вирусы prrs, их инфекционные клоны, мутантные формы и способы применения

Изобретение относится к области биотехнологии и вирусологии. Разработаны инфекционные клоны, имеющие нуклеотидную последовательность, идентичную вирусам PRRS, таким как VR-2332, Lelystad или другие, и дополнительно необязательно включающие делецию в области ORF1, которая кодирует полипептид nsp2. Изобретение может быть использовано в ветеринарии. 4 н. и 30 з.п. ф-лы, 12 ил., 6 табл.

Формула изобретения

1. Выделенный инфекционный полинуклеотид для вызова гуморального и/или клеточного иммунного ответа у животного к последующему воздействию вируса PRRS, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 88% идентичность с SEQ ID NO:1 и делецию по меньшей мере 57 последовательно расположенных нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам от нуклеотида 2062 до нуклеотида 3864 SEQ ID NO:1.

2. Полинуклеотид по п.1, где полинуклеотид реплицируется и продуцирует инфекционные вирусные частицы при введении в клетку.

3. Полинуклеотид по п.1, дополнительно содержащий последовательность вектора, которая реплицируется в прокариотической клетке-хозяине.

4. Выделенный полинуклеотид по п.1 или 2, где полинуклеотид находится в векторе.

5. Выделенный полинуклеотид по п.1 или 2, где полинуклеотид содержит 2 или более делеций, и где каждая делеция независимо представляет собой по меньшей мере 57 последовательно расположенных нуклеотидов.

6. Полинуклеотид по п.3, где полинуклеотид содержит 2 или более делеций, и где каждая делеция независимо представляет собой по меньшей мере 57 последовательно расположенных нуклеотидов.

7. Выделенный полинуклеотид по п.1 или 2, где полинуклеотид находится в выделенной вирусной частице.

8. Выделенный полинуклеотид по п.1 или 2, где полинуклеотид представляет собой полинуклеотид РНК.

9. Выделенный полинуклеотид по п.1 или 2, где полинуклеотид находится в клетке.

10. Полинуклеотид по п.3, где полинуклеотид находится в клетке.

11. Выделенный полинуклеотид по п.1 или 2, где с полинуклеотидом функционально связан промотор РНК-полимеразы.

12. Полинуклеотид по п.3, где с полинуклеотидом функционально связан промотор РНК-полимеразы.

13. Выделенный полинуклеотид по п.1 или 2, где полинуклеотид дополнительно содержит экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции.

14. Выделенный полинуклеотид по п.13, где экзогенный полинуклеотид кодирует детектируемый маркер.

15. Полинуклеотид по п.3, где полинуклеотид дополнительно содержит экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции.

16. Полинуклеотид по п.15, где экзогенный полинуклеотид кодирует детектируемый маркер.

17. Выделенный инфекционный полинуклеотид для вызова гуморального и/или клеточного иммунного ответа у животного к последующему воздействию вируса PRRS, содержащий нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 88% идентичность с SEQ ID NO:14 и делецию по меньшей мере 57 последовательно расположенных нуклеотидов, соответствующих нуклеотидам от нуклеотида 2061 до нуклеотида 3545 SEQ ID NO:14.

18. Полинуклеотид по п.17, где полинуклеотид реплицируется и продуцирует инфекционные вирусные частицы при введении в клетку.

19. Полинуклеотид по п.17, дополнительно содержащий последовательность вектора, которая реплицируется в прокариотической клетке-хозяине.

20. Выделенный полинуклеотид по п.17 или 18, где полинуклеотид находится в векторе.

21. Выделенный полинуклеотид по п.17 или 18, где полинуклеотид содержит 2 или более делеций, и где каждая делеция независимо представляет собой по меньшей мере 57 последовательно расположенных нуклеотидов.

22. Полинуклеотид по п.19, где полинуклеотид содержит 2 или более делеций, и где каждая делеция независимо представляет собой по меньшей мере 57 последовательно расположенных нуклеотидов.

23. Выделенный полинуклеотид по п.17 или 18, где полинуклеотид находится в выделенной вирусной частице.

24. Выделенный полинуклеотид по п.17 или 18, где полинуклеотид представляет собой полинуклеотид РНК.

25. Выделенный полинуклеотид по п.17 или 18, где полинуклеотид находится в клетке.

26. Полинуклеотид по п.19, где полинуклеотид находится в клетке.

27. Выделенный полинуклеотид по п.17 или 18, где с полинуклеотидом функционально связан промотор РНК-полимеразы.

28. Полинуклеотид по п.19, где с полинуклеотидом функционально связан промотор РНК-полимеразы.

29. Выделенный полинуклеотид по п.17 или 18, где полинуклеотид дополнительно содержит экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеций.

30. Выделенный полинуклеотид по п.29, где экзогенный полинуклеотид кодирует детектируемый маркер.

31. Полинуклеотид по п.19, где полинуклеотид дополнительно содержит экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеций.

32. Полинуклеотид по п.31, где экзогенный полинуклеотид кодирует детектируемый маркер.

33. Выделенный инфекционный полинуклеотид для вызова гуморального и/или клеточного иммунного ответа у животного к последующему воздействию вируса PRRS, содержащий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13.

34. Полипептид nsp2 для вызова гуморального и/или клеточного иммунного ответа у животного к последующему воздействию вируса PRRS, кодируемый инфекционным полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13.

Описание изобретения к патенту

ДАННЫЕ О ПРОДОЛЖАЮЩЕЙСЯ ЗАЯВКЕ

По данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке США с серийным № 60/694021, поданной 24 июня 2005 года, которая включена в настоящее описание в качестве ссылки.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вирус репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) является этиологическим фактором заболевания, характеризующегося респираторными нарушениями у молодых свиней и неспособностью к размножению у самок свиней (Benfield et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4:127-133 (1992); Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest.,4:117-126 (1992); Wensvoort et al., Vet. Q., 13:121-130 (1991)) и в настоящее время он является эндемичным в большинстве стран. Синдром впервые был выявлен как "загадочная болезнь свиней" в США в 1987 году и Европе он был выявлен в 1990 году. Два прототипных вирусных штамма (Lelystad и VR-2332) отличаются по нуклеотидной последовательности приблизительно на 40% и представляют собой два различных генотипа, обозначаемых как европейский (EU или 1 типа, Lelystad; Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993)) и североамериканский (NA или 2 типа, VR-2332; Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)) штаммы (Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004); Mardassi et al., J. Gen. Virol., 75:681-5 (1994); Meng et al., Arch. Virol., 140:745-55 (1995); Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Заболевание также было названо синдромом Уобаш, загадочной болезнью свиней, репродуктивным и респираторным синдромом свиней, геморрагической септицемией свиней, эпидемическим вызывающим аборт и респираторным синдромом свиней, болезнью голубого аборта, болезнью синего уха, abortus blau и seuchenhafter spatabort der schweine. Заболевание характеризуется репродуктивной недостаточностью у беременных самок свиней и респираторными проблемами у свиней всех возрастов. Заболевание оказывает значительное отрицательное влияние на промышленное свиноводство.

PRRSV представляет собой оболочечный вирус с положительной смысловой РНК, принадлежащий семейству Arteriviridae к отряду Nidovirales (Cavanagh, Arch. Virol., 142:629:633 (1997)). Длина генома PRRSV варьирует между 15,1-15,5 т.п.н. (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)). Первые 75% генома кодируют репликазный полибелок, необходимый для репликации вируса, и содержат две большие открытые рамки считывания (ORF) (1a и 1b), которые котрансляционно преобразуются в белки меньших размеров посредством кодируемых вирусом протеаз (Snijder et al., J Gen. Virol., 79:961-79 (1998)). Структурные белки кодируются семью расположенными ниже ORF и они транслируются с 3'-котерминального вложенного множества субгеномных мРНК (sgmRNA) (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)). В штамме VR-2332 кодирующая область генома (15411 оснований) фланкирована 5' и 3'-нетранслируемыми областями из 189 и 151 нуклеотидов, соответственно.

Штамм PRRSV VR-2332 охарактеризован по его полной геномной последовательности (Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)), по способности PRRSV конститутивно продуцировать дефектные виды субгеномной РНК, называемые гетероклитами (латин.: редко встречающиеся формы) (Yuan et al., Virology, 275:158-169 (2000)); Yuan et al., Virus Research, 105:75-87 (2004)), и по его ростовым характеристикам in vitro, а также in vivo (Murtaugh et al., Vet. Immunol. Immunopathol., 102:105-349 (2004)). Кроме того, инфекционный клон этого PRRSV с геномом РНК 15,4 т.п.н. был получен и исследован на его способность вызывать заболевание у свиней (pVR-HN; Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)).

PRRSV продолжает приводить к значительным экономическим потерям во всем мире. Существуют вакцины, но в их основе лежит один штамм PRRSV, и показано, что штаммы PRRSV варьируют на антигенном и генетическом уровнях. Кроме того, с того времени как вирус был идентифицирован в Европе и в США, продолжают появляться новые фенотипы заболевания.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предшествующие данные позволили предположить, что делеции и/или мутации любого штамма вируса PRRS часто оказывают значительное отрицательное воздействие на рост вируса. Конкретно, в отдельных лабораториях были внесены мутации в 3'-конец вируса, и полученный вирус оказывался либо нестабильным, и происходила быстрая реверсия в последовательность дикого типа, либо его рост происходил очень медленно или отсутствовал вообще (Lee et al., Virol., 331:47-62 (2005); Choi et al., J. Virol., 80:723-736 (2006); Lee et al., Virolog., 346:238-250 (2005)). Таким образом, при сравнении нуклеотидных последовательностей европейского (генотип 1 типа) и VR-2332 (генотип 2 типа) была неизвестна область внесения мутаций в NSP2 VR-2332, которые не оказывали значительного отрицательного воздействия. Однако выравнивание полных геномных последовательностей новых вирусов PRRS 2 типа с VR-2332 привело к появлению представлений о том, в какой области можно получить жизнеспособные мутантные формы. Дальнейший делеционный мутагенез показал, что область между аминокислотами nsp2 324-813 не является необходимой для роста in vitro.

Настоящее изобретение относится к выделенному инфекционному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную SEQ ID NO:1, и делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранную из нуклеотидов от нуклеотида 2062 до нуклеотида 3864 SEQ ID NO:1. Также предусмотрен выделенный инфекционный полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную SEQ ID NO:14, и делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов от нуклеотида 2061 до нуклеотида 3545 SEQ ID NO:14. Выделенный полинуклеотид может находиться в векторе, в выделенной вирусной частице, находящейся в клетке, или в их сочетании. Когда полинуклеотид находится в векторе, с ним может быть функционально связан промотор РНК-полимеразы. Выделенный полинуклеотид может представлять собой РНК. Выделенный полинуклеотид может включать 2 или более делеций, и каждая делеция может независимо представлять собой по меньшей мере 37 последовательно расположенных нуклеотидов. Выделенный полинуклеотид дополнительно может включать экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции, и экзогенный полинуклеотид может кодировать полипептид, такой как детектируемый маркер.

Настоящее изобретение также относится к выделенному полинуклеотиду, имеющему нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную SEQ ID NO:1, и по меньшей мере одну делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранную из нуклеотидов от нуклеотида 2062 до нуклеотида 3864 SEQ ID NO:1, и где полинуклеотид реплицируется и продуцирует инфекционные вирусные частицы при введении в клетку. Также предусмотрен выделенный полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 88% идентичную SEQ ID NO:14, и по меньшей мере одну делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранную из нуклеотидов от нуклеотида 2061 до нуклеотида 3545 SEQ ID NO:14, где полинуклеотид при введении в клетку реплицируется и продуцирует инфекционные вирусные частицы. Выделенный полинуклеотид может находиться в векторе, в выделенной вирусной частице, находящейся в клетке, или в их сочетании. Когда полинуклеотид находится в векторе, с ним может быть функционально связан промотор РНК-полимеразы. Выделенный полинуклеотид может представлять собой РНК. Выделенный полинуклеотид может включать 2 или более делеций, и каждая делеция может независимо представлять собой по меньшей мере 37 последовательно расположенных нуклеотидов. Выделенный полинуклеотид дополнительно может включать экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции, и экзогенный полинуклеотид может кодировать полипептид, такой как детектируемый маркер.

Настоящее изобретение дополнительно относится к инфекционному клону, имеющему полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, обладающей по меньшей мере 88% идентичностью с SEQ ID NO:1, и по меньшей мере одной делецией по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов от нуклеотида 2062 до нуклеотида 3864 SEQ ID NO:1. Также предусмотрен инфекционный клон, имеющий полинуклеотид с нуклеотидной последовательностью, имеющей по меньшей мере 88% идентичность с SEQ ID NO:14, и по меньшей мере одну делецию по меньшей мере 39 последовательно расположенных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов от нуклеотида 2061 до нуклеотид 3545 SEQ ID NO:14. Инфекционный клон может находиться в клетке. С полинуклеотидом может быть функционально связан промотор РНК-полимеразы. Инфекционный клон может включать 2 или более делеций, где каждая делеция независимо представляет собой по меньшей мере 37 последовательно расположенных нуклеотидов. Выделенный полинуклеотид дополнительно может включать экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции, и экзогенный полинуклеотид может кодировать полипептид, такой как детектируемый маркер.

Также настоящее изобретение относится к выделенному инфекционному полинуклеотиду, содержащему нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13, и к полипептиду nsp2, кодируемому инфекционным полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12 или SEQ ID NO:13.

Термины "содержат" и его варианты, когда эти термины представлены в описании и формуле изобретения, не имеют ограничивающего значения. Если нет иных указаний, форму единственного числа и термин "по меньшей мере один" используют взаимозаменяемо и они означают один или более одного.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. A. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:1) инфекционного полинуклеотида VR-V7 (также обозначаемого в настоящем описании как V6G7475A). B. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:2) инфекционного полинуклеотида VR-V5. C. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:3) инфекционного полинуклеотида VR-V5G7475A. D. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:4) инфекционного полинуклеотида VR-V6. E. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:5) инфекционного полинуклеотида MN184A. F. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:6) инфекционного полинуклеотида MN184B. G. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:7) инфекционного полинуклеотида Nsp2 324-434. H. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:8) инфекционного полинуклеотида Nsp2 324-523. I. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:9) инфекционного полинуклеотида Nsp2 543-632. J. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:10) инфекционного полинуклеотида Nsp2 633-726. L. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:11) инфекционного полинуклеотида Nsp2 543-726. L. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:12) инфекционного полинуклеотида Nsp2 727-813. M. Нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:13) инфекционного полинуклеотида Nsp2 324-726.

Фиг.2. Конструкция полноразмерных клонов штамма VR-2332 PRRSV. Геном, составляющий 15,4, амплифицировали в виде четырех фрагментов (I-IV), которые включали уникальные сайты расщепления ферментов рестрикции, находящиеся в вирусной кДНК (FseI, AvrII, BsrGI) или внесенные в последовательность PRRSV с 5'- и 3'-концов посредством инсерционного мутагенеза (SphI, PacI, соответственно). Промотор полимеразы T7 и 2 нематричных остатка G и остаток T расположены перед вирусной последовательностью. Вектор pOK12 (24) модифицировали с включением сайта PacI и рибозима гепатита дельта ниже полиаденозинового хвоста из 50 нуклеотидов.

Фиг.3. Схема нуклеотидных изменений инфекционных клонов или потомков свиней. Представлена диаграмма организации генома PRRSV, под которой представлены сравнения полных геномов. Предполагаемые участки расщепления неструктурных белков изображены выше ORF1a и -1b и обозначены направленными вниз стрелками. Характерные мотивы указаны ниже ORF1a и -1b направленными вверх стрелками, показывающими их расположение в геноме PRRSV [папаин-подобная цистеиновая протеаза и (PCP , PCP ); цистеиновая протеаза (CP); сериновая/3C протеаза (SP/3CP); полимераза (POL); цистеин/гистидин-богатая область (C/H); хеликаза (Hel); поли(U)-специфичная эндорибонуклеаза гомолога Xenopus laevis (XendoU); Ivanov et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 101:12694-12699 (2004); Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)]. Нуклеотидные различия показаны вертикальными полосами. 1. штамм дикого типа VR-2332 (U87392) по сравнению с образованной из VR-2332 вакциной (Ingelvac® MLV или RespPRRS, AF066183). 2. штамм дикого типа VR-2332 по сравнению с pVR-V6G7475A. 3. pVR-V5 по сравнению с пассированным in vivo V5-1-P3 (Sw612). 4. штамм дикого типа VR-2332 по сравнению с Sw612. Подробно нуклеотидные изменения представлены в таблицах 4 и 5.

