синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления субгенотипов 1а и 1b вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота и способ их применения

Формула изобретения

1. Синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления субгенотипов 1а и 1b вируса вирусной диареи болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, отличающийся тем, что праймеры имеют нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO:1 5'-tcgacgccttaacatgaaggt-3', SEQ ID NO:2 5'-tcgacgctttggaggacaagc-3', SEQ ID NO:3 5'-ccatgtgccatgtacag-3'.

2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления субгенотипов 1а и 1b вируса вирусной диареи болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающий проведение ПЦР, отличающийся тем, что проводят отдельные реакции с парами праймеров SEQ ID NO:1 5'-tcgacgccttaacatgaaggt-3' и SEQ ID NO:3 5'-ccatgtgccatgtacag-3' на субгенотип 1a, SEQ ID NO:2 5'-tcgacgctttggaggacaagc-3' и SEQ ID NO:3 5'-ccatgtgccatgtacag-3' на субгенотип 1b и в случае выявления фрагмента ДНК размером 186 н.п. в каждой реакции делают заключение о наличии в исследуемом материале вируса вирусной диареи болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота субгенотипов 1а и 1b соответственно.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и может быть использовано в ветеринарной вирусологии для генотипирования штаммов и изолятов вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота (ВД-БС КРС).

До настоящего времени основным способом генотипирования штаммов и изолятов вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота является способ, основанный на накоплении вирусов в культуре клеток, выделении РНК, проведении обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции, очистку продуктов ПЦР, сиквенсе ампликонов и сравнении с известными последовательностями генома референтных штаммов (Шульпин М.И., Аянот П.К., Мищенко В.А. Индикация вируса вирусной диареи крупного рогатого скота, генотипирование и филогенитический анализ изолятов, выявленных на территории Российской Федерации. Вопросы вирусологии. - 2003. - № 6. - С.41-46.).

К недостаткам данного способа можно отнести необходимость получение большого количества высокоочищенных ампликонов, длительность и высокую стоимость.

Наиболее близким решением данного изобретения являются праймеры и способ генотипирования вируса ВД-БС КРС, включающий синтез олигонуклеотидных праймеров на ген NS5B и проведение гнездовой ПЦР (Gilbert A., Burton K.M., Prins S.E., Deregt D. Typing of Bovine Viral Diarrhea Viruses Directly from Blood of Persistently Infected Cattle by Multiplex PCR. Journal of clinical microbiology.- Vol.37, No.6. - p.2020-2023).

Наружные праймеры для первого раунда амплификации:

5'-aagatccacccttatga(a/g)gc-3'

5'-aagaagccatcatc(a/c)ccaca-3'.

Множественные внутренние праймеры для второго раунда ПЦР:

5'-tggagatctttcacacaatagc-3',

5'-gggaacctaagaactaaatc-3',

5'-gctgtttcacccagtt(a/g)tacat-3'

К недостаткам данного способа можно отнести то, что он не позволяет разделять штаммы и изоляты вируса первого генотипа на субгенотипы (1а и 1b).

Задачей изобретения является разработка синтетических олигонуклеотидных праймеров и способа выявления субгенотипов 1а и 1b вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота при помощи синтетических олигонуклеотидных праймеров.

Поставленная задача решается тем, что подобраны и синтезированы синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления субгенотипов 1а и 1b вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, согласно изобретения праймеры имеют нуклеотидные последовательности: SEQ ID NO:1 5'-tcgacgccttaacatgaaggt-3', SEQ ID NO:2 5'-tcgacgctttggaggacaagc-3', SEQ ID NO:3 5'-ccatgtgccatgtacag-3'.

Задача решается также тем, что в способе применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления субгенотипов 1а и 1b вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота, включающий проведение ПЦР, отличающийся тем, что проводятся отдельные реакции с парами праймеров SEQ ID NO:1 5'-tcgacgccttaacatgaaggt-3' и SEQ ID NO:3 5'-ccatgtgccatgtacag-3' на субгенотип 1a, SEQ ID NO:2 5'-tcgacgctttggaggacaagc-3' и SEQ ID NO:3 5'-ccatgtgccatgtacag-3' на субгенотип 1b и случае выявления фрагмента ДНК размером 186 н.п. в каждой реакции делают заключение о наличии в исследуемом материале вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота субгенотипов 1а и 1b соответственно.

