способ получения рекомбинантного с-пептида проинсулина человека

Формула изобретения

1. Способ получения рекомбинантного с-пептида человека, включающий культивирование штамма-продуцента Escherichia coli, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение «телец включения», содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой В, обработку которыми осуществляют одновременно, при этом продукты трипсинолиза разделяют хроматографией на SP-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1М аммоний-ацетатным буфером, рН 3,6, содержащим 3М мочевины, элюируя линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5М в стартовом буфере, с последующей очисткой и получением целевого продукта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что штаммом-продуцентом является E.coli JM 109/pPINS07, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка проводят путем осаждения примесных соединений подкислением до рН 4,0-6,0 с последующей хроматографией на КМ-сефарозе.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной и белковой инженерии, и может быть использовано для получения рекомбинантного с-пептида (соединительного пептида проинсулина) человека.

Предшествующий уровень техники

Различают несколько форм с-пептида длиной от 31 до 35 аминокислотных остатков. Формы различаются содержанием остатков аргинина и лизина на С- и N-концах полипептида. Эти аминокислоты не входят в состав молекулы зрелого инсулина человека и, по мнению некоторых исследователей, должны относиться к с-пептиду. Однако в кровеносное русло секретируется только зрелый с-пептид длиной 31 аминокислотный остаток, не содержащий основных аминокислот. Последовательность этой формы с-пептида приведена ниже.

Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly

Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln

Предшественник с-пептида синтезируется в островках Лангерганса специализированными клетками поджелудочной железы в составе препрогормона (препроинсулина). Образование с-пептида происходит там же в результате посттрансляционных модификаций. На первом этапе от препроинсулина отщепляется сигнальная последовательность - N-концевой фрагмент, содержащий 23 аминокислотных остатка. Из образовавшегося проинсулина (86 аминокислотных остатков) в комплексе Гольджи, при участии специфических пептидаз, происходит образование зрелого с-пептида (31 аминокислотный остаток). Впоследствии он секретируется в кровеносное русло в эквимолярном соотношении с инсулином.

c-Пептид проинсулина человека был описан в 60-х годах XX века. Первоначальные исследования не обнаружили существование у него специфической биологической функции. Долгое время считалось, что он необходим только для образования правильной конформации белковой молекулы инсулина. В начале 90-х годов XX века [Johansson et al., 1992] появилось много сведений о применении с-пептида для профилактики и лечения осложнений, связанных с диабетом. с-Пептид с успехом применялся для улучшения состояния пациентов, страдающих от ретинопатии, ангиопатии и нефропатии - основных факторов инвалидизации и смертности при диабете [Ido, Science, 1997, 277, 563-566; Forst, 1998, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 106, 270-276 и др.]. Однако в настоящее время крупномасштабные исследования и применение в клиниках затруднены из-за недостатка с-пептида на рынке, его высокой стоимости и низкого качества. Так, например, известный поставщик реактивов - корпорация Sigma-Aldrich - предлагает с-пептид, имеющий чистоту 85% по цене 371,5 евро за 250 мкг препарата [Каталог Sigma 2006-2007, с.706]. Другая корпорация - Phoenix Pharmaceuticals, Inc. - предлагает 200 мкг препарата по цене 75,00 долларов.

При этом компания не указывает никаких данных относительно качества продаваемого пептида.

В организме здорового человека с-пептид секретируется в эквимолярном соотношении с инсулином. Точное количество, необходимое пациентам, страдающим диабетом, в настоящее время не определено. Если допустить, что больным необходимо эквимолярное введение препаратов инсулина и с-пептида, то при суточной дозе инсулина 3 мг потребуется введение приблизительно 1,5 мг с-пептида. Таким образом, при применении с-пептида, имеющегося на рынке, стоимость терапии одного пациента в течение месяца будет составлять более 15000 долларов. При этом его качество не удовлетворяет требованиям, предъявляемым к фармакологическим препаратам.

В отличие от инсулина аминокислотная последовательность с-пептида сильно отличается у разных видов млекопитающих, что делает невозможным получение его из животного сырья. Существующие способы получения с-пептида, можно разделить на три категории:

1) Получение с-пептида химическим синтезом. Этим способом получено большинство препарата, представленного на рынке в настоящее время [Sigma-Aldrich, Phoenix Pharmaceuticals, Inc. и др.].