Фиг.4. Сероконверсия у свиньи после инфицирования PRRSV. Растущую свинью инфицировали природным штаммом дикого типа VR-2332 ( ), Ingelvac® MLV (×), V5-1 P3 ( ) или оставляли неинфицированной ( ). На указанные сутки проводили забор образцов сыворотки и тестировали посредством IDEXX Elisa для выявления сероконверсии с помощью антител против нуклеокапсидного белка PRRSV.

Фиг.5. A. Анализы бляшкообразования потомков P3 (первая линия поколений) всех инфекционных клонов, а также штамма дикого типа VR-2332, показали бляшки различных размеров. B. Потомки P3 V5-1 после выращивания в свинье (Sw612) образовывали бляшки, сходные с бляшками штамма дикого типа VR-2332.

Фиг.6. A. Анализы бляшкообразования потомков P3 (вторая линия поколений) всех инфекционных клонов, а также штамма дикого типа VR-2332, показали бляшки с размерами, которые отличались от вирусных препаратов первой линии поколений. B. Титры вируса P4 указывают на потомков инфекционных клонов, которые не реплицировались как вирус штамма дикого типа VR-2332 или Sw612, несмотря на сходный размер бляшек.

Фиг.7. A. Потомков P3 штамма дикого типа VR-2332 ( ), Sw612 ( ), pVR-HN ( ), pVR-V5 (×), pVR-V5G7475A ( ), pVR-V6 ( ), pVR-V6G7475A ( ) одновременно исследовали на одностадийную кинетику роста, как описано в примере 1. Во все моменты времени репликация вирусов штамма дикого типа VR-2332 и Sw612 происходила до титров, больших приблизительно в 10 раз. pVR-V6G7475A, без аминокислотных изменений по сравнению с природным вирусом или вакциной, продуцировал вирус, который реплицировался с более высоким титром во все моменты времени, чем у всех других потомков инфекционных клонов. Конечный титр для каждого препарата вируса представлен в дополнительной таблице.

Фиг.8. Нозерн-блот анализ различных дочерних пассажей pVR-V6G7475A, а также Sw612 и исходных транскриптов in vitro выявил гетероклиты, которые продуцируются уже в P1, и их количество совместно с геномной РНК повышается при пассировании. Однако трансрипт РНК (Tx) не содержит легко выявляемых образцов гетероклитов.

Фиг.9. A. Схематичное изображение генома PRRSV. Предполагаемые участки расщепления неструктурных белков изображены выше ORF1a и -1b и показаны направленными вниз стрелками. Характерные мотивы показаны ниже ORF1a и -1b с указанием их расположения в геноме PRRSV [папаин-подобная цистеиновая протеаза и (PL1); цистеиновая протеаза (PL2); сериновая/3C протеаза (3CL); полимераза (RdRp); хеликаза (Hel); поли(U)-специфичная эндорибонуклеаза гомолога Xenopuslaevis (N); Ziebuhr et al., 2000; Ivanov et al., 2004; Gorbalenya et al., 2006]. B. Схематичное изображение сравнения белка ORF1 (репликаза) MN184A и MN184B и предполагаемого процессинга. В сравнение включена вырожденность, наблюдаемая в nsp2. C. Схематичное изображение сравнения белков ORF2-7 MN184A и MN184B.

Фиг.10. Выравнивание аминокислотной последовательности ORF5 дивергентных PRRSV. Темно-серыми прямоугольниками показана высокая аминокислотная консервативность (>80%; идентичными являются 16-19 остатков), средне-серыми (>60%; идентичными являются 12-15 остатков), светло-серыми (>40%; идентичными остатками являются 8-11 остатков) и незакрашенными (<40%; идентичными являются менее 8 остатков) прямоугольниками показаны менее консервативные остатки. Заштрихованной областью показана предполагаемая сигнальная последовательность, заключенными в прямоугольники областями показаны предполагаемые трансмембранные области, указаны гипервариабельные участки (HV-1 and HV-2), предполагаемая ориентация белка в вирионе указана полужирным курсивом. Консервативный остаток цистеина, который предположительно взаимодействует с M-белком, указан направленной вниз стрелкой ( ). Два консервативных предполагаемых участка N-гликозилирования обозначены звездочками и гипервариабельный участок 1 содержит штамм/изолят-специфичные участки N-гликозилирования (NxS/T). Для сравнения использовали следующие полноразмерные последовательности GenBank: VR-2332 (U87392), Ingelvac MLV (AF066183), 01NP1.2 (DQ056373), PL97-1 (AY58524), PA-8 (AF176348), SP (AF184212), BJ-4 (AF331831), HN1 (AY457635), 16244B (AF046869), HB-1 (AY150312), HB-2 (AY262352), CH-1a (AY032626), P129 (AF494042), JA142 (AY424271), SDPRRS-01-08 (AY375474), EuroPRRSV (AY366525), Lelystad (M96262), IAF-93-653 (U64931), IAF-K1op (AY184209), 98-3298 (DQ306877), 98-3403 (DQ306878), 99-3584 (DQ306879).

Фиг.11. Выравнивание аминокислотной последовательности Nsp1 дивергентных PRRSV. Происхождение фигуры и цветовая схема описаны в кратком описании фиг.10. Два полностью консервативных предполагаемых каталитических остатка указаны звездочками, и заключенными в прямоугольники аминокислотами обозначена консервативность последовательности MN184 с изолятами 1 типа и EAV. Предполагаемый сайт расщепления обозначен направленной вниз стрелкой ( ).

Фиг.12. Выравнивание аминокислотной последовательности Nsp2 дивергентных PRRSV. Полностью консервативные предполагаемые каталитические остатки цистеиновой протеазы (Cys и His) указаны звездочками, и заключенными в прямоугольники аминокислотами обозначена консервативность последовательности протеазы в PRRSV и EAV. Предполагаемые сайты расщепления указаны закрашенными стрелками ( ); дополнительные возможные сайты расщепления указаны точечной стрелкой; сигнальный пептид указан закрашенным серым прямоугольником; трансмембранные участки показаны черными прямоугольниками с точками; потенциальные участки N-гликозилирования указаны звездочкой (*). Происхождение и цветовая схема фигуры описаны в кратком описании фиг.10.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к инфекционным клонам вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV) VR-2332. Как используют в настоящем описании, термин "инфекционный клон" представляет собой полинуклеотид, имеющий два компонента: последовательность вектора, которая реплицируется в прокариотической клетке-хозяине, и второй полинуклеотид, обозначаемый в настоящем описании как инфекционный полинуклеотид. После транскрипции in vitro с получением полинуклеотида РНК и введения в пермиссивную клетку инфекционный полинуклеотид реплицируется (в виде РНК) и продуцирует инфекционные вирусные частицы. Таким образом, инфекционный полинуклеотид может находиться в векторе в виде ДНК, в виде РНК в случае вирусной частицы или в виде выделенной ДНК или РНК. Термин "полинуклеотид" относится к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо рибонуклеотидов, либо дезоксинуклеотидов, и включают как двух-, так и одноцепочечную ДНК и РНК. Если нет иных указаний, полинуклеотид включает комплементарную ему цепь. Нуклеотидную последовательность комплементарной полинуклеотиду последовательности может легко определить специалист в данной области. Полинуклеотид может включать нуклеотидные последовательности с различными функциями, включая, например, кодирующие последовательности и некодирующие последовательности, такие как регуляторные последовательности и/или нетранслируемые области. Полинуклеотид можно получать непосредственно из природного источника, или его можно получать с помощью рекомбинантных, ферментативных или химических способов. Полинуклеотид может обладать линейной или кольцевой топологией. Полинуклеотид может представлять собой, например, часть вектора, такого как экспрессирующий вектор или вектор для клонирования, или фрагмент.

В случае природного полинуклеотида, он предпочтительно является выделенным, более предпочтительно, очищенным. "Выделенное" соединение, такое как полинуклеотид, полипептид или вирусная частица, представляет собой соединение, которое извлечено из его природных окружающих условий и отделено от них. "Очищенное" соединение представляет собой соединение, которое по меньшей мере на 60%, предпочтительно на 75% и наиболее предпочтительно на 90% не содержит других компонентов, с которыми оно ассоциировано в природе. Соединения, такие как полинуклеотиды и полипептиды, которые продуцируют вне организма, в котором они встречаются в природе, например, химическими или рекомбинантными способами, рассматривают как выделенные и очищенные согласно определению, поскольку они никогда не находились в природных окружающих условиях.

Пример инфекционного полинуклеотида по настоящему изобретению включает инфекционный полинуклеотид VR-V7 (SEQ ID NO:1). VR-V7 также обозначают в настоящем описании как V6G7475A. Другие примеры инфекционных полинуклеотидов по настоящему изобретению включают VR-V5 (SEQ ID NO:2), VR-V5G7475A (SEQ ID NO:3) и VR-V6 (SEQ ID NO:4). Следует отметить, что несмотря на то, что SEQ ID NO:1, 2, 3, 4, 5, 6 и другие вирусные нуклеотидные последовательности описаны в настоящем описании в качестве последовательностей ДНК, к настоящему изобретению относятся соответствующая последовательность РНК, а также комплементарные им последовательности РНК и ДНК.

Другие инфекционные полинуклеотиды по настоящему изобретению обладают полинуклеотидной последовательностью, имеющей структурное сходство с эталонным полинуклеотидом. Эталонные полинуклеотиды включают SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, европейский прототипный штамм вируса PRRS, Lelystad (регистрационный номер Genbank M96262; SEQ ID NO:14), и североамериканский прототипный штамм вируса PRRS, VR-2332 (регистрационный номер Genbank U87392; SEQ ID NO:15). Сходство называют "процентной идентичностью" и его определяют выравниванием остатков двух полинуклеотидов (т.е. нуклеотидной последовательности инфекционного полинуклеотида-кандидата и нуклеотидной последовательности эталонного полинуклеотида) для оптимизации количества идентичных нуклеотидов вдоль длин их последовательностей; при проведении выравнивания допускаются разрывы в любой или в обеих последовательностях в целях оптимизации количества общих нуклеотидов, хотя нуклеотиды в каждой последовательности, тем не менее, должны оставаться в их правильном порядке. В некоторых аспектах настоящего изобретения разрыв (также называемый делецией) находится в последовательности инфекционного полинуклеотида-кандидата. Инфекционный полинуклеотид-кандидат представляет собой полинуклеотид, который обладает нуклеотидной последовательностью, подлежащей сравнению с эталонным полинуклеотидом. Инфекционный полинуклеотид-кандидат можно выделять из животного, такого как свинья, инфицированная PRRSV, выделенным из культивируемой клеточной линии, или его можно получать с использованием рекомбинантных способов или химически или ферментативно синтезировать. Две нуклеотидные последовательности можно сравнивать с использованием любого из коммерчески доступных компьютерных алгоритмов, обычно используемых для проведения выравнивания нуклеотидных последовательностей. Предпочтительно, две нуклеотидные последовательности сравнивают с использованием программы GAP пакета программ GCG Wisconsin Package (Accelrys, Inc.) версии 10.3 (2001). Программа GAP использует алгоритм Needleman et al., (J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970)) для проведения выравнивания двух полных последовательностей, который максимизирует количество совпадений и минимизирует количество разрывов. Предпочтительно, для всех параметров поиска GAP используют значения по умолчанию, включая оценочную матрицу = NewsgapDNA.cmp, штраф за делецию = 50, штраф за продолжение делеции = 3, среднее значение для совпадений = 10, среднее значение для несовпадений = 0. При сравнении двух нуклеотидных последовательностей с использованием алгоритма поиска GAP структурное сходство называют "процентной идентичностью." Предпочтительно, полинуклеотид обладает структурным сходством с контрольным полинуклеотидом, составляющим по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичность, когда структурное сходство определяют с использованием программы GAP.

Наличие у полинуклеотида инфекционности можно определять встраиванием инфекционного полинуклеотида-кандидата в вектор, транскрипцией инфекционного полинуклеотида-кандидата in vitro, трансфекцией пермиссивной клетки полученными молекулами РНК и детекцией вирусной РНК потомков, вирусного нуклеокапсидного белка потомков, детекцией инфекционных вирусных частиц, или их сочетания. Вектор предпочтительно обладает свойствами наличия низкого количества копий и остается стабильным после встраивания больших (например, 15 т.п.н.) вставок. Примером пригодного вектора является pOK и pOK12 (регистрационный номер GenBank AF223639, Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)), и известны и доступны другие векторы, обладающие этими свойствами. В векторе инфекционный полинуклеотид-кандидат расположен непосредственно ниже промотора. Пригодные промоторы представляют собой промоторы, которые могут быть индуцированы для достижения высоких уровней транскрипции, такие как промотор РНК-полимеразы T7, например TAATACGACTCACTATA (SEQ ID NO:16), или промоторы РНК-полимеразы SP6 и T3. Транскрпиция инфекционного полинуклеотида-кандидата, как правило, включает расщепление эндонуклеазой рестрикции вектора для его линеаризации, и продукцию транскриптов РНК с использованием общепринятых и хорошо известных способов транскрипции in vitro. Наборы для транскрипции in vitro коммерчески доступны (например, mMessage mMachine, доступные от Ambion, Austin, TX).

После транскрипции in vitro РНК очищают с использованием общепринятых способов, а затем используют для трансфекции пермиссивной клетки. Примеры пермиссивных клеток включают, например, BHK-21 (которые позволяют один цикл продукции вирусных частиц), CL-2621, MA-104 (ATCC CRL-2378), MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133:477-483 (1993)), клеточные линии, клонированные из этих клеточных линий, или первичные альвеолярные макрофаги свиней. Способы эффективной трансфекции клеток включают применение бромида 1,2-димиристилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония и холестерина (DMRIE-C), и других коммерчески доступных продуктов, предпочтительно DMRIE-C. Способы эффективной трансфекции первичных альвеолярных макрофагов свиньи известны в данной области (Groot Bramel-Verheige et al., Virol., 278:380-389 (2000)). Как правило, для трансфекции можно использовать от 2 до 3 микрограмм РНК, однако можно использовать меньшие и большие количества. После подходящего периода времени наличие вирусной РНК потомков можно выявлять, например, посредством полимеразной цепной реакции с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР). Аналогично вирусный нуклеокапсидный белок потомков можно выявлять, например, с помощью специфичного к нуклеокапсиду антитела. Кроме того, наличие последующего инфицирования вирусными частицами, продуцируемыми клетками, трансфицированными инфекционным полинуклеотидом-кандидатом, другой клетки можно определять, подвергая неинфицированные пермиссивные клетки воздействию супернатанта инфицированных клеток. Необязательно, можно определять цитопатический эффект (CPE). Инфекционный полинуклеотид-кандидат рассматривают как инфекционный полинуклеотид, когда он продуцирует вирусную РНК потомков, вирусные белки потомков (нуклеокапсидный, мембранный, GP5 и другие), и инфицирует другие пермиссивные клетки.

В некоторых аспектах настоящего изобретения инфекционный полинуклеотид включает делецию нуклеотидов, кодирующих неструктурный белок 2 (nsp2), один из нескольких (12 предсказанных) полипептидов, представленных в полибелке, кодируемом ORF1. В вирусе PRRS и его инфекционных полинуклеотидах, нуклеотиды, кодирующие первую аминокислоту nsp2, можно определять идентификацией участка расщепления папаин-подобной протеазы 1-бета, для которого предсказано, что он расположен после аминокислоты глицина ORF1 в положении 383 VR-2332.

В отношении идентификации нуклеотидов, кодирующих последнюю аминокислоту nsp2, точный C-концевой для nsp2 сайт расщепления кодируемого ORF1a полибелка эмпирически не определен, таким образом, нуклеотиды, соответствующие 3'-концу кодирующей области, неизвестны. Однако было предсказано два C-концевых сайта расщепления, один Gly|Gly (где вертикальной линией между двумя остатками глицина показано положение расщепления) по аминокислоте 980 в VR-2332, и другой по аминокислоте 1197 в VR-2332. При выравнивании всех имеющихся последовательностей PRRSV существует несколько полностью консервативных дублетов Gly|Gly в этом белке, которые также могут представлять собой C-концевой для nsp2 сайт расщепления полибелка (аминокислоты 646, 980, 1116, 1196, 1197) в VR-2332. Положения дублетов Gly|Gly в других вирусах и инфекционных полинуклеотидах можно идентифицировать сравнением последовательностей nsp2 и дублетов Gly|Gly, описанных на фиг.12. Современные исследования позволяют предположить, что в nsp2 может существовать по меньшей мере 3 сайта расщепления, соответствующих аминокислотам 980, 1116, 1196 или 1197.