Техническим результатом изобретения является возможность быстро проводить дифференциацию штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС первого генотипа на субгенотипы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Способ подбора и получения синтетических олигонуклеотидных праймеров.

Поиск новых специфических праймеров осуществляют на основе полных геномов штаммов вируса ВД-БС КРС 1 генотипа, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankSearch.html). Все последовательности выравнивают методом Blast, отбирают участки генома, показывающие не менее 80% гомологии с последовательностями 5'-нетранслируемого региона референтных штаммов ВД-БС КРС Oregon C24V (субгенотип 1а) и ILLC (субгенотип 1b). При помощи пакета программного обеспечения "Lasergen" проводят поиск праймеров для отобранных участков генома. Полученные последовательности нескольких пар праймеров дополнительно тестируют на специфичность с помощью моделирования ПЦР в программе "Vector NTI Suite" с последовательностями геномов всех исследованных штаммов вируса ВД-БС КРС 1 генотипа, вирусов классической чумы свиней, пограничной болезни овец и вируса ВД-БС КРС 2 генотипа. Наличие или отсутствие гомологии с указанными возбудителями являются основанием для отбора праймеров. Окончательный выбор праймеров основывают на следующих критериях: высокий индекс сходства фрагмента и РНК различных штаммов вируса, высокая температура отжига (GC-метод), большая длина консенсусов. Химический синтез праймеров осуществляют амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U. Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяют спектрофотометрическим методом.

Для подтверждения синтеза праймеров заданной последовательности проводят анализ методом электрофореза в полиакриламидном геле путем сравнения с маркером молекулярного веса pBR322/BsuRI.

Фиг.1. Сравнение нуклеотидных последовательностей 5'-нетранслируемого региона штаммов вируса ВД-БС КРС 1 генотипа. Полужирным курсивом показаны нуклеотидные участки для специфического связывания с праймерами.

Таким образом, указанный способ позволяет получать синтетические олигонуклеотидные праймеры, комплементарные высококонсервативной 5'-нетранслируемой области генома вируса ВД-БС КРС, специфичные для субгенотипов.

Пример 2. Способ применения синтетических олигонуклеотидных праймеров для выявления субгенотипов 1а и 1b вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота.

Способ осуществляется в несколько этапов.

Этап 1. Выделение РНК вируса ВД-БС КРС.

Для выделения РНК берут суспензии штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС 1-го генотипа, выделенных в культуре клеток, а также суспензии биоматериала от животных, в которых при помощи ПЦР выявлена РНК вируса 1-го генотипа.

100 мкл осветленной суспензии вируса или биоматериала переносят в пробирку с 450 мкл лизирующего раствора, тщательно перемешивают и добавляют 25 мкл ресуспендированного сорбента, перемешивают и оставляют в штативе на 1 минуту, еще раз перемешивают, оставляют на 5 минут, а затем центрифугируют 30 сек при 10 тыс. об./мин. Удаляют супернатант, добавляют 400 мкл раствора для отмывки 1, перемешивают и центрифугируют 30 сек при 10 тыс. об./мин. Удаляют супернатант, добавляют 500 мкл раствора для отмывки 3 и повторяют процедуру. Добавляют в пробирки 400 мкл раствора для отмывки 4, тщательно ресуспендируют, центрифугируют 30 сек при 10 тыс. об./мин. Удаляют супернатант. Помещают открытые пробирки в термостат 60°С на 5-10 минут для подсушивания сорбента. Затем добавляют 40 мкл РНК-элюата, перемешивают, выдерживают 2-3 минуты при 60°С, центрифугируют.

Этап 2. Проведение реакции обратной транскрипции для получения кДНК.

В пробирку, содержащую 10 мкл реакционной смеси: буфер для ОТ (50 mM Tris-HCl [рН 8.3], 3 мМ MgCl2, 75 mМ KCl, 10 мМ DTT), 0,1 мМ dNTP, 0,1 мкг праймера для ОТ, 80 е.а. M-MulV обратная транскриптаза, добавляют 10 мкл РНК-пробы, осторожно перемешивают и помещают в термостат 37°С на 30 минут. Затем добавляют 20 мкл ТЕ-буфера, тщательно перемешивают и используют для постановки ПЦР.

Этап 3. Амплификация участка к-ДНК вируса ВД-БС КРС.

