкапсулировать этамбутол в сочетании с другими активными веществами, и применяя способ, который описан в одновременно находящейся на рассмотрении патентной заявке № 765/Del/2003. Однако недостаток, связанный с этим, состоит в том, что из-за его свойств нестабильности этамбутол неизбежно разрушается.

Таким образом, чтобы устранить этот недостаток, этамбутол инкапсулируют отдельно. Такое отдельное инкапсулирование этамбутола также улучшает биодоступность этамбутола при пероральном применении. Еще одним свойством является минимальная подавляющая концентрация (МПК). Было обнаружено, что МПК не достигается при инкапсулировании четырех активных веществ, причем этамбутол является одним из активных веществ. Однако отдельное инкапсулирование этамбутола обеспечивает необходимую МПК.

Способ получения ПЛГ-НЧ с инкапсулированными в них ПТЛС объясняется следующим примером.

Пример

10 мг INH и 10 мг PZA растворяли в 1 мл DW. 10 мг RIF и 30 мг ПЛГ суспендировали в 10 мл ДХМ. Водный раствор добавляли к ДХМ раствору, обрабатывали ультразвуком при 4°С в течение 1 мин и выливали в 1% раствор ПВС (8 мл) с последующей обработкой ультразвуком при 4°С в течение 3 мин. Эмульсию перемешивали в течение 18 часов и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 мин. Осадок после центрифугирования промывали 3 раза DW и затем снова суспендировали в том же растворе для лиофилизации.

10 мг EMB растворяли в 1 мл DW. 10 мг ПЛГ суспендировали в 10 мл ДХМ. Добавляли водный раствор к ДХМ раствору, обрабатывали ультразвуком при 4°С в течение 1 мин и выливали в 1% раствор ПВС (8 мл) с последующей обработкой ультразвуком при 4°С в течение 3 мин. Эмульсию перемешивали в течение 18 часов и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 мин. Осадок после центрифугирования промывали 3 раза DW и затем снова суспендировали в том же растворе для лиофилизации.

Лиофилизированные частицы снова суспендировали в изотоничном растворе и вводили перорально мышам, и результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 Колониеобразующие единицы (КОЕ) M. Tuberculosis в органах мышей после лекарственной терапии
Группы	Доза	Режим	Число введений дозы	Log КОЕ/орган Легкие Селезенка
1. Не получавшие лечения, контрольные	-	-	-	4,97 ±0,07	4,91 ±0,09
2(a) Свободная комбинация из 3-х лекарств	Терапевтическая	Ежедневно	28	2,88 ±0,09	2,85 ±0,06
(b) ПЛГ комбинация из 3-х лекарств	Терапевтическая	Каждые 10 дней	3	2,75 ±0,06	2,75 ±0,10
(c) ПЛГ комбинация из 3-х лекарств	1/2 терапевтической	Каждые 7 дней	4	2,72 ±0,05	2,78 ±0,04
3(a) Свободная комбинация из 4-х лекарств	Терапевтическая	Ежедневно	28	<1,00*	<1,00*
(b) ПЛГ комбинация из 4-х лекарств	Терапевтическая	Каждые 10 дней	3	<1,00*	<1,00*
4(a) Свободная комбинация из 4-х лекарств	1/2 терапевтической	Ежедневно	28	2,67 ±0,14	2,72 ±0,07
(b) ПЛГ комбинация из 4-х лекарств	1/2 терапевтической	Каждые 7 дней	4	<1,00*	<1,00*
Значения являются средними арифметическими ± СО, n=5 на группу Значения log КОЕ (колониеобразующая единица) являются сравнимыми (Р>0,05) между группами 2 а/b/с и 4(а), которые были, однако, значительно ниже (Р<0,001), чем в группе 1. *Указывает неопределяемое число КОЕ на 28 день после заражения и в 1 и 10 раз разведенными гомогенатами тканей.

При единственном пероральном введении ПЛГ наночастиц мышам минимальная подавляющая концентрация (МПК для этамбутола = 1,5 мкг/мл) достигалась в плазме только тогда, когда EMB был инкапсулированным и его вводили отдельно. Это важно с точки зрения лечения ТБ, так как, если уровни лекарственного вещества ниже МПК, лечение становится неэффективным. Фактически, когда ПЛГ-НЧ, соинкапсулирующие EMB вместе с 3 другими лекарственными веществами, вводили мышам, уровни EMB в крови были ниже МПК во время периода исследования.

Кроме того, при сравнении со свободным EMB, биодоступность которого считали равной =1, биодоступность инкапсулированного в ПЛГ-НЧ EMB (одного) была =10,6, тогда как биодоступность инкапсулированного в ПЛГ-НЧ EMB (вместе с другими 3 лекарственными веществами) была =5,1.

Определение содержания лекарственного вещества в ПЛГ-НЧ

Эффективность инкапсулирования лекарственного вещества для ПЛГ-НЧ была, как представлено ниже:

RIF - 56,99 ±2,72%

INH - 66,31 ±5,83%

PZA - 68,02 ±5,58%

EMB - 43,11 ±4,21%

ПЛГ-НЧ не были связаны с какой-либо гепатотоксичностью при оценке по билирубину, аланинтрансаминазе и щелочной фосфатазе плазмы крови.