Полипептид nsp2 включает высококонсервативный домен химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы (показанный как CP на фиг.3 и PL2 на фиг.9), находящийся на N-конце, и 3-4 предсказанных трансмембранных домена рядом с C-концом nsp2 (где количество трансмембранных доменов варьирует в зависимости от расположения C-концевого сайта расщепления). Как правило, делеция нуклеотидов, кодирующих аминокислоты домена PL2 или всех предсказанных трансмембранных доменов, приводит к полинуклеотиду, который может реплицироваться в пермиссивных клетках, но не продуцирует инфекционных вирусных частиц. Таким образом, инфекционный клон по настоящему изобретению, как правило, не включает делецию всего домена PL2 или всех предсказанных трансмембранных доменов.

Нуклеотиды, кодирующие домен химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы, представляют собой нуклеотиды с 1474 по 1776 в VR-V7 (SEQ ID NO:1), нуклеотиды с 1474 по 1776 в VR-2332 (регистрационный номер Genbank U87392), и нуклеотиды с 1482 по 1784 в Lelystad (регистрационный номер Genbank M96262). Положение домена химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы в нуклеотидной последовательности других вирусов PRRS можно идентифицировать выравниванием аминокислотной последовательности полипептида nsp2, кодируемого вирусом PRRS, с результатом выравнивания аминокислотных последовательностей, описанным на фиг.12, и определением того, какие нуклеотиды кодируют те аминокислоты, которые выравниваются с доменом химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы. Альтернативно аминокислотные последовательности полипептидов nsp2 других вирусов PRRS можно идентифицировать выравниванием аминокислотной последовательности полипептида nsp2, кодируемого вирусом PRRS с аминокислотной последовательностью полипептидов nsp2, продуцируемых другими артеривирусами, такими как вирус артериита лошадей (EAV) и вирус повышения уровня лактатдегидрогеназы (LDV).

Нуклеотиды, кодирующие предсказанные трансмембранные домены VR-V7 (SEQ ID NO:1), VR-2332 (регистрационный номер Genbank U87392) и Lelystad (регистрационный номер Genbank M96262), представлены в таблице 1.

Таблица 1
Нуклеотиды Nsp2, кодирующие предсказанные трансмембранные домены
	VR-V7	VR-2332	Lelystad
Трансмембранный домен I	с 881 по 901	с 881 по 901	с 761 по 781
Трансмембранный домен II	с 913 по 934	с 913 по 934	с 793 по 814
Трансмембранный домен III	с 963 по 980	с 963 по 980	с 843 по 860
Трансмембранный домен IV	с 985 по 1003	с 985 по 1003	с 865 по 883

Расположение трансмембранных доменов в нуклеотидной последовательности других вирусов PRRS можно определять выравниванием аминокислотной последовательности полипептида nsp2, кодируемого вирусом PRRS, с результатом выравнивания аминокислотной последовательности, описанным на фиг.12, и определением того, какие нуклеотиды кодируют те аминокислоты, которые выравниваются с трансмембранными доменами. Альтернативно положение трансмембранных доменов можно определить с помощью компьютерного алгоритма, такого как алгоритм PredictProtein, как описано Rost et al. (Nucleic Acids Res., 32 (публикация на Web-сервере): W321-326 (2004), или алгоритм TMHMM, как описано Krogh et al. (J. Mol. Biol., 305: 567-580 (2001)), и доступный через Всемирную сеть.

Делеция, имеющаяся в инфекционных полинуклеотидах по настоящему изобретению, как правило, находится между нуклеотидами, кодирующими домен химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы, и нуклеотидами, кодирующими трансмембранные домены, и не приводит к сдвигу рамки считывания в рамке считывания ORF1. Как описано выше, делеция, как правило, не включает каких-либо нуклеотидов, кодирующих домен химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы, каких-либо нуклеотидов, кодирующих трансмембранные домены, или их сочетание. В некоторых аспектах, например, когда инфекционный полинуклеотид обладает структурным сходством с SEQ ID NO:1, 5'-граница делеции расположена в области нуклеотида 2305, нуклеотида 2205, нуклеотида 2105 или нуклеотида 2062, и 3'-граница делеции расположена в области нуклеотида 3774, нуклеотида 3804, нуклеотида 3834 или нуклеотида 3864. В других аспектах, например, когда инфекционный полинуклеотид обладает структурным сходством с SEQ ID NO:14, 5'-граница делеции расположена в области нуклеотида 2304, нуклеотида 2204, нуклеотида 2104 или нуклеотида 2061, и 3'-граница делеции расположена в области нуклеотида 3455, нуклеотида 3495, нуклеотида 3525 или нуклеотида 3545. Делеция может представлять собой по меньшей мере 39 нуклеотидов, 48 нуклеотидов или 57 нуклеотидов. В некоторых аспектах делеция может представлять собой по меньшей мере 267 нуклеотидов, по меньшей мере 276 нуклеотидов или по меньшей мере 285 нуклеотидов. В некоторых аспектах делеция составляет не более 489 нуклеотидов, не более 459, не более 429 или не более 402 нуклеотидов. Инфекционный полинуклеотид может иметь более одной делеции в участке nsp2.

Примеры инфекционных полинуклеотидов, образованных из VR-V7 и содержащих делецию, представлены в таблице 2.

Таблица 2
Инфекционные полинуклеотиды, образованные из VR-V7 (SEQ ID NO:1)
Полинуклеотид*	Делетированные нуклеотиды SEQ ID NO:1	Делетированные аминокислоты ORF1	Титры вирусов (Б.О.Е./мл)	Краткая информация о фенотипе**
Nsp2 180-323	1876-2304	563-705	-	Нежизнеспособный
Nsp2 242-323	2056-2304	623-705	-	Нежизнеспособный
Nsp2 324-434	2305-2637	706-816	+(~105)	Маленький размер бляшек
Nsp2 324-523	2305-2904	706-905	+(~105-106)	Промежуточный
Nsp2 543-632	2962-3231	925-1014	+(-105)	Маленький размер бляшек
Nsp2 633-726	3232-3513	1015-1108	+(~105)	Маленький размер бляшек
Nsp2 543-726	2962-3513	925-1108	+(~105)	Маленький размер бляшек
Nsp2 727-813	3514-3774	1109-1195	+(~10i)	Маленький размер бляшек
Nsp2 324-726	2305-3513	706-1108	+(-101-2)	ND
Nsp2 324-813	2305-3774	706-1195	-	Нежизнеспособный
Nsp2 727-845	3514-3870	1109-1227	-	Нежизнеспособный
Nsp2 324-845	2305-3870	706-1227	-	Нежизнеспособный
* делеция относится к аминокислотам nsp2, которые являются делетированными, например, в вирусе Nsp2 180-323 делетированы аминокислоты 180-323 nsp2. **размер бляшек приведен относительно бляшек, образуемых VR-2332 дикого типа.

Инфекционный полинуклеотид, содержащий делецию, может включать экзогенный полинуклеотид, встроенный вместо делеции. "Экзогенный" полинуклеотид относится к чужеродной нуклеотидной последовательности, т.е. к нуклеотидной последовательности, которая в норме не представлена в вирусе PRRS или его инфекционном клоне. Экзогенный полинуклеотид может кодировать, и предпочтительно кодирует, полипептид. Пригодные экзогенные полинуклеотиды включают полинуклеотиды, кодирующие детектируемый маркер, например молекулу, которую легко выявить различными способами. Его примеры включают флуоресцентные полипептиды (например, зеленый, желтый, голубой или красный флуоресцентный белки), люциферазу, хлорамфениколацетилтрансферазу и другие молекулы (такие как c-myc, flag, 6xhis, HisGln (HQ) металл-связывающий пептид, и V5-эпитоп), выявляемые по их флуоресценции, ферментативной активности или иммунологическим свойствам, и, как правило, они пригодны при детекции в клетке, например культивируемой клетке, или в образце ткани, который извлекли из животного. Другие экзогенные полинуклеотиды, которые можно использовать, представляют собой полинуклеотиды, кодирующие полипептиды, экспрессируемые другими организмами, такими как клетки и патогены. Экспрессия экзогенного полинуклеотида приводит к инфекционному полинуклеотиду, который экспрессирует чужеродные антигены. Примеры последовательностей экзогенных нуклеотидов включают последовательности, кодирующие белки, экспрессируемые патогенами, предпочтительно патогенами свиней, такими как цирковирус свиней 2 типа, Mycoplasma hyopneumoniae (например, белки P46 и P65 M. hyopneumoniae), Lawsoniaintracellularis (например, белки наружной мембраны L. intracellularis), ORF5 других штаммов PRRSV и Streptococcussuis (например, белок массой 38 кДа S. suis). Полипептид nsp2 имеет B-клеточные эпитопы и предположительно является иммуногенным. Полагают, что включение чужеродных эпитопов в полипептид nsp2 приведет к иммунному ответу на чужеродные эпитопы. Дополнительные примеры экзогенных полинуклеотидов включают полинуклеотиды, кодирующие модуляторы биологического ответа, например, такие как IFN- , IFN- , IL-12, IL-2, TNF- и IL-6.

Экзогенный полинуклеотид встраивают в область делеции, чтобы он располагался в одной рамке с открытой рамкой считывания, кодирующей nsp1 и nsp1 , и можно встраивать более одного экзогенного полинуклеотида последовательно, например, могут существовать нуклеотидные последовательности, кодирующие три эпитопа c-myc. Общий размер инфекционного полинуклеотида, содержащего экзогенный полинуклеотид, встроенный вместо делеции, как правило, не превышает 16000 оснований, не превышает 15800 оснований, не превышает 15600 оснований, не превышает 15400 оснований или не превышает 15200 оснований (включая поли-A-хвост). Вставка может находиться в инфекционном полинуклеотиде, имеющем делецию Nsp2 324-434, Nsp2 324-523, Nsp2 543-632, Nsp2 633-726, Nsp2 543-726, Nsp2 727-813 или Nsp2 324-726, предпочтительно, делецию Nsp2 324-434, Nsp2 543-632, Nsp2 633-726, Nsp2 543-726, Nsp2 727-813 или Nsp2 324-726. Предпочтительные примеры инфекционных клонов, содержащих экзогенный полинуклеотид в области делеции, включают инфекционный полинуклеотид, имеющий делецию Nsp2 324-434, содержащий кодирующий участок, кодирующий зеленый флуоресцентный белок из 238 аминокислот, инфекционный полинуклеотид, имеющий делецию Nsp2 543-632, содержащий кодирующий участок, кодирующий зеленый флуоресцентный белок из 238 аминокислот, инфекционный полинуклеотид, имеющий делецию Nsp2 324-434, содержащий кодирующий участок, кодирующий эпитоп c-myc из 10 аминокислот (EQKLISEEDL, SEQ ID NO:17), инфекционный полинуклеотид, имеющий делецию Nsp2 324-434, содержащий кодирующий участок, кодирующий эпитоп c-myc из 10 аминокислот, и инфекционный полинуклеотид, имеющий делеции Nsp2 324-726 или Nsp2 543-726, каждый из которых содержит кодирующий участок, кодирующий тандемный повтор из эпитопов c-myc из 10 аминокислот.

Инфекционный полинуклеотид, как правило, находится в векторе, и сочетание инфекционного полинуклеотида и вектора называют инфекционным клоном, который получают с помощью обратной генетики. Вектор представляет собой реплицирующийся полинуклеотид, такой как плазмида, фаг или космида, к которому может быть присоединен другой полинуклеотид, для осуществления репликации присоединенного полинуклеотида. Для конструирования векторов, содержащих полинуклеотид по этому изобретению, используют стандартные способы рекомбинантных ДНК, известные в данной области (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Может быть получен вектор для дальнейшего клонирования (амплификации полинуклеотида), т.е. клонирующий вектор, или для экспрессии полипептида, кодируемого кодирующей областью, т.е. экспрессирующий вектор, или их сочетание. Термин вектор включает, но не ограничивается ими, плазмидные векторы, вирусные векторы, космидные векторы или векторы в виде искусственных хромосом. Как правило, вектор способен реплицироваться в бактериальном хозяине, например в E. coli. Предпочтительно вектор представляет собой плазмиду.

Выбор вектора зависит от множества требуемых свойств в конечной конструкции, таких как маркер селекции, скорость репликации вектора и т.п. Предпочтительно, вектор, пригодный для применения в качестве части инфекционного клона, является как клонирующим вектором, так и экспрессирующим вектором. Пригодные векторы обладают низкой копийностью в клетке-хозяине. Пригодные здесь клетки-хозяева для клонирования или экспрессии векторов представляют собой прокариотические или эукариотические клетки. Предпочтительно клетка-хозяин секретирует минимальные количества протеолитических ферментов. Пригодные прокариоты включают эубактерии, такие как грамотрицательные организмы, например, E. coli или S. typhimurium. Иллюстративные клетки-хозяева, пригодные для получения, манипуляций и поддержания инфекционного клона, представляют собой DH-5 , DH-1 (ATCC 33849) и AG-1, предпочтительно, DH-1 или AG-1.

Вектор включает регуляторные последовательности, функционально связанные с инфекционным полинуклеотидом. Термин "функционально связанный" относится к расположению компонентов рядом, так чтобы они находились во взаимосвязи, позволяющей им функционировать предполагаемым для них образом. Регуляторная последовательность "функционально связана" с инфекционным полинуклеотидом по настоящему изобретению, когда она присоединена к нему таким образом, чтобы достигалась экспрессия кодирующей области в условиях, совместимых с регуляторной последовательностью. Как правило, промотор является таким, чтобы обеспечивать высокую специфичность связывания РНК-полимеразы, и такие промоторы включают T7, SP6 и T3. Как правило, промотор расположен непосредственно выше первого нуклеотида инфекционного полинуклеотида. Предпочтительно, между промотором и первым нуклеотидом инфекционного полинуклеотида встроен GGT. Необязательно и предпочтительно вектор также содержит рибозим вируса гепатита дельта ниже поли-A-области.

Вектор необязательно и предпочтительно включает одну или несколько последовательностей маркеров селекции, которые, как правило, кодируют молекулу, которая инактивирует или иным образом выявляет соединение в среде для роста или выявляется с его помощью. Например, включение последовательности маркера селекции может придать трансформированной клетке устойчивость к антибиотику, или оно может обеспечить в трансформированной клетке метаболизм, специфичный в отношении соединения. Примеры последовательности маркера селекции представляют собой последовательности, которые придают устойчивость к канамицину, ампициллину, хлорамфениколу, тетрациклину и неомицину.

При внесении делеции нуклеотидов, кодирующих полипептид nsp2, в инфекционный клон, можно использовать стандартные способы рекомбинантных ДНК, известные в данной области (см., например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). Как будет понятно специалисту в данной области, стандартной практикой в ходе конструирования инфекционного клона (и при внесении делеций в инфекционный клон) является проверка с помощью анализа нуклеотидной последовательности наличия ожидаемой нуклеотидной последовательности, такой как делеции или другие изменения и отсутствие других мутаций. Аналогично, когда инфекционный полинуклеотид-кандидат тестируют для определения наличия у него инфекционности, стандартной практикой является проверка с помощью анализа нуклеотидной последовательности отсутствия загрязнения вирусом дикого типа.

Настоящее изобретение также относится к выделенным инфекционным полинуклеотидам, представленным в SEQ ID NO:5 и SEQ ID NO:6, и инфекционным полинуклеотидам, имеющим структурное сходство с SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6. Способы определения структурного сходства описаны в настоящем описании. Предпочтительно, инфекционные полинуклеотиды этого аспекта настоящего изобретения обладают структурным сходством с SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6, составляющим по меньшей мере 88%, по меньшей мере 89%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99%. Полинуклеотид, обладающий структурным сходством с SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6 рассматривают как инфекционный полинуклеотид, если, когда он находится в вирусной частице и предоставлен пермиссивным клеткам, полинуклеотид реплицируется в пермиссивных клетках и продуцирует инфекционные вирусные частицы.

Настоящее изобретение также относится к выделенным вирусным частицам. Как используют в настоящем описании, термины "частица вируса" и "вирусная частица" используют взаимозаменяемо, и они относятся к полинуклеотиду по настоящему изобретению, окруженному оболочкой. Частица вируса по настоящему изобретению может, при добавлении к культивируемой пермиссивной клетке, реплицироваться с продукцией в результате большего количества вирусных частиц.

Вирусную частицу можно выращивать пассированием in vivo или в клеточной культуре. Пассирование in vivo включает инокуляцию свинье (Faaberg et al., патент США 7041443). Пассирование в клеточной культуре включает оказание воздействия вирусных частиц на культивируемые клетки и инкубацию клеток в условиях, пригодных для репродукции вируса и продукции большего количества вирусных частиц. Предпочтительно, культивируемые клетки не являются иммортализованной или трансформированной клеточной линией (т.е. клетки не способны к неограниченному делению). Предпочтительно, для пассирования в клеточной культуре используют альвеолярные макрофаги свиней (Faaberg et al., патент США 7041443).