Полимеразная цепная реакция. Для каждой пары праймеров готовят отдельную ПЦР-смесь. Состав реакционной смеси: ПЦР-буфер (60 mM Tris-HCl [рН 8.5], 1,5 мМ MgC12, 25 mM КС1, 10 мМ 2-меркаптэтанола, 0,1% Тритон Х-100), 0,2 мМ dNTP, по 0,1 мкг каждого праймера, 1.25 е.а. Taq-ДНК-полимераза, 5 мкл продукта обратной транскрипции.

Температурный режим проведения ПЦР: Программа амплификации состоит из следующих температурных режимов: 95°С - 5 мин - 1 цикл; 95°С - 45 сек, 55°С - 45 сек, 72°С - 1 мин - 35 циклов; 72°С - 5 мин.

Этап 4. Определение размера продуктов ПЦР.

Продукты ПЦР анализируют методом электрофореза в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере (рН 8,0).

10 мкл продукта ПЦР смешивают с 2 мкл буфера для нанесения образца (0.25% бромфеноловый синий, 40% сахароза) и вносят в лунку агарозного геля. Электрофорез проводят при напряжении 10 в/см длины геля до тех пор, пока краситель не пройдет от старта не менее половины геля (примерно 30 минут). Результаты электрофореза учитывают, просматривая гель в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм на приборе «Трансиллюминатор».

Маркер молекулярного веса 100bp.

Результат ПЦР считают положительным, если продукт ПЦР соответствует размеру фрагмента в 186 нуклеотидные пары.

Фиг.2 Электрофореграмма амплифицированного фрагмента генома 2 штаммов вируса ВД-БС КРС «Oregon С 24 V» и «ВК-1» (Дорожки 1 и 2 ПЦР с парой праймеров на субгенотип 1а, дорожки 3 и 4 - ПЦР с парой праймеров на субгенотип 1b, дорожка 5 - маркер молекулярного веса).

Пример 3. Определение специфичности ПЦР.

Результаты опытов по определению специфичности реакции с двумя парами праймеров представлены в таблице 1.

Таблица 1
Вирус (штамм)	Результаты ПЦР
Праймеры на субгенотип 1а	Праймеры на субгенотип 1b
Вирус ВД-БС КРС 1 генотипа (NADL)	+	-
Вирус ВД-БС КРС 1 генотипа (Oregon C24V)	+	-
Вирус ВД-БС КРС 1 генотипа (ТМ-340)	+	-
Вирус ВД-БС КРС 1 генотипа (ВК-1)	-	+
Вирус ВД-БС КРС 2 генотипа (Изолят БЛ)	-	-
Вирус чумы свиней	-	-
Аденовирус КРС 1 типа (BV-10)	-	-
Риновирус КРС 1-го типа (SD-1)	-	-
Культура клеток КСТ	-	-
Примечание: «+» - положительный результат; «-» - отрицательный результат.

Таким образом, предлагаемые синтетические олигонуклеотидные праймеры и способ их применения обладают высокой специфичностью при выявлении РНК штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС.

Пример 4. Результаты тестирования штаммов и изолятов вируса ВД-БС КРС, относящихся к первому генотипу.

Результаты тестирования изолятов вируса вирусной диареи - болезни слизистых крупного рогатого скота 1-го генотипа представлены в таблице 2.

Таблица 2
№ п/п	Наименование изолята	Клиническая форма заболевания, источник выделения	Субгенотип
1	Бизон	Респираторная, теленок/селезенка	1а
2	Бонго	Респираторная, антилопа Бонго/селезенка	1b
3	1140	Респираторная, жираф/селезенка	1b
4	T-l	Бык-производитель/сперма	1а
5	И	Генитальная/влагалищные выделения	1а
6	И4	Генитальная/влагалищные выделения	1b
7	СВ-4	Бык-производитель/сперма	1а
8	Т-2	Бык-производитель/сперма	1а
9	РА	Респираторная, теленок/легкие	1b
10	Крем	Абортплод/селезенка	1а
11	Ирм 01/06	Респираторная, теленок/легкие	1а
12	Бор	ПИ корова/сыворотка крови	1b

Таким образом, разработанные праймеры и способ их применения позволяют эффективно проводить субгенотипирование штаммов и изолятов вируса вирусной диареи - болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота 1-го генотипа, что можно использовать при изучении молекулярной эпизоотологии болезни и при планировании противоэпизоотических мероприятий.