Вирус по настоящему изобретению может быть инактивированным, т.е. которому придали неспособность к репродукции in vivo и/или в клеточной культуре. Способы инактивации известны в данной области и включают, например, обработку частицы вируса по этому изобретению стандартным химическим инактивирующим средством, таким как альдегидный реагент, включая формалин, ацетальдегид и т.п.; реакционно-способные кислые спирты, включая крезол, фенол и т.п.; кислоты, такие как бензойная кислота, бензолсульфоновая кислота и т.п.; лактоны, такие как бета-пропиолактон и капролактон; и активированные лактамы, карбодиимиды и карбонильные дигетероароматические соединения, такие как карбонилдиимидазол. Для инактивации вируса можно использовать излучение, такое как ультрафиолет и гамма-излучение.

Также к настоящему изобретению относятся аттенуированные вирусные частицы (т.е. вирусы, обладающие сниженной способностью вызывать у свиней симптомы загадочной болезни свиней) и способы получения аттенуированной частицы вируса. Способы получения аттенуированного вируса известны в данной области. Как правило, вирус по настоящему изобретению пассируют, т.е. используют дли инфицирования клетки в культуре, обеспечивают его репродукцию, а затем собирают. Этот процесс повторяют до снижения вирулентности вируса у свиней. Например, вирус можно пассировать 10 раз в клеточной культуре, а затем измерять вирулентность вируса. Если вирулентность не снизилась, вирус, который не инъецировали в животного, пассируют дополнительные 10 раз в клеточной культуре. Этот процесс повторяют до тех пор, пока не снизится вирулентность. Как правило, вирулентность определяют инокуляцией свиней вирусом и оценкой наличия клинических симптомов и/или LD₅₀ (см., например, Halbur et al., J. Vet. Diagn. Invest.,8:11-20 (1996), Halbur et al., Vet. Pathol., 32:200-204 (1995), и Park et al., Am. J. Vet. Res., 57:320-323 (1996)). Предпочтительно, вирулентность снижается таким образом, что аттенуированный вирус не вызывает гибели животных и предпочтительно не вызывает клинических симптомов заболевания.

Как правило, клеточная культура, пригодная для продукции аттенуированного вируса по настоящему изобретению, включает клетки, источником которых является млекопитающее, не являющееся свиньей. Примеры культур клеток млекопитающих, не относящихся к свинье, включают, например, клеточную линию MA-104 (ATCC CRL-2378), клеточную линию MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133:477-483 (1993)) и клеточную линию CL-2621 (Baustita et al., J. Vet. Diagn. Invest., 5:163-165 (1993)). Предпочтительно, для продукции аттенуированной частицы вируса по настоящему изобретению используют смешанную клеточную культуру. В смешанной клеточной культуре представлено по меньшей мере два типа клеток. Предпочтительно, смешанная клеточная культура включает иммортализованную или трансформированную клеточную линию и первичную клеточную культуру. Смешанная клеточная культура, в частности, пригодна, когда вирус воспроизводится медленно или не воспроизводится, в иммортализованной или трансформированной клеточной линии. Предпочтительные примеры иммортализованной или трансформированной клеточной линии для применения в смешанной клеточной культуре включают, например, клеточную линию MARC-145 (Kim et al., Arch. Virol., 133:477-483 (1993)), и клеточную линию MA-104 (ATCC CRL-2378). Предпочтительно, источником первичных клеточных культур для применения в смешанной клеточной культуре является свинья. Предпочтительным примером первичной клеточной культуры для применения в смешанной клеточной культуре являются первичные альвеолярные макрофаги свиней.

Кроме того, настоящее изобретение относится к полипептидам, кодируемым кодирующими областями nsp2, находящимися в полинуклеотидах, описанных в таблице 2, включая те, которые являются жизнеспособными. Также к настоящему изобретению относятся антитела, в том числе моноклональные и поликлональные антитела, которые специфично связывают полипептид, кодируемый кодирующими областями nsp2, находящимися в полинуклеотидах, описанных в таблице 2. Если нет иных указаний, термин "антитело" включает фрагменты целых антител, которые сохраняют их связывающую активность в отношении антигена-мишени. Такие фрагменты включают фрагменты Fv, F(ab') и F(ab')₂, а также одноцепочечные антитела (scFv). Как используют в настоящем описании, антитело, которое может "специфично связывать" полипептид, представляет собой антитело, которое взаимодействует только с эпитопом антигена, который индуцирует синтез антитела, или взаимодействует со структурно сходным эпитопом. Антитело, которое "специфично связывается" с эпитопом, в соответствующих условиях взаимодействует с эпитопом даже в присутствии разнообразных потенциальных мишеней для связывания. Как используют в настоящем описании, термин "комплекс полипептид:антитело" относится к комплексу, который является результатом специфичного связывания антитела с полипептидом или его субъединицей или аналогом. В некоторых аспектах, антитело по настоящему изобретению включает антитело, которое не связывается специфично с полноразмерным полипептидом nsp2, кодируемым VR-2332 (например, регистрационный номер Genbank U87392, аминокислоты ORF1 384-1363 (также см. Allende et al., J. Gen. Virol., 80:307-315 (1999) или аминокислоты ORF1 384-1580 (также см. Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)). Такие антитела можно идентифицировать с использованием общепринятых способов, известных в данной области.

Антитела по настоящему изобретению можно получать с использованием целого полипептида. Необязательно, полипептид nsp2, описанный в настоящем описании, может быть ковалентно связан или конъюгирован с полипептидом-носителем для улучшения иммунологических свойств полипептида. Пригодные полипептиды-носители известны в данной области.

Способы получения поликлональных антител хорошо известны. Поликлональные антитела можно получать иммунизацией различных теплокровных животных, таких как лошади, коровы, козы, овцы, собаки, куры, кролики, мыши, хомяки, морские свинки и крысы, а также трансгенных животных, таких как трансгенные овцы, коровы, козы или свиньи, иммуногеном. Полученные антитела можно отделять от других белков с использованием аффинной колонки, имеющий Fc-связывающую молекулу, такую как белок A, или сходные с ним.

Моноклональные антитела можно получать различными способами, известными специалистам в данной области. В кратком изложении, клетки селезенки животного, иммунизированного требуемым антигеном, иммортализуют обычно посредством слияния с клеткой миеломы (см., например, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Моноклональные антитела можно выделять и очищать из культур гибридом способами, хорошо известными в данной области.

В некоторых вариантах осуществления антитело можно получать рекомбинантными способами, например, посредством фагового дисплея или комбинаторными способами. Фаговый дисплей и комбинаторные способы можно использовать для выделения рекомбинантных антител, которые связываются с полипептидом, описанным в настоящем описании, или его биологически активной субъединицей или аналогом (см., например, Ladner et al., патент США No. 5223409). Такие способы можно использовать для получения моноклональных антител человека.

Настоящее изобретение также относится к композициям, включающим инфекционный полинуклеотид, полинуклеотид PRRS, вирусную частицу или антитело по настоящему изобретению. Такие композиции, как правило, включают фармацевтически приемлемый носитель. Как используют в настоящем описании, "фармацевтически приемлемый носитель" включает физиологический раствор, растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, обеспечивающие изотоничность средства и средства для замедления всасывания и т.п., совместимые с фармацевтическим введением. Также в композиции могут быть включены дополнительные активные соединения.

Композицию можно получать способами, хорошо известными в области фармацевтики. Как правило, композицию можно составлять таким образом, чтобы она была совместима с предполагаемым способом введения. Примеры способов введения включают перфузию и парентеральные способы, например внутривенный, внутрикожный, подкожный, пероральный (например, ингаляция), трансдермальный (местный) способы и введение через слизистую оболочку. Растворы или суспензии могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для введения, физиологический раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; электролиты, такие как ион натрия, ион хлорида, ион калия, ион кальция и ион магния, и средства для изменения тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. pH можно изменять с помощью кислот или оснований, таких как хлористоводородная кислота или гидроксид натрия. Композиция может быть заключена в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с многократной дозой, изготовленные из стекла или пластмассы.

Композиции могут включать стерильные водные растворы (когда они растворимы в воде) или дисперсии и стерильные порошки для изготовления стерильных растворов или дисперсий для немедленного приема. Для внутривенного введения пригодные носители включают физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL^TM (BASF, Parsippany, NJ.) или фосфатно-солевой буфер (PBS). Композиция, как правило, является стерильной и, когда она пригодна для применения посредством инъекции, должна быть настолько жидкой, чтобы легко проникать в шприц. Она должна быть стабильной в условиях изготовления и хранения, и в ней должно быть предотвращено загрязняющее действие микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Носитель может представлять собой растворитель или дисперсионную среду, содержащую, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль и т.п.), и их приемлемые смеси. Воздействие микроорганизмов можно предотвращать с помощью различных антибактериальных и противогрибковых средств, например парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты, тимеросала и т.п. Во многих случаях предпочтительным является включение в композицию обеспечивающих изотоничность средств, например сахаров, полиспиртов, таких как маннит, сорбит, хлорид натрия. Пролонгированное всасывание инъецируемых композиций может быть достигнуто включением в композицию вещества, которое замедляет всасывание, например моностеарата алюминия и желатина.

Стерильные растворы можно получать добавлением активного соединения (т.е. инфекционного полинуклеотида или вируса PRRS по настоящему изобретению) в требуемом количестве в пригодный растворитель с одним или с сочетанием ингредиентов, приведенных выше, при необходимости, с последующей стерилизацией фильтрацией. Как правило, дисперсии получают добавлением активного соединения в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и другие необходимые ингредиенты среди тех, которые приведены выше. В случае стерильных порошков для получения стерильных инъецируемых растворов, предпочтительными способами получения являются вакуумная сушка и лиофилизация, которые приводят к получению порошка активного ингредиента с любым дополнительным требуемым ингредиентом из их предварительно стерилизованного фильтрацией раствора.

Пероральные композиции, как правило, включают инертный разбавитель или пищевой носитель. Для перорального терапевтического введения активное соединение можно добавлять с эксципиентами и использовать в форме таблеток, лепешек или капсул, например желатиновых капсул. Эти композиции также можно превращать в порошок или суспендировать в водном растворе, так чтобы эти порошки и/или растворы можно было добавлять в корм для животных или в питьевую воду животных. Эти композиции можно в достаточной степени подслащивать или ароматизировать различными известными средствами для обеспечения перорального приема вакцины свиньей.

Активные соединения также можно вводить любым способом, пригодным для введения полинуклеотидных средств, например, с использованием генных пушек, биологических устройств для инъекций и кожных пластырей, а также безыгольных способов, таких как технология ДНК-вакцин на основе микрочастиц, описанная Johnston et al. (патент США No. 6194389). Кроме того, возможна интраназальная доставка, как описано, например, в Hamajima et al., Clin. Immunol. Immunopathol., 88:205-210 (1998). Также можно использовать липосомы и микроинкапсулирование.

Активные соединения можно получать с носителями, которые предотвращают быстрое выведение соединения из организма, такими как состав для контролируемого высвобождения, включая имплантаты. Можно использовать биологически деградируемые, биологически совместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полимолочная кислота. Такие составы можно получать с использованием стандартных способов. Вещества также можно получать коммерчески, например, от Alza Corporation и Nova Pharmaceuticals, Inc. Также в качестве фармацевтически приемлемых носителей можно использовать липосомальные суспензии. Их можно получать в соответствии со способами, известными специалистам в данной области.

Токсичность и терапевтическую эффективность таких активных соединений можно определять с помощью стандартных фармацевтических способов в клеточных культурах или у экспериментальных животных, например способов определения LD ₅₀ (доза, летальная для 50% выборки) и ED₅₀ (доза, терапевтически эффективная для 50% выборки). Отношение доз для токсического и терапевтического эффектов представляет собой терапевтический индекс, и он может быть выражен отношением LD₅₀/ED₅₀. Предпочтительными являются соединения, которые обладают высокими терапевтическими индексами.

Данные, полученные на основе анализов в клеточных культурах и исследований на животных, можно использовать при составлении диапазона дозировок для применения в естественных условиях. Дозировки таких соединений предпочтительно находятся в диапазоне концентраций в кровотоке, которые включают ED₅₀ с небольшой токсичностью или с отсутствием токсичности. Дозировка может варьировать в этом диапазоне в зависимости от используемой дозированной формы и используемого способа введения.

Композиции можно вводить от одного или нескольких раз в сутки до одного или нескольких раз в неделю, в том числе один раз в двое суток. Квалифицированный специалист поймет, что определенные факторы могут влиять на дозировку и период времени, требуемые для эффективного лечения субъекта, включая, но не ограничиваясь ими, тяжесть заболевания или нарушения, предшествующее лечение, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие имеющиеся заболевания. Более того, лечение субъекта эффективным количеством полипептида может включать однократное лечение или, предпочтительно, оно может включать серию лечений.

Настоящее изобретение относится к способам применения композиций, описанных в настоящем описании. В одном аспекте это изобретение относится к способам лечения одного или нескольких симптомов загадочной болезни свиней у животного, которая может быть вызвана инфекцией вирусом PRRS. Способ включает введение эффективного количества композиции по настоящему изобретению животному, имеющему или подверженному риску загадочной болезни свиней или симптомов загадочной болезни свиней.

Лечение загадочной болезни свиней или симптомов загадочной болезни свиней может быть профилактическим или, альтернативно, оно может быть начато после появления заболевания или его симптомов. Как используют в настоящем описании, термин "симптом" относится к объективным признакам у субъекта загадочной болезни свиней. Симптомы, связанные с загадочной болезнью свиней, и оценка таких симптомов являются распространенными и они известны в данной области. Примеры симптомов включают аборт, анорексию, лихорадку, сонливость, пневмонию, красную/голубую депигментацию ушей, затрудненное дыхание (диспноэ) и повышенную частоту дыхания (тахипноэ). Профилактическое лечение, например, начинаемое до появления у субъекта симптомов состояния, вызванного вирусом PRRS, относится в настоящем описании к лечению субъекта, который "подвержен риску" развития заболевания или его симптомов. Как правило, животное, "подверженное риску", представляет собой животное, находящееся на территории, где выявлены животные, имеющие заболевание или его симптомы, и/или где существует вероятность воздействия вируса PRRS. Таким образом, введение композиции можно проводить до, в течение или после возникновения состояний, описанных в настоящем описании. Лечение, начинаемое после развития состояния, может приводить к снижению тяжести симптомов одного из состояний или к полному устранению симптомов.

В некоторых аспектах способы, как правило, включают введение животному композиции, включающей эффективное количество вирусной частицы по настоящему изобретению. "Эффективное количество" представляет собой количество, эффективное для предотвращения появления симптомов загадочной болезни свиней, снижения тяжести симптомов заболевания и/или полного устранения симптомов. Как правило, эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к гуморальному и/или клеточному иммунному ответу, который защищает животное в ходе последующего воздействия вируса PRRS. Вирусная частица, используемая в композиции, может содержать инфекционный полинуклеотид, который обладает делецией, как описано в настоящем описании. Необязательно, инфекционный полинуклеотид также включает экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции. Преимущество использования вирусной частицы, имеющей делецию (или экзогенный полинуклеотид, находящийся в области делеции), состоит в том, что ее можно легко отличить от других вирусов PRRS, включая вирусы PRRS дикого типа, встречающиеся в областях применения. Вирусную частицу можно идентифицировать выделением вируса из животного с последующим, например, секвенированием, расщеплением ферментом рестрикции или амплификацией конкретных нуклеотидов на основе ПЦР. Такую "маркированную" вирусную частицу часто называют в данной области маркерной вакциной.

В других аспектах настоящего изобретения инфекционные клоны и/или инфекционные полинуклеотиды, описанные в настоящем описании, можно использовать для исследования жизнеспособных вставок в гены, для исследования альтернативных экспрессируемых РНК или белков, отличных от полноразмерного вируса, для исследования рекомбинации вирусов и для исследования иммуногенных свойств полноразмерного nsp2 относительно укороченного nsp2.

ПРИМЕРЫ

Пример 1

Разрабатывали полноразмерные кДНК-клоны прототипного штамма VR-2332 вируса североамериканского репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), где каждый последующий вариант обладает меньшим количеством нуклеотидных изменений, чем предшествующие варианты, по сравнению со штаммом VR-2332 дикого типа. Дочерние вирусы каждого инфекционного клона выделяли и анализировали для проверки нуклеотидной последовательности, скорости роста in vitro и размера бляшек. Для потомков одного инфекционного клона подтвердилась активная репликация in vivo, которую выявляли по появлению антител против -PRRSV с той же скоростью, что и в случае вируса дикого типа. Нозерн-блот анализ потомков in vivo также показал, что наряду с полноразмерными геномами были представлены образцы с дефектной субгеномной РНК, называемые гетероклитами (редкие формы). Одновременный нозерн-блот анализ пассированных серий инфицированных клеточных культур MA-104 показал, что рекомбинантный вирус только постепенно приобретал профиль как полноразмерной, так гетероклитной РНК, сходный с образцами РНК, выявляемыми при инфекции in vivo.

Материалы и способы

Клетки и штаммы вирусов. Клетки MA-104 или происходящие из них клетки MARC-145 (ATCC CRL-11171), клеточную линию почки африканской зеленой обезьяны, которая поддерживает репликацию PRRSV (Meng et al., J. Vet. Diagn. Invest.,8:374-81 (1996)), содержали в минимальной поддерживающей среде Игла (EMEM) (JRH Biosciences 56416), дополненной 1 мг/мл NaHCO₃ и 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС), при 37°C с 5% CO₂. Когда рост монослоя достиг 70-80% смыкания, культивируемые клетки трансфицировали РНК или инфицировали вирусом. Североамериканские прототипные штаммы VR-2332 PRRSV и Ingelvac® MLV описаны ранее (Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001)). В обеих клеточных линиях рост штамма VR-2332 происходит до эквивалентных титров.

Очистка вирусной РНК. Вирусную РНК (vRNA) очищали, как описано (Chen et al., J. Gen. Virol., 75:925-930 (1994); Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001)). В кратком изложении, супернатант из клеток MARC-145, инфицированных VR-2332, собирали на 4 сутки после инфицирования (p.i.). После удаления клеточного дебриса центрифугированием при 12000 об/мин супернатанты наслаивали на 2 мл слой 0,5M сахарозы и центрифугировали при 76000g в течение 4 часов. Осажденные вирионы ресуспендировали в 0,5 мл LES (0,1M LiCl/5 мМ ЭДТА/1,0% SDS) и далее расщепляли добавлением 100 мкг протеазы K при 56°C для удаления всего белка. После 10 минут инкубирования vRNA экстрагировали несколько раз с помощью кислого фенола и смеси фенол/хлороформ, а затем осаждали в 70% об./об. этаноле. Осажденную vRNA сразу ресуспендировали в 50 мкл H ₂O или не содержащем РНКазы буфере TE (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0) и хранили при -80°C.

Конструирование полноразмерной вирусной кДНК. Синтез кДНК проводили с помощью набора для ОТ-ПЦР Enhanced Avian HS (Sigma, HSRT-100). Для амплификации четырех перекрывающихся фрагментов кДНК, охватывающих полный геном VR-2332 (фиг.2), использовали восемь ПЦР-праймеров (таблица 3). Условия цикла представляли собой 94°C в течение 2 минут, затем 35 циклов при 94°C в течение 15 секунд, 68°C в течение 4-5 секунд, а затем 68°C в течение 5 минут. Каждый ПЦР-фрагмент очищали с помощью набора QIAEX II Gel Extraction (Qiagen) и клонировали в вектор PCR®2.1-TOPO® с помощью набора TOPO TA Cloning® (Invitrogen K450001). Плазмиды, соответствующие каждому фрагменту, подвергали анализу нуклеотидной последовательности. Фрагменты с минимальным количеством нуклеотидных мутаций по сравнению с исходной последовательностью VR-2332 (регистрационный номер GenBank U87392) использовали для сборки полноразмерной кДНК, как представлено на фиг.2. В каждом перекрывающемся участке для присоединения фланкирующих фрагментов использовали уникальный сайт фермента рестрикции. Четыре расщепленных фрагмента, соответствующих полноразмерной геномной последовательности, определенным образом собирали поэтапно в модифицированный низкокопийный плазмидный вектор (pOK12HDV-PacI). Вектор модифицировали включением рибозима HDV посредством вставки фрагмента из 244 п.о. от SmaI до SacII, содержащего антигеномный рибозим HDV и терминирующую последовательность для РНК-полимеразы T7 из Transcription vector 2.0 (Johnson et al., J. Virol., 71:3323-3327 (1997); Pattnaik et al., Cell, 69:1011-1020 (1992)) в соответствующие участки pOK12 (Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)). Сайт для фермента рестрикции NcoI в этом фрагменте из 244 п.о. заменяли уникальным сайтом PacI посредством олигонуклеотидной мутации с помощью наборов праймеров 5'pOK12HDV-2157/3'pOK12HDV-257 и 5'pOK12HDV-257/полиA-модифицированный (таблица 3), с последующей ПЦР для слияния. В полноразмерных клонах кДНК вирусной геномной последовательности предшествовал промотор РНК-полимеразы T7, 1 или 2 остатка G и остаток T, а после нее следовал конец из полиадениловой кислоты из 50 нуклеотидов. Объединенные клоны размножали в штамме DH5 Eschericiacoli, а затем проводили подтверждение полной геномной нуклеотидной последовательности.

Таблица 3

Олигонуклеотидные праймеры, используемые в этом исследовании. Прямые праймеры указаны наклонной линией (/) после обозначения, обратные праймеры указаны с помощью предшествующей наклонной линии. Встроенные сайты ферментов рестрикции показаны подчеркнутым курсивом.

Модификация и анализ последовательности полноразмерных кДНК-клонов. Для модификации всех кДНК-клонов от pVR-V4 до pVR-V6G7475A использовали набор QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis (Stratagene). Плазмидные вставки с полной геномной кДНК затем подвергали анализу нуклеотидной последовательности в University of Minnesota Advanced Genetic Analysis Center (AGAC) с помощью праймеров с соответствующей последовательностью (таблица 3). Различия между последовательностями от pVR-V4 до pVR-V6G7475A, а также отличия от исходной последовательности VR-2332, от соответствующего ей аттенуированного вакцинного штамма, Inglevac MLV, и pVR-HN, первого инфекционного клона VR-2332, представлены в таблице 4 (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999); Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001); Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)).

Таблица 4

Нуклеотидные различия между штаммами PRRSV и инфекционными клонами VR-2332. Показаны только те положения, где выявлены нуклеотидные различия. Нуклеотиды, имеющиеся в штамме VR-2332, представлены в незакрашенных ячейках. В светлых закрашенных ячейках представлены нуклеотидные различия, которые уникальны для инфекционного клона, в умеренно закрашенных ячейках показаны те нуклеотиды, которые также выявлены в Ingelvac® MLV, и в закрашенных черным цветом ячейках представлены уникальные нуклеотиды для штамма из свиньи. Участки, которые не секвенировали, указаны наклонной линией.

* Отрицательные основания относятся к нуклеотидам, имеющимся в РНК после транскрипции и образованным промотором для РНК-полимеразы непосредственно выше инфекционного полинуклеотида. Эти образованные промотором нуклеотиды, как правило, уже не присутствуют в инфекционном полинуклеотиде после его 9-кратного пассирования.

Транскрипция in vitro. Проводили линеаризацию полноразмерного кДНК-клона расщеплением посредством PacI, который расщепляет ниже поли(A)-хвоста. Получали кэпированные [аналог кэпа m⁷G(5')ppp(5')G] транскрипты РНК с использованием набора mMESSAGE MACHINE^TM (Ambion) и оптимизировали соотношение 2:1 метилированного аналога кэпа к GTP. Из 2 мкг ДНК-матрицы получали приблизительно от 50 до 60 мкг РНК в 20-мкл реакционной смеси. Повышенное соотношение аналога кэпа и GTP значительно снизило выход РНК. Затем РНК очищали кислым фенолом-хлороформом с последующим осаждением изопропанолом и ресуспендировали в не содержащем нуклеазы буфере TE (pH 8,0). РНК качественно оценивали сравнением размера с вирусной РНК VR-2332 дикого типа в 1% денатурирующем агарозном геле с глиоксалем, и количественно определяли посредством спектрофотомерии при OD ₂₆₀.

Трансфекция клеток MARC-145. Разработали модифицированный способ трансфекции на основе описанного подхода (Nielsen et al., (J. Virol., 77:3702-3711 (2003)). Для трансфекции клетки MARC-145 высевали на шестилуночные планшеты (2-3×10 ⁵ клеток/лунка) в 3 мл полной среды [EMEM, дополненная 10% эмбриональной телячьей сывороткой (ЭТС)], а затем инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение 20-24 часов до приблизительно 80% смыкания монослоя (Collins et al., J. Vet. Diagn. Invest., 4:117-126 (1992)). 4 мкг транскрибированной in vitro РНК, разбавленной в 500 мкл среды со сниженным содержанием сыворотки Opti-MEM® I (Invitrogen) и 2 мкл бромида 1,2-димиристилоксипропил-3-диметилгидроксиэтиламмония и холестерина (DMRIE-C; Invitrogen), разбавленного в 1 мл среды Opti-MEM®, объединяли и перемешивали в течение короткого промежутка времени. Клетки MARC-145 промывали один раз 2 мл среды Opti-MEM®, а затем сразу покрывали раствором комплекса липид:РНК. DMRIE-C без РНК (2 мкл) использовали в качестве отрицательного контроля, и DMRIE-C с 10-100 нг очищенной вирусной РНК штамма (дикого типа) wt VR-2332 использовали в качестве положительного контроля. После 4 часов воздействия комплексов липид:РНК монослои промывали и добавляли свежую полную среду (EMEM с 10% ЭТС). Мониторинг супернатантов трансфицированных клеток на наличие признаков цитопатического эффекта (CPE) проводили каждые сутки и через 72-96 часов после трансфекции проводили пассирование в свежих MARC-145.

Детекция вирусной РНК потомков. Для детекции вирусной РНК потомков отбирали супернатант клеточной культуры трансфицированных и инфицированных клеток MARC-145. РНК выделяли с помощью набора QiaAmp viral RNA (Qiagen). Проводили ОТ-ПЦР с набором пар праймеров, специфичных для нуклеотидов штамма VR-2332, характерных для мутантных остатков инфекционного клона (таблица 3). Подтверждение потомков инфекционного клона проводили посредством проверки нуклеотидной последовательности специфичных для клона нуклеотидов, имеющихся в продуктах ОТ-ПЦР.

Детекция вирусного нуклеокапсидного белка потомков. Для детекции экспрессии вирусного белка в клетках MARC-145, нанесенных на покровные стекла, трансфицированных транскриптом РНК in vitro или инфицированных дочерним вирусом, использовали способы непрямого иммунофлуоресцентного анализа (IFA). Инфицированные клетки фиксировали в 3,7% параформальдегиде с фосфатно-солевым буфером (PBS), pH 7,5, при комнатной температуре в течение 10 минут. Фиксированные клетки промывали посредством PBS, инкубировали при 37°C в течение 45 минут со специфичным к нуклеокапсидному белку PRRSV моноклональным антителом SDOW17 (Magar et al., Can. J. Vet Res., 59:232-234 (1995)), а затем инкубировали с иммуноглобулином G козы против антител мыши (IgG), конъюгированным с флуоресцеинизотиоцианатом при 37°C в течение дополнительных 45 минут (разведение 1:100) (Sigma). Покровные стекла промывали посредством PBS, помещали на предметное стекло с использованием гелеобразного масла для прикрепления и исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа.

Анализ бляшкообразования вируса. Монослои клеток MARC-145 на шестилуночных планшетах инфицировали с помощью супернатанта клеток (в 10-кратных разведениях) от трансфицированных или инфицированных клеток MARC-145 инкубацией при комнатной температуре в течение 1 часа. Инфицированные монослои последовательно промывали один раз с помощью свежей EMEM/10% ЭТС, сразу покрывали 1% стерильной агарозой SeaPlaque (BioWhittaker Molecular Applications, Rockland, Maine) в смеси 1X MEM (Sigma M4144)/10% ЭТС/2% (масс./об.) NaHCO ₃/1X глутамин/1X не являющиеся необходимыми аминокислоты/10 мМ HEPES/2% (об./об.) гентамицин, и инкубировали при 37°C/5% CO₂ в перевернутом состоянии в течение 5 суток. После осторожного удаления агарозы клетки окрашивали 5% кристаллическим фиолетовым в 20% этаноле в течение 10-30 минут для визуализации размера бляшек.

Кривая роста вируса. Монослои MARC-145 в флаконах T-75 инокулировали либо исходным, либо рекомбинантным PRRSV, разбавленным бессывороточной EMEM со множественностью инфекции (MOI) 0,001. После прикрепления в течение 1 часа при комнатной температуре при осторожном перемешивании инокулят удаляли и монослои промывали три раза посредством бессывороточной EMEM. После промывания добавляли 4 мл полной среды, а затем флаконы инкубировали в течение вплоть до 5 суток при 37°C, 5% CO ₂. Отбирали аликвоты (0,5 мл) сразу после добавления среды (момент времени 0 часов) и через 24, 48, 72, 96 и 120 часов, и хранили при -80°C. Серийные разведения образцов использовали для инфицирования клеток MARC-145, а затем клетки обрабатывали, как описано выше. После удаления агарозы бляшки визуализировали и подсчитывали. Результаты на кривой роста выражали в качестве Б.О.Е./мл.

Инокуляция дочернего вируса in vivo. Десять свиней в возрасте 4-х недель смешанной породы и разного пола из PRRSV-серонегативного стада разделяли на три группы, каждая из которых состояла из двух животных. В первой группе вводили 50% инфекционную дозу для культуры тканей (TCID₅₀ ) 10^3,5 клонированного вируса (pVR-V5, третий пассаж на клетках MARC-145) на 1 мл, во второй группе вводили TCID ₅₀ 10^5,4 на 1 мл исходного вирусного штамма VR-2332 (четвертый пассаж на клетках MARC-145), и в третьей группе проводили имитирующую инокуляцию посредством EMEM. Всем животным вводили 2 мл инокулята посредством внутримышечной инъекции. Животных держали в отдельных комнатах во время эксперимента и исследовали каждые сутки на клинические признаки. На 28 сутки после инфекции всех свиней умерщвляли. Для выделения вируса каждый образец сыворотки разбавляли в 5 раз посредством неполной EMEM и помещали на свежие монослои MARC-145 на от 1 до 2 часов при комнатной температуре при осторожном перемешивании. Затем инокулят удаляли и добавляли полную EMEM. Инфицированные клетки инкубировали при 37°C, 5% CO₂, и исследовали каждые сутки. После выявления CPE супернатанты инфицированных клеток замораживали при -80°C до момента дальнейшей охарактеризации.

Нозерн-блот анализ. Транскрипты pVR-V6G7475A трансфицировали в клетки MA104, а затем пассировали в свежих клетках в течение нескольких пассажей. Для последующего нозерн-блот анализа супернатанты из пассажа 1 (P1), P3, P6, P8 и P10 разбавляли 1:50, а затем использовали для инфицирования клеток (1 мл/флакон T75) в тот же день. В то же время сыворотку инфицированных свиней разбавляли в 10 раз, а затем использовали (1 мл) для инфицирования отдельного флакона T75. Цитопатический эффект был выявлен на 3 сутки после инфицирования во всех флаконах. Внутриклеточную РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Midi (Qiagen) и проводили ее электрофорез (15 мкг/образец) на денатурирующем геле с глиоксалем, как описано ранее (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)). Транскрипт РНК pVR-V6G7475A (100 нг) использовали в качестве контроля. После переноса РНК на 0,45-микронную мембрану MagnaGraph Nylon Transfer (Osmonics) на мембрану наносили зонд в виде меченого олигонуклеотида/1a-p222, и метили посредством -³²P-ATP (Amersham) с использованием полинуклеотидкиназы (Promega), как описано ранее (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999)).

Анализ последовательности нуклеиновой кислоты дочернего вируса. 5'- и 3'-быструю амплификацию концов кДНК (RACE) проводили с помощью набора SMART^TM RACE cDNA Amplification (BD Bioscience), или 5' или 3'-Full Race Core Set (TaKaRa Bio Inc) для вирусной РНК, выделенной с помощью набора QIAmp®Viral RNA Mini (Qiagen). Остальную часть нуклеотидной последовательности определяли из продуктов ОТ-ПЦР с парами праймеров, разработанными для покрытия всего генома штамма VR-2332 (таблица 3), как описано ранее (Yuan et al., Virus Res., 79:189-200 (2001)). Проводили определение последовательности нуклеиновой кислоты в Advanced Genetic Analysis Center в University of Minnesota. Полную вирусную последовательность с по меньшей мере трехкратным перекрыванием первоначально собирали с помощью набора программ SeqMan программного обеспечения для анализа последовательностей Lasergene® (DNASTAR, Inc.), и далее анализировали с использованием программного обеспечения GCG Wisconsin Package Version 10.3 (Accelrys Inc.). Штамм VR-2332 (регистрационный номер GenBank U87392) штамм Ingelvac® MLV (регистрационный номер GenBank AF066183) и клон кДНК pVR-HN (регистрационный номер GenBank AY150564; Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)) использовали во всех сравнениях нуклеотидов с рекомбинантными вирусными штаммами.

Результаты

Модификация вектора pOK12. pOK12 (регистрационный номер GenBank AF223639; Vieira et al., Gene, 100:189-194 (1991)), низкокопийный вектор для клонирования, модифицировали расщеплением посредством SmaI (участок для фермента в районе 273 п.о. в pOK12) и SalI (участок в районе 307 п.о.) и встраиванием фрагмента SmaI-SalI из 244 п.о. Vector 2.0 (7), содержащего рибозим вируса гепатита дельта (HDV). Затем вектор (pOK12HDV) модифицировали мутагенезом имеющегося участка KpnI (участок pOK12HDV в районе 273 п.о.) встраиванием участка для фермента рестрикции PacI с использованием пары праймеров 5'-pOK12HDV-257SphIPacI/3'-pOK12HDV-257SphIPacI. Рибозим HDV добавляли для обеспечения эффективного расщепления точно на 3'-конце полиA-тракта. Исследования показали, что модификация не является необходимой для получения инфекционного дочернего вируса.

Конструирование полноразмерных кДНК-клонов. Стратегия клонирования представлена на фиг.2. Четыре перекрывающихся фрагмента генома амплифицировали из очищенной вирусной РНК VR-2332 посредством ОТ-ПЦР с использованием указанных пар праймеров (фиг.2, таблица 3). Каждый фрагмент по отдельности клонировали в вектор PCR®2.1-TOPO® для получения промежуточного клона PCR-SphI-FseI (сегмент I), pCR-FseI-AvrII (сегмент II), PCR-AvrII-BsrGI (сегмент III) и pCR-BsrGI-PacI (сегмент IV). Затем кДНК-клоны расщепляли посредством двух уникальных ферментов рестрикции, указанных в названии клона. Четыре фрагмента очищали от геля и последовательно лигировали с вектором pOK12HDV-PacI для получения полноразмерного клона кДНК PRRSV (pVR-V4). В полноразмерном клоне кДНК вирусная геномная последовательность начиналась промотором РНК-полимеразы T7, а после нее следовал хвост полиадениловой кислоты из 50 нуклеотидов. Транскрипты РНК клона pVR-V4 не проявляли типичной для PRRSV инфекционности, когда их трансфицировали в пермиссивные клетки, хотя вирусную РНК можно было выявить на протяжении нескольких пассажей. При сравнении со штаммом VR-2332, было выявлено всего 45 нуклеотидных мутаций (таблица 4), приводящих к 21 аминокислотной замене (таблица 5), хотя несколько мутаций были такими же, как и идентифицированные ранее в Ingelvac® MLV (Yuan et al., Virus Res., 61:87-98 (1999)).

Таблица 5

Аминокислотные различия между штаммами PRRSV и инфекционными клонами VR-2332. Показаны только те положения, в которых выявлены нуклеотидные различия, с положением соответствующей аминокислоты в установленной области генома. Аминокислоты, которые представлены в штамме VR-2332, показаны не закрашенными ячейками и аминокислоты инфекционных клонов, идентичные с VR-2332, представлены пустыми ячейками. Текст в каждой индивидуальной ячейке соответствует молчащей мутации или аминокислотным изменениям вследствие нуклеотидных различий, показанных в таблице 2. Светлые закрашенные ячейки соответствуют нуклеотидным различиям, которые являются уникальными для инфекционного клона, умеренно закрашенными ячейками выделены те нуклеотиды, которые также выявлены в Ingelvac® MLV, и закрашенными черным цветом ячейками показаны уникальные для свиньи нуклеотиды. Аминокислоты, разделенные наклонными линиями, указывают на номера аминокислот в ORF2a/ORF2b. Участки, которые не секвенировали, указаны наклонной линией.

Вследствие того, что многие мутации в pVR-V4 встречались в критической области, кодирующей предполагаемую хеликазу, полимеразу и другие мотивы Nidovirus (фиг.3, таблица 4), были получены дополнительные клоны геномного сегмента III (pCR-AvrII-BsrGI) и полностью отсеквенированы. После замены сегмента III pVR-V4 полученным фрагментом с наиболее правильной последовательностью авторы настоящего изобретения снова определяли нуклеотидную последовательность всего полноразмерного клона (pVR-V5). За исключением замененного участка и четырех спонтанных мутаций (нуклеотиды 1595, 13860, 14336 и 14404), эти два геномных клона были идентичными (таблица 4). Анализ последовательности pVR-V5 показал, что этот клон содержит всего 23 мутации по сравнению со штаммом VR-2332. Среди этих 23 замен только 8 нуклеотидных мутаций, кодирующих замены аминокислот, и пять мутаций аминокислотных остатков были идентичными с Ingelvac® MLV и, таким образом, для них не предсказано отрицательного эффекта на репликацию in vitro (таблица 4).

Клон pVR-V6 был получен посредством сайт-направленного мутагенеза сегмента генома IV для реверсии нуклеотидов 13860 и 14979 с использованием праймеров 13860C2T/ и 14979A2G/, соответственно. Мутация этих двух нуклеотидов должна была скорректировать аминокислотный остаток 25 GP5 (L F) и остаток 31 нуклеокапсидного белка (T A). Анализ последовательности клона pVR-V6 подтвердил, что нуклеотиды были скорректированы обратно до нуклеотидов VR-2332 дикого типа (wt) и это не привело к каким-либо другим нуклеотидным заменам в каком-либо участке генома по сравнению с pVR-V5 (таблицы 4 и 5). В заключение, проводили сайт-направленный мутагенез сегмента генома III с использованием олигомера 7475G2A, как в pVR-V5, так и в pVR-V6, в целях коррекции изменения по сравнению с VR-2332 wt в nt 7475. Замена G A в nt 7475 привела к замене глицина (G) в аминокислоте 2429 ORF1 в двух рекомбинантных клонах на глутаминовую кислоту (E), выявленную в исходном вирусном штамме VR-2332. Конечные два клона, pVR-V5G7475A и pVR-V6G7475A, снова полностью секвенировали и было выявлено, что они имеют только (nt 7475), измененный по сравнению с исходными рекомбинантными плазмидами pVR-V5 и pVR-V6, соответственно (таблица 5). Таким образом, pVR-V6G7475A содержит 11 нуклеотидных и не содержит аминокислотных замен по сравнению со штаммом VR-2332, помимо тех, которые также выявлены в Ingelvac® MLV.

Как представлено схематично на фиг.3 для конечной конструкции (pVR-V6G7475A) и подробно в таблицах 4 и 5 все полноразмерные клоны по-прежнему обладают нуклеотидными заменами, разбросанными по всему геному, главным образом, в мало определенных участках ORF1. Однако большая группа нуклеотидных замен ORF1b, которые предположительно предотвращают завершение репликации вируса pVR-V4, была репарирована в более поздних вариантах полноразмерных геномных клонов. Только одна нуклеотидная мутация (nt 11329, кодирующая мутацию G3739A) оставалась в ORF1b pVR-V5 и более поздних клонов, и эта мутация не предотвращала эффективного инфицирования и репликации Ingelvac MLV в культивируемых клетках. В таблицах 4 и 5 также представлена остальная информация для ранее опубликованного инфекционного клона pVR-HN (Nielsen et al., J. Virol., 77:3702-3711 (2003)), для которого показана репликация у животных. Существует значительное повышение количества остатков в pVR-HN (15 нуклеотидов), которые непосредственно соответствуют последовательности Ingelvac® MLV, по сравнению с конечной конструкцией pVR-V6G7475A (7 нуклеотидов).

Охарактеризация рекомбинантного вируса. Получали полноразмерные транскрипты РНК каждого кДНК-клона. Трансфекция клеток MARC-145 с помощью транскриптов кДНК или вирусной РНК (vRNA) wt VR-2332 привела к CPE, характеризующемуся агрегацией клеток с последующим лизисом, через от 48 до 72 часов после трансфекции. CPE, вызванные рекомбинантными транскриптами, были замедлены и иногда отличались от CPE, индуцированных vRNA wt VR-2332, в случае которого CPE представлен в виде интенсивной агрегации, открепления и разрушения. Через 96 часов после трансфекции большая часть клеток, трансфицированных посредством vRNA VR-2332, подверглась лизису и открепилась от планшета, в то время как в клетках, трансфицированных посредством клонированных, полученных in vitro транскрипитов РНК, был выявлен менее выраженный CPE.

Вирус (P0) собирали из трансфицированных клеток и аликвоту (10 мкл, разбавленную до 1 мл в культуральной среде) использовали для инфицирования клеток MARC-145 для амплификации дочернего вируса. После детекции CPE вирус (P1) снова собирали и аликвоту использовали для повторного инфицирования клеток MARC-145. Рекомбинантный вирус в клеточном супернатанте (P2) использовали для очистки вирусной РНК, которую затем использовали для получения фрагментов ОТ-ПЦР с парами праймеров 5'-6800/3'-ORF1b (nt 6796-7614) и P51/05P4 (nt 13757-14341). Полученные ПЦР-фрагменты подвергали анализу нуклеотидной последовательности для подтверждения того, что выявленная инфекционность была следствием трансфекции полноразмерных транскриптов РНК инфекционной конструкции и не была следствием загрязнения вирусом wt. В дочернем вирусе были выявлены нуклеотидные мутации в остатках с нуклеотидными различиями 7329, 7475, 7554 и 13860 по сравнению с pVR-V5, и в 7329, 7554 и 13860 были выявлены в вирусе по сравнению с pVR-V5G7475A. Аналогично мутации в остатках 7329, 7475 и 7554 были выявлены в потомке pVR-V6 и мутации в 7329 и 7554 были выявлены в вирусе, образованном из pVR-V6G7475A (таблицы 4 и 5). Соответствующие мутации не были выявлены в вирусе P2 после трансфекций vRNA wt.

Иммунофлуоресцентный анализ рекомбинантных вирусов. Для детекции экспрессии нуклеокапсидного белка PRRSV в инфицированных клетках MARC-145 использовали способы прямого иммунофлуоресцентного анализа. Все клетки, инфицированные транскриптами рекомбинантного вируса (P2 и далее), а также vRNA были положительными в этом способе. Отчетливо выявлялось массивное нуклеолярное скопление нуклеокапсидного белка, как описано ранее Rowland et al. (Virus Res., 64:1-12 (1999)).

Инфицирование образованным из pVR-V5 рекомбинантным вирусом in vivo. Рекомбинантные вирусы, выделенные из P3 клеток MARC-145, трансфицированных транскриптами РНК кДНК-клона pVR-V5, инокулировали молодой свинье, и параллельно инокулировали wt VR-2332, вакцинный вирус Ingelvac® MLV и физиологический раствор (отрицательный контроль). Забор образцов крови проводили на 0, 3, 5, 7, 14, 21 и 28 сутки после инфицирования и анализировали на сероконверсию с помощью HerdChek PRRS 2XR ELISA (IDEXX) и на выделение вируса. К 28 суткам у всех инфицированных животных произошла сероконверсия приблизительно с одинаковой кинетикой, указывая на то, что рекомбинантные вирусы pVR-V5 хорошо реплицируются in vivo (фиг.4). Клинические признаки отсутствовали у всех животных в ходе эксперимента, однако это не было неожиданным, поскольку штамм VR-2332 wt часто не приводит к выраженному заболеванию у молодых свиней и приводит только к временному увеличению лимфатических узлов, как правило, на 14 сутки после инфицирования.

Образец сыворотки одного животного, инфицированного дочерним вирусом pVR-V5 (Sw612), забранный на 14 сутки после инфицирования, использовали для инфицирования свежих монослоев MARC-145 для выделения пассированного in vivo рекомбинантного вируса. Как описано ранее, вирус, образованный в результате трансфекции in vitro РНК-транскриптов клона pVR-V5, приводил только к минимальным CPE (подтвержденным агрегацией инфицированных клеток), в то время как вирус, выделенный из сыворотки тестируемого животного, забранной на 14 сутки, вызывал типичные CPE (клеточная агрегация, открепление и разрушение) через 96 часов после инфицирования. Это подтверждает, что произошло изменение генотипа или фенотипа вируса в ходе репликации pVR-V5 in vivo.

В целях выяснения причины выявленного изменения фенотипа проводили анализ полной геномной последовательности вируса, выделенного из одной свиньи (Sw612), а затем пассированного один раз в клетках MARC-145 для амплификации потомка Sw612 (фиг.3, таблицы 4 и 5). При сравнении с вирусом, используемым для инфицирования свиньи, pVR-V5, в Sw612 сохранилось 17 инфекционных специфичных для кДНК-клона нуклеотидных изменений, некоторые из которых также выявлены в Ingelvac® MLV (7/17 нуклеотидов). Два невирусных остатка G, за которыми следует остаток T, представленные на 5'-конце исходного транскрипта клона pVR-V5, не были выявлены в вирусе, образованном при инфицировании in vivo. Была выявлена вырожденность в нуклеотидных положениях 9958 (R), 14336 (Y) и 15411 (Y). Подобный VR2332 wt нуклеотид (G) в положении 9958 показал вырожденность с подобным Ingelvac® MLV нуклеотидом (A). Это изменение привело к мутации остатка глицина в остаток глутаминовой кислоты, соответственно (таблица 2). В положении 14336 вырожденность была выявлена в качестве специфичного для инфекционного клона основания (C) и специфичного для wt VR-2332 основания (T), которая отражала молчащую мутацию. Произошла другая мутация (nt 7475), при которой произошла реверсия остатка G в остаток wt A. Однако существовало 5 других нуклеотидных различий (nt 102, 827, 1379, 14686 и 15411), не выявленных в каком-либо другом вирусе в этом исследовании. Нуклеотид 102 расположен в лидерной последовательности, предположительно не транслируемой. Однако если лидерная последовательность транслировалась, кодируемая ORF (нуклеотиды 1-100 VR-2332) должна была бы удлиниться на один аминокислотный остаток (W). Мутации в остатках 827 и 1379 привели к мутациями в ORF1a, и в обоих случаях привели к аминокислотным заменам кодируемого VR-2332 wt аланина на валин Sw612. Произошла мутация остатка гуанина в nt 7475 pVR-V5 в аденин wt. Это привело к неконсервативной аминокислотной мутации G3294A, расположенной в предсказанном продукте расщепления протеазы NSP7 в ORF1a, и функция этой геномной области к настоящему времени не определена. В нуклеотиде 14686, расположенном в ORF6, показана замена гуанина VR-2332 wt на аланин в Sw612, которая, тем не менее, кодирует аминокислоту глицин. Другая уникальная нуклеотидная замена произошла на самом конце 3'-конца последовательности вируса (nt 15411), до начала полиA-хвоста. В этом случае ранее консервативный остаток тимина показал вырожденность с остатком цитозина. Эти генетические замены, несмотря на информативность, не показали непосредственной причины(причин) изменения выявленного изменения фенотипа роста. Однако они показали ошибочный характер репликации PRRSV in vivo и подтвердили, что незначительно отличающаяся от VR-2332 wt последовательность генома вируса способна эффективно реплицироваться (фиг.3).

Сравнение размеров вирусных бляшек. Определение размера бляшек рекомбинантных вирусов, а также VR-2332 wt проводили параллельно в клетках MARC-145 через 120 часов после инфицирования (фиг.5A). Штамм VR-2332 образовывал бляшки, которые обладали средним размером 3 мм, в то время как потомок 3 пассажа кДНК-клона pVR-HN образовывал бляшки немного меньших размеров (в среднем, 2,5 мм). В противоположность этому, рекомбинантные вирусы, образованные из pVR-V5 и pVR-V6, образовывали только точечные бляшки, и они отчетливо выявлялись только с помощью микроскопического исследования (фиг.5A). Рекомбинантный вирус, выделенный из клонов pVR-V5G7475A и pVR-V6G7475A, образовывал, в среднем, бляшки размером 1,5 мм и 2 мм, соответственно. Однако в другом анализе бляшки, продуцируемые дочерним вирусом (Sw612), выделенным после инфицирования in vivo образованным из VR-FLV5 рекомбинантным вирусом, были значительно более крупными и были приблизительно равными как по размеру, так и по количеству, бляшкам, образованным VR2332 wt (фиг.5B).

Оставались только минимальные объемы супернатантов клеток, содержащих каждый рекомбинантный вирус. Таким образом, в целях полного исследования роли нуклеотидных замен в установлении размера бляшек авторы настоящего изобретения трансфицировали свежими транскриптами РНК, продуцированными pVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A и pVR-V6G7475A, клетки MARC-145 (называемые второй линией происхождения). Дочерние вирусы 3 пассажа каждого инфекционного клона через 5 суток после инфицирования снова анализировали на размер бляшек по сравнению с вирусами wt VR-2332, VR-HN и Sw612. В противоположность предшествующему анализу бляшкообразования размеры всех бляшек были сходными, где рекомбинантные вирусы, полученные из pVR-V5, pVR-V6, pVR-V5G7475A, обладали только немного меньшими размерами бляшек, чем образованные in vivo вирусы wt VR-2332, Sw612 и pVR-V6G7475A (фиг.6A). Однако рекомбинантные вирусы еще не имитировали непосредственно подлинную вирусную инфекцию, как показано приблизительно в 10 раз более низкими титрами по сравнению с wt VR-2332 или рекомбинантным вирусом pVR-V5, который пассировали в свинье (Sw612) (фиг.6B).

Анализ нуклеотидной последовательности препаратов вирусов первой и второй линии происхождения. Проводили ограниченный анализ нуклеотидной последовательности (вследствие ограничения материала вируса) 3 пассажа образованного из pVR-V5 вируса, инокулированного свинье (V5-1-P3), и анализ полной нуклеотидной последовательности 3 пассажа образованного из pVR-V5 вируса, полученного ранее (V5-2-P3), в целях генетического обоснования различий размеров бляшек. Такие анализы показали, что два независимо полученных вируса V5 отличались последовательностью 5'-конца (таблица 4). Вирус, который образовывал точечные бляшки (V5-1-P3) не обладал внешними 5'-концевыми нуклеотидами, как показано в нуклеотидной последовательности штамма VR-2332 wt, в то время как вирус, образующий бляшки более крупных размеров (V5-2-P3), обладал 4 нематричными остатками тимидина на 5'-конце (таблица 4). Авторы могли получить остальную часть нуклеотидной последовательности вируса V5-1-P3, полностью совпадающую с последовательностью вируса V5-2-P3, а также с последовательностью исходного клона. Однако анализ полной последовательности вируса V5-2-P3 показал, что вирус обладает вырожденностью нуклеотидов в нескольких областях генома. Сходные данные были получены при анализе ограниченных областей вирусов второй линии происхождения VR-FLV5G7475A-P3 и VR-FLV6G7475A-P3. Эти два последних дочерних инфекционных клона обладали разными 5'-концами, а также проявляли вырожденность последовательности.

Кривые роста вируса. Одновременное одностадийное получение кривых роста вируса проводили с использованием клеток MARC-145 и вирусов 3 пассажа (вторая линия происхождения) (фиг.7). Рекомбинантные вирусы, выделенные из pVR-V5, pVR-V5G7475A, pVR-V6 и pVR-V6G7475A и pVR-HN, обладали сходными одностадийными скоростями роста вируса, однако все пики их репликации были значительно ниже, чем у штамма VR-2332 wt и Sw612, потомка pVR-V5 in vivo. Кроме того, скорости репликации препаратов рекомбинантного вируса, образованного из pVR-V5, pVR-V6 и pVR-HN, были в некоторой степени ниже по сравнению с вирусом, образованным из pVR-V5G7475A и pVR-V6G7475A. Последние два инфекционных клона кодируют только 13 и 11 нуклеотидными отличиями, соответственно, приводящими к 2 и нулю аминокислотных изменений относительно последовательности wt VR-2332, помимо изменений, выявленных в Ingelvac® MLV. Затем эти данные показали, что вирусы только с 11 нуклеотидными изменениями по сравнению с wt VR-2332 и их аттенуированное потомство Ingelvac® MLV обладают в некоторой степени нарушенной репликацией. Соответственно, полученные титры вирусов wt VR-2332 и Sw612 приблизительно в 6-15 раз превышали титры рекомбинантных вирусов, которые не пассировали в свинье (фиг.7).

Нозерн-анализ vRNA. Было показано, что дефектные образцы sgRNA PRRSV, идентифицированные ранее как гетероклитные субгеномные РНК (латин.: редкие формы), являются составными частями инфекции PRRSV и их нельзя отделить от полноразмерных вирусных геномов стандартными способами, такими как пассирование в культивируемых клетках при низкой множественности инфекции или центрифугирование с градиентом сахарозы (Yuan et al., Virology, 275:158-169; 30 (2000); Yuan et al., Virus Res., 105:75-87 (2004)). Для изучения наличия продукции гетероклитов PRRSV в ходе транскрипции in vitro полноразмерного генома кДНК-клонов или их появления после последующей трансфекции/инфекции проводили нозерн-блот анализ. Полноразмерный РНК-транскрипт и вирус 1, 3, 6, 8 и 10 пассажей, полученный из транфицированных клеток MA-104, использовали для инокуляции свежих клеток MA-104 во флаконах T-75 с 10 мкл супернатанта, разбавленного 1:100, а также сыворотки Sw612, разбавленной 1:10 (всего 2 мл/флакон). Через 4 суток собирали РНК внутриклеточного PRRSV и 15 мкг каждого препарата разделяли электрофорезом в денатурирующем агарозном геле и переносили на нейлоновую мембрану. После поперечного сшивания РНК мембрану гибридизовали с помощью меченного радиоактивным ³²P зондом, комплементарным 5'-концу ORF1a, который является селективным для полноразмерных геномов VR-2332, а также гетероклитов (/1a-222; 29). Как показано на фиг.8, РНК-транскрипт, главным образом, представляет собой одну полосу, мигрирующую в качестве полноразмерной vRNA, в то время как образцы РНК PRRSV из 1 пассажа и далее мигрируют в качестве как полноразмерных образцов, так и образцов субгеномного размера, ранее идентифицированных в качестве гетероклитов. Кроме того, сила гибридизации повышается при пассировании. Поскольку вирус собирали из равных объемов супернатантов клеток в один и тот же момент времени, это наблюдение подтверждает, что репликация vRNA становится более эффективной с течением времени. В заключение, при сравнении вируса, образованного из Sw612, с вирусом, образованным в клеточной культуре, характер полос РНК не отличается, убедительно подтверждая, что образцы дефектной РНК легко образуются и реплицируются in vitro, а также in vivo, и, таким образом, являются естественной частью инфекции PRRSV.

Обсуждение

Теоретически, инфекционный кДНК-клон вируса должен быть идентичным исходной последовательности в целях получения восстановленной генетической системы, которая имитирует инфекцию дикого типа. Были предприняты значительные усилия для воспроизведения точного генома штамма VR-2332 PRRSV, но вследствие не поддающихся прогнозированию спонтанных мутаций в нескольких участках авторы настоящего изобретения не достигли успеха в получении инфекционного клона, не имеющего отличий от штамма VR-2332 wt, отсеквенированного в лаборатории авторов настоящего изобретения. Для снижения искусственных мутаций являются доступными ДНК-полимеразы с высокой точностью, используемые в этом исследовании, однако такой мутации нельзя избежать в ходе обратной транскрипции (Malet et al., J. Virol. Methods, 109:161-70 (2003)). Кроме того, тот факт, что PRRSV проявляет удивительную изменчивость вируса и варьирование штаммов (Chang et al., J. Virol., 76:4750-6 (2002); Murtaugh et al., Adv. Exp. Med. Biol., 440:787-94 (1998); Yoon et al., Adv. Exp. Med. Biol., 494:25-30 (2001)), легко рекомбинирует с высокой частотой, приводя к межгенным продуктам рекомбинации штаммов (Yuan et al., Virus Res., 61:87-98 (1999)), подвергается внутригенной рекомбинации с образованием субгеномных РНК PRRSV и гетероклитов (Nelsen et al., J. Virol., 73:270-80 (1999); Yuan et al., Virology, 275:158-169 (2000); Yuan et al., Virus Research, 105:75-87 (2004)) и часто проявляет вырожденность нуклеотидов в непредсказуемых участках нуклеотидов в изолятах, приводит к тому, что эта цель является очень трудоемкой и приводит к незначительным результатам. Полагали, что конструкция инфекционной ДНК, обладающая только 11 нуклеотидными мутациями по сравнению со штаммом VR-2332, вне доменов, о которых известно, что они вовлечены в репликацию вируса (5'- и 3'-концы, ORF1b), является достаточной для продукции вируса wt и последующих целей применения инфекционного клона в исследованиях вопросов патогенеза и структуры:функции. pVR-HN является более сходным с Ingelvac® MLV в области вируса, кодирующей мотив хеликазы (NSP 10). Дальнейшее патогенетическое сравнение этих двух инфекционных клонов может объяснить различия между исходным штаммом, VR-2332, и его дочерним вакцинным штаммом, Ingelvac® MLV.

Ценная информация может быть получена из конструирования и оценки инфекционных клонов штамма VR-2332 PRRSV. Во-первых, штамм PRRSV VR-2332 не может быть толерантным ко всем мутациям с точки зрения выживаемости. Конкретные нуклеотидные или аминокислотные мутации могут способствовать или препятствовать репликации вируса, и задача состоит в определении того, какие из них являются летальными для выживания. В клоне pVR-V4, который не продуцирует инфекционных вирионов, было всего сорок два нуклеотидных отличия от исходного штамма дикого типа VR-2332. В этих сорока двух нуклеотидных изменениях несколько нуклеотидов привели к молчащим мутациям (20 остатков) или существуют в других известных штаммах PRRSV (мутации 9 аминокислотных остатков непосредственно имитируют Ingelvac® MLV), позволяя предсказать, что эти изменения могут быть нелетальными для репликации вируса. Таким образом, было предсказано, что одиннадцать нуклеотидных изменений, ведущих к 12 аминокислотным заменам и двум нуклеотидным мутациями 3-'UTR, каждая из которых не выявлена в Ingelvac® MLV, являются летальными для штамма VR-2332 PRRSV. В pVR-V5 и более поздних конструкциях, 19 изменений было скорректировано, включая несколько молчащих мутаций и 9 аберрантных аминокислотных замен, не выявленных в геноме Ingelvac® MLV, и 8 других изменений, выявленных в вакцинном штамме. Это стало первым доказательством того, что конструкции были инфекционными, хотя в pVR-V5 все еще были представлены две аминокислотные мутации, одна из которых была изменена посредством сайт-направленного мутагенеза для получения pVR-V6. Была проведена репарация оставшейся замены аминокислоты в pVR-V5G7475A и pVR-V6G7475A, хотя эти клоны все еще обладают молчащими мутациями, которые не выявлены в штамме VR-2332 и образованном вакцинном штамме.

В этом исследовании было сделано несколько уникальных наблюдений. Во-первых, каждая линия продуцированного вируса может приводить к уникальной 5'-концевой последовательности, которая не была выявлена в штамме wt VR-2332. Также авторы настоящего изобретения не могут еще провести корреляцию размера бляшек с нуклеотидной последовательностью. Во-вторых, авторы настоящего изобретения выявили уникальные нуклеотидные замены после репликации в свинье, которые могут отражать специфический характер полимеразы PRRSV. Все нуклеотидные замены обладали временным характером и не проявляли систематичности (5 A/G и 4 C/T). Несмотря на то, что реверсия G A в нуклеотиде 7475 была выявлена после пассирования in vivo, авторы настоящего изобретения не смогли выявить корреляции этого участка с последующим увеличенным размером бляшек, поскольку произошли другие нематричные изменения. Кроме того, анализы полной геномной последовательности 3 пассажа образованного из V5 вируса, который образовывал более крупные бляшки (V5-2-P3), показал 5'-концевую последовательность, отличную от образующего точечные бляшки вируса V5, используемого для инфицирования свиньи (V5-1-P3). Однако авторы настоящего изобретения могут сделать вывод, что мутации не были фатальными для репликации вируса, поскольку этот вирус после пассирования в свинье образовывал бляшки с размером бляшек wt на клетках MARC-145 и рос практически с той же скоростью, что и исходный вирус (фиг.5A, 6 и 7).

Значительный интерес представляет тот факт, что оказалось, что анализ последовательности третьего пассажа in vitro V5, V5G7475A и V6G7475A подтвердил, что комплекс репликазы PRRSV допускает возникновение частых трансзиций и нечастых трансверсий, при репликации вируса. Это может свидетельствовать о вирусной репликазе, которая эволиционировала таким образом, чтобы иметь возможность создавать новые генетические формы генома PRRSV, а затем оценивать их устойчивость среди других вариантов, с образованием в результате оптимально "приспособленного" вируса. Эти наблюдения также были сделаны в ходе последовательного пассирования PRRSV in vivo (Chang et al., J. Virol., 76:4750-63 (2002)). Данные попытки секвенирования были предприняты для исследования полноразмерных геномов более поздних пассажей, когда выявляется более активная репликация. В заключение, в настоящее время очевидно, что репликаза штамма VR-2332 PRRSV легко синтезирует гетероклиты в то время, когда она продуцирует полноразмерную vRNA. Этот прототипный штамм, выделенный и охарактеризованный в 1992 году, может быть уникальным в постепенном приобретении приспособленности репликации, поскольку другие исследователи, получившие инфекционные клоны более позднего штамма, не выявили того же эффекта (Truong et al., Virology, 325:308-319 (2004)). Роль образования гетероклитов и сопутствующего появления выраженной репликации вируса подтверждает, что существует благоприятная роль гетероклитов в эволюции PRRSV.

Пример 2

Недавно в штате Миннесота, США, было идентифицировано множество вирулентных изолятов предположительно нового PRRSV. Анализ нуклеотидной последовательности ORF5 и сравнение с базой данных PRRSV (>5000 изолятов) University of Minnesota Veterinary Diagnostic Laboratory показали, что изоляты относились к линии происхождения 2 типа, однако они значительно отличались от предшествующих изолятов. Более того, они были наиболее близко родственными изолятам, ранее выявленным в Канаде в начале 1990-х годов (Mardassi et al., J. Gen. Virol., 75:681-685 (1994)) и в штате Миннесота в 1998 году. Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) ORF5 также показал, что они относятся к той же группе вирусов, что и эти ранние случаи, известные в качестве изолятов 1-8-4 (Wesley et al., J Vet. Diagn. Invest.,10:140-144 (1998)) и, таким образом, их назвали изолятами MN184. Вследствие удивительного отличия от всех ранее выделенных изолятов MN PRRSV, кроме одного, два из этих новых изолятов амплифицировали только один раз в альвеолярных макрофагах свиньи (PAM), клетках-хозяевах, и проводили полный геномный анализ вирусов, обозначенных как MN184A и MN184B. Забор образцов этих двух изолятов проводили в различное время с двух отдельных ферм.

Материалы и способы

Для секвенирования изолятов MN184 вирусную РНК (vRNA) экстрагировали из супернатанта инфицированных PRRSV клеток с помощью набора QIAmp® Viral RNA Mini (Qiagen, Valencia, CA)) и проводили ОТ-ПЦР (набор Qiagen® OneStep RT-PCR). Были разработаны праймеры (доступные по запросу) на основе опубликованных последовательностей различных штаммов PRRSV, депонированных в GenBank, а также новой полученной последовательности MN184. 5'-нуклеотидную последовательность двух изолятов PRRSV получали с использованием набора 5'-Full RACE Core (TaKaRa Bio, Madison, WI). 3'-RACE проводили с помощью набора для амплификации кДНК SMART^TM RACE (Clontech, Mountain View, CA). Продукты ОТ-ПЦР очищали от геля (QIAquick®, Qiagen), клонировали в вектор pGEM-T (Promega, Madison, WI) и выбирали от 3 до 5 клонов каждого продукта ОТ-ПЦР для секвенирования. Определение нуклеотидной последовательности проводили в обоих направлениях с помощью специфичных ПЦР-праймеров или праймеров для кодируемого вектором SP6 и промотора T7. Продукты подвергали определению последовательности в Advanced Genetic Analysis Center at the University of Minnesota с помощью автоматического устройства для анализа фрагментов ДНК ABI 377. Получали последовательность, качественно соответствующую по меньшей мере трехкратному перекрытию генома. Данные о последовательностях объединяли и анализировали с использованием программы для анализа последовательностей GeneTool (BioTools Inc., Edmonton, Alberta CA) и Lasergene (DNASTAR, Madison, Wis.).

Проводили множественное выравнивание последовательностей с помощью CLUSTALX (Thompson et al., Nucleic Acids Res., 24:4876-4882 (1997)) или Wisconsin Package Version 10.3 (Accelrys Inc., San Diego, CA). Полноразмерные последовательности PRRSV выравнивали с использованием ClustalX (версии 1.83.1; весовая матрица для ДНК IUB, штраф за делецию 15,00, штраф за продолжение делеции 6,66). Полученные данные выравнивания далее анализировали с использованием программы Wisconsin Package Version 10.3 Distances (дистанционный способ Jukes-Cantor, рассматривали частичные совпадения вследствие вырожденности символов). В случае фиг.10, последовательности выравнивали с помощью программы Pileup программного обеспечения Wisconsin Package (оценочная матрица Blosum62, штраф за делецию = 8, штраф за продолжение делеции = 2, оцениваемые концы). Данные выравнивания оценивали на избыточность и окрашивали в соответствии с процентной идентичностью с использованием Jalview (Clamp et al., Bioinformatics, 12:426-427 (2004)), а затем переносили в Adobe® Photoshop® CS, версии 8.0, для трансформации полутонов. В случае фиг.11, последовательности выравнивали с помощью программы Pileup программного обеспечения Wisconsin Package (оценочная матрица Blosum62, штраф за делецию = 8, штраф за продолжение делеции = 2, оцениваемые концы). В случае фиг.12, сигнальный пептид был предсказан с использованием сервера SignalP (Bendtsen et al., J. Mol. Biol., 340:783-795 (2004)). Трансмембранные участки были получены с помощью PHDhtm (Rost et al., Protein Sci., 5:1704-1718 (1996)) и потенциальные участки N-гликозилирования были идентифицированы с помощью PROSITE (Bairoch et al., Nucleic Acids Res., 25:217-221 (1997)) с использованием сервера PredictProtein (Rost et al., Nucleic Acids Res., 32:W321-W326 (2003)). Последовательности выравнивали с помощью программы Pileup программного обеспечения Wisconsin Package (оценочная матрица Blosum62, штраф за делецию = 8, штраф за продолжение делеции = 2, оцениваемые концы).

Результаты

Выравнивание генома показало, что эти два PRRSV совершено отличались (отличие нуклеотидов >14,5%) от других полноразмерных секвенированных североамериканских геномов 2 типа, и в то же время сравнение с полноразмерными последовательностями 1 типа (европейскими) подтвердило, что источником изолятов был только генотип 2 типа, поскольку они были приблизительно только на 59% сходными на нуклеотидном уровне как со штаммом EuroPRRSV, так и со штаммом Lelystad. Удивительно, что эти изоляты MN184 2 типа соответствуют наиболее коротким геномам PRRSV, выявленным на сегодняшний день (15019 нуклеотидов, не включая поли-A-хвоста). Кроме того, не было обнаружено специфичной области, что позволяет предположить, что эти изоляты образованы вследствие рекомбинации штаммов вирусов 1 типа и 2 типа.

Анализ полноразмерной последовательности показал, что два изолята MN184 в действительности генетически различались. Они обладали 98,0% нуклеотидным сходством или 2% отличием. Это процентное отличие было неожиданным вследствие их неожиданного одновременного появления в Миннесоте, без явного современного сходного изолята, выявленного в базе данных PRRSV авторов настоящего изобретения к тому времени. В таблице 6 представлено подробное сравнение нуклеотидов и аминокислот двух изолятов и на фиг.9 изображены аминокислотные различия, выявленные между этими двумя штаммами. Оба этих изолята обладали нуклеотидной вырожденностью в нескольких участках генома, главным образом, в предсказанном nsp2-участке ORF1 (таблица 6). Тот факт, что в этих изолятах была выявлена нуклеотидная вырожденность, подтвердил, что PRRSV может быть образован несколькими отдельными видами, часто обозначаемыми как серия родственных, но отличающихся вирусных последовательностей, в инфицированных животных.

Таблица 6

Подробный анализ отдельных геномных участков PRRSV и транслируемых белков, и количества вырожденных оснований, выявленных в каждом участке. Вырожденность определяют, если для конкретного основания на отдельных файлах с записью из трех или более файлов с записью выявлено более одного нуклеотида.

В целях более точного определения отдельных участков тех изолятов MN184, в которых было показано наибольшее отличие от других штаммов PRRSV, и для установления участка(ов), являющегося причиной различий в длинах генома вируса 2 типа, эти два изолята сравнивали с последовательностью прототипного штамма VR-2332 2 типа. Снова можно было выявить различие между двумя изолятами, где изолят MN184B обладал немного большим сходством со штаммом VR-2332, чем изолят MN184A. Нуклеотидные и аминокислотные сравнения с VR-2332 показали, что отдельные участки изолятов MN184 варьировали от 81,5-94,7% и 78,4-100%, соответственно, однако участки, соответствующие ORF5 (86,4-86,7% и 87,0-87,5%, соответственно), предсказанному nsp1 (83,8-84,0% и 84,8-85,4%, соответственно), и nsp2 (81,5-85,5% и 78,4-79,5%, соответственно) были наиболее вариабельными. Наибольший интерес представляет то, что только для предсказанного геномного участка nsp2 были показаны различия в длинах нуклеотидов и что оба изолята MN184 обладали одной делецией nsp2, описанной подробно ниже. Сравнение также показало, что 5'- и 3'-UTR' представляли собой наиболее консервативные участки генома (94,7% и 94,0%, соответственно), указывая на консервативность последовательностей в участках, важных для репликации и транскрипции вируса.

ORF5 кодирует гетерогенный структурный белок (GP5) PRRSV и его часто используют для диагностической идентификации PRRSV (Kapur et al., J. Gen. Virol., 77:1271-1276 (1996)). GP5 представляет собой предсказанный белок с тремя трансмембранными участками и с эндодоменом и эктодоменом. Эктодомен из 30 аминокислот состоит из короткого высококонсервативного домена, главным образом, содержащего по меньшей мере два участка N-гликозилирования, связанных двумя гипервариабельными участками. Было показано, что высококонсервативный домен этого участка из 30 аминокислот кодирует эпитоп прикрепления вируса в штаммах 2 типа (Plagemann, Virology, 290:11-20 (2001); Ostrowski et al., J. Virol., 76:4241-4250 (2002); Plagemann et al., Arch. Virol., 147:2327-2347 (2002)). Проводили выравнивание GP5 того же набора полноразмерных геномов, а также исходных изолятов RFLP184, идентифицированных в Канаде (IAF-93-653, IAF-Klop) и в 1998-1999 годах в Миннесоте (98-3298, 98-3403, 99-3584) (фиг.10). Выравнивание GP5 PRRSV показало аминокислотную идентичность, варьирующую от 82,5% до 87,7% между новыми изолятами MN184 и другими штаммами, не относящимися к штаммам RFLP184 2 типа. Интересно, что аминокислотные различия между новыми изолятами MN184 и более ранними изолятами RFLP184 были очень выраженными (5,7%-12,2%) и, таким образом, авторы настоящего изобретения не выявили определенного источника нового вируса RFLP184. Ограниченное выравнивание показало, что большая часть выявленных аминокислотных различий находится в гипервариабельных участках (фиг.10). В изолятах MN184 были сохранены два консервативных участка N-гликозилирования за исключением выявленной вырожденности нуклеотидов, кодирующих аминокислоту 44 в изоляте MN184B.

Nsp1 кодирует папаин-подобную цистеиновую протеазу (den Boon et al., J. Virol., 69:4500-4505 (1995)). Проводили выравнивание аминокислот изолятов MN184 с не дублирующимся набором доступных последовательностей nsp1 2 типа, а также штаммов 1 типа EuroPRRSV и Lelystad (фиг.11). Белок nsp1 обладает рядом полностью консервативных аминокислот, и предполагаемые каталитические остатки были сохранены во всех отсеквенированных геномах (den Boon et al., J. Virol., 69:4500-4505 (1995)). Выравнивание, определяющееся аминокислотным сходством, указывает на то, что изоляты MN184 являются более сходными со штаммами 1 типа, чем другие отсеквенированные полноразмерные последовательности 2 типа. В частности, пять аминокислот (заключенных в прямоугольники на фиг.11) непосредственно имитируют штаммы 1 типа. Однако аминокислоты, которые были консервативными в других не дублирующихся последовательностях 2 типа, также были наиболее консервативными в изолятах MN184, но разбросанные аминокислоты и аминокислотное сходство (84,8-85,4%) показали более дивергентный белок 2 типа по сравнению с теми, которые были выявлены к настоящему времени. Таким образом, выравнивание далее определяет сохраненные остатки nsp1 , которые могут быть критическими для цикла репликации PRRSV.

Выравнивание аминокислот не дублирующихся последовательностей nsp2, определяемое попарной идентичностью, представлено на фиг.12. На N-конце находится высококонсервативный домен химотрипсин-подобной цистеиновой протеазы (PL2), ранее предсказанный выравниванием с nsp2 вируса артрита лошадей (EAV) (Snijder et al., J. Gen. Virol., 79:961-979 (1998); Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)). Существует 3-4 предсказанных трансмембранных домена вблизи C- конца этого белка (McGuffin et al., Bioinformatics, 16:404-405 (2000)), однако точный C-концевой участок расщепления не был эмпирически определен. Было сделано два предсказания относительно C-концевого участка расщепления, один G|G в аминокислоте 980 nsp2 VR-2332 (Allende et al., J Gen. Virol., 80:307-315 (1999)) и другой в аминокислоте 1197 (Ziebuhr et al., J. Gen. Virol., 81:853-879 (2000)), однако в этом белке существует несколько полностью консервативных дублетов G|G (аминокислоты 646, 980, 1116, 1196, 1197 nsp2 VR-2332; направленные вниз стрелки на фиг.12). Также в более ранней работе было показано, что предсказанный белок nsp2 богат пролином и содержит множественные потенциальные эпитопы для B-клеток (Oleksiewicz et al., J. Virol., 75:3277-3290 (2001); Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004); Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Большой участок в середине nsp2 PRRSV (аминокислоты 148-880 nsp2 VR-2332) не обладает установленной функцией, однако он является высоковариабельным по длине. Более того, различия в длинах отсеквенированных штаммов 1 типа и 2 типа PRRSV были картированы в этом вариабельном участке в середине nsp2 (фиг.12). До настоящего времени, было показано, что отсексенированные геномы 1 типа на 313-364 оснований короче большинства PRRSV 2 типа (Meulenberg et al., Virology, 192:62-72 (1993); Fang et al., Virus Res., 100:229-235 (2004), Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Однако множественное выравнивание последовательностей показало, что геном MN184 содержит к настоящему времени наиболее короткий предсказанный nsp2 (2547 п.о.), который на 393 п.о. короче, чем в прототипном штамме VR-2332 2 типа. Более того, он содержит три дискретные делеции в транслируемом белке с размерами делеций, составляющими 111, 1 и 19 аминокислот, соответственно, соответствующие положениям аминокислот в nsp2 штамма VR-2332 PRRSV 324-434, 486 и 505-523, соответственно (фиг.12). Три делеции привели к утрате нескольких остатков пролина и предсказанных эпитопов для B-клеток. Помимо этих делеций, также были выявлены значительные изменения аминокислотной последовательности nsp2 из других штаммов 2 типа, иногда соответствующие аминокислоте 1 типа, выявленной в том же относительном положении (фиг.12). Сравнение предсказанного белка nsp2 двух генотипов PRRSV показало, что аминокислотная идентичность в вирусах 2 типа варьировала от 66% до 99% и 88-90% в вирусах 1 типа, однако значительно отличалась между генотипами (сходство <45%). В частности, изоляты MN184 проявляли 66-80% аминокислотную идентичность со всеми предсказанными белками nsp2 2 типа и только 43-45% идентичность со штаммами 1 типа. При исследовании данных множественного выравнивания последовательностей, представленных на фиг.12, авторы настоящего изобретения также выявили, что вставки или делеции в обоих генотипах во всех случаях встречались в этом гипервариабельном среднем участке. До этого Shen et al. (Arch. Virol., 145:871-883 (2000)) первые сообщили, что североамериканский штамм PRRSV 2 типа SP обладает уникальной вставкой из 36 а.к. относительно положения между а.к. 813 и 814 nsp2 VR-2332 PRRSV. Другой исследователь обнаружил уникальную делецию из 12 а.к. в положении 466-477 в изоляте HB-2(sh)/2002 nsp2 PRRSV (Gao et al., Arch. Virol., 149:1341-1351 (2004)). Делеция из 17 а.к. встречалась в новых выявленных изолятах подобного европейскому PRRSV по сравнению со штаммом LV (Fang et al., Virus Res., 100; 229-235 (2004); Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)). Случаи мутаций не встречаются постоянно в одном аминокислотном участке, хотя делеции, выявленные между изолятами MN184 и другими вирусами 2 типа, охватывают большую часть наиболее крупной делеции, выявленной между PRRSV 1 типа и другими PRRSV 2 типа. Все эти данные подтверждают, что ORF nsp2 содержит консервативный протеазный мотив и предсказанные трансмембранные участки, которые могут быть необходимыми для репликации PRRSV, однако является более высокочувствительной к мутациям в крупном участке в середине.

Неожиданное появление местных изолятов PRRSV в Миннесоте, обладающих конфигурацией 184 RFLP, все еще является загадочным, однако последствия этого события проявляются даже в настоящее время. Ветеринарная диагностическая лаборатория Миннесоты в настоящее время проводит стандартное секвенирование сходных изолятов 184 RFLP из приблизительно одной четверти от общего количества заявок, касающихся последовательностей ORF5. Кроме того, конфигурация 184 RFLP в настоящее время была выявлена не только в Миннесоте, но также в Айове, Висконсине, Южной Дакоте, Канзасе, Миссури, Иллинойсе, Небраске, Кентукки, Оклахоме и Вайоминге. Авторы настоящего изобретения решили получить полные геномные последовательности двух изолятов вследствие необходимости понимания того, возможно ли существование более одного типа вируса, и того, что по данным штатного патолога в стаде свиней, в котором выявлен изолят MN184A, течение PRRS было более мягким, чем в стаде, инфицированном изолятом MN184B. Штаммы не инокулировали неиммунизированным животным для проверки проявлений заболевания, однако интересно отметить, что изолят MN184B обладал значительно большей выявленной нуклеотидной вырожденностью при анализе генома, и это может быть причиной описанной тяжести заболевания.

Этот анализ генома повысил понимание авторами настоящего изобретения огромного нуклеотидного и аминокислотного варьирования последовательностей, существующего в естественных условиях. Факторы, определяющие это варьирование, могут быть связаны со способом содержания свиней в настоящее время, с межштатным и интернациональным транспортом свиней и семенной жидкости самцов свиней, смешиванием различных изолятов PRRSV в стадах и природой самого вируса. Получение полной геномной последовательности также позволяет авторам настоящего изобретения проводить мониторинг областей генома, толерантных к варьированию и наиболее консервативных. В результате этого исследования, а также предшествующей публикации (Ropp et al., J. Virol., 78:3684-3703 (2004)) формируется картина, которая указывает на то, что nsp2, nsp1 и ORF5 являются чрезвычайно универсальными белками.

Это исследование также отчетливо показало, что размер nsp2 нельзя более использовать для установления различий между генотипами PRRSV. Новое открытие того, что nsp2 эволюционировал в направлении генома 2 типа посредством трех дискретных делеций, которые привели на сегодняшний день к более короткому геному (15019 п.о.), подтверждает, что PRRSV может эволюционировать в направлении устранения необязательных геномных участков и формирования более компактного генома. В заключение, несмотря на то, что в настоящее время о значении генетических вариаций в PRRSV можно только догадываться, эволюционное изменение, показанное в ORF5, nsp1 и nsp2, вероятно, должно быть связано с биологическим приспособлением PRRSV под давлением отбора.

Полное описание всех патентов, патентных заявок и публикаций и материалы, доступные в электронном виде (включая, например, данные нуклеотидных последовательностей, например, в GenBank и RefSeq, и данные аминокислотных последовательностей, например, в SwissProt, PIR, PRF, PDB, и данные продуктов трансляции указанных кодирующих областей в GenBank и RefSeq), цитированные в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок. Представленное выше подробное описание и примеры приведены только для ясности понимания. Оно не подразумевает каких-либо необязательных ограничений. Это изобретение не ограничивается представленными и описанными конкретными деталями, поскольку отклонения, понятные специалисту в данной области, будут включены в это изобретение, определенное формулой изобретения.

Если нет иных указаний, все числовые значения, выражающие количества компонентов, молекулярные массы и так далее, используемые в описании и формуле изобретения, следует понимать, как скорректированные во всех случаях термином "приблизительно". Таким образом, если нет иных указаний, числовые параметры, указанные в описании и формуле изобретения, представляют собой приближения, которые могут варьировать в зависимости от требуемых свойств, которые стремились получить посредством настоящего изобретения. Самое меньшее, и не в качестве попытки ограничить принцип эквивалентов объемом формулы изобретения, каждый числовой параметр следует толковать по меньшей мере с точки зрения величины описанных значащих цифр и посредством применения стандартных способов округления.

Несмотря на то, что диапазоны чисел и параметры, указывающие на границы объема этого изобретения, являются приблизительными, числовые значения, указанные в конкретных примерах, описаны настолько точно, насколько это возможно. Однако все числовые значения, по существу, включают диапазон, обязательно полученный исходя из стандартного отклонения, определенного в их соответствующих измерениях в исследовании.

Все заголовки представлены для удобства чтения и их не следует использовать для ограничения значения текста, который следует после заголовков, если не указано иное.