2) Получение с-пептида биосинтетическими методами в составе слитых белков [Huang, Acta Biochim. Biophys. Sin. 2006, 38: 586-592; Jonasson, Journal of Biotechnology 76 (2000) 215-226]. Для получения с-пептида этим способом создается химерный белок, в котором за лидерным фрагментом следуют несколько последовательностей с-пептида, разделенных аминокислотами, обеспечивающих гидролиз специфическими протеазами. На первом этапе происходит культивирование микроорганизмов в ферментерах, затем в них индуцируется синтез рекомбинантного полипептида; клетки разрушаются, и рекомбинантный белок очищается и обрабатывается специфическими протеазами, приводящими к получению с-пептида. На заключительном этапе происходит очистка с-пептида от примесей. Данный способ может обеспечить большие объемы производства, но требует создания штаммов-продуцентов, отработки условий культивирования микроорганизмов, способов очистки рекомбинантного белка, а также создания и валидации методов контроля качества.

3) Получение с-пептида биосинтетическими методами совместно с инсулином. Этот способ производства заключается во введении некоторых модификаций в технологию получения рекомбинантного инсулина с целью оптимизации получения с-пептида, образующегося на определенных этапах производства, в основе которого лежит получение проинсулина, не подвергающегося модификациям. Данный способ имеет ряд преимуществ. Для получения с-пептида этим способом не требуется создания новых штаммов-продуцентов, отработки технологии очистки и сворачивания белка, создания новых инструментальных методов контроля производственного процесса.

Кроме того, сырьем для получения с-пептида, в данном случае, являются отходы, образующиеся при производстве рекомбинантного инсулина. Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является способ получения с-пептида, предложенный J. Nilsson с соавторами (1). Способ заключается в культивировании штамма-продуцента Е.coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Авторам удалось добиться высокой продуктивности штамма-продуцента за счет использования ими разработанной богатой питательной среды. Выход проинсулина составлял 3 г/л питательной среды. Схема выделения заключалась в разрушении бактериальных клеток, получении «телец включения», содержащих проинсулин, растворении «телец включения», окислительного сульфитолиза проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией на IgG-сефарозе, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой В) и заключительной очистке инсулина и с-пептида высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой. Недостатками данного способа являются:

А) использование богатой питательной среды для выращивания микроорганизма, длительное время выращивания (около 34 час), высокая себестоимость целевого продукта, обусловленная использованием для очистки аффинного сорбента, дорогого в производстве и недолговечного при промышленном использовании. Недостатком также можно считать использование в технологии получения инсулина и с-пептида детергента Tween 20. Известно, что использование детергентов при выделении белков приводит к их сорбции на белок и присутствию детергента в конечном продукте. Также очистка с-пептида только методом хроматографии с обращенной фазой приводит к низкому выходу на данной стадии, которая составляет всего 44%.

Б) Выделение и очистка проинсулина как промежуточного продукта усложняет процесс и снижает выход целевых продуктов.

Настоящее изобретение устраняет имеющиеся недостатки способов получения с-пептида.

Сущность изобретения

В данном изобретении описывается способ получения рекомбинантного с-пептида, который полностью совместим с существующей технологией получения рекомбинантного инсулина человека, раскрытый в патенте Российской Федерации RU2144957, дата публикации 27 января 2000 г.

Сущность изобретения состоит в способе получения рекомбинантного с-пептида человека, включающем культивирование штамма-продуцента Escherichia coli , разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение «телец включения», содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой В с последующей очисткой и получением целевого продукта. В качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli JM109/pPINS07, очистку ренатурированного гибридного белка осуществляют путем осаждения примесных соединений подкислением до рН 4,0-6,0 с последующей хроматографией надосадочной жидкости на КМ-сефарозе, расщепление гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой В осуществляют одновременно, при этом продукты трипсинолиза разделяют хроматографией на SP-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0-6,0, содержащим 3 М мочевины, с элюцией линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере. Белковый материал, не сорбирующийся при данных условиях и содержащий с-пептид, собирают и затем проводят очистку с-пептида на анионообменных сорбентах и методами обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии.

Основное отличие данного способа получения с-пептида заключается в том, что для его производства не требуется расходов на культивирование микроорганизма, выделение и очистку гибридного белка, а также на ферментную обработку, так как при выбранных условиях гидролиза гибридного белка с-пептид не разрушается и сохраняет свою структуру.

К числу непосредственных затрат на производство с-пептида относятся затраты, связанные с двумя стадиями хроматографической очистки и лиофилизацией. Причем за счет применения анионообменной хроматографии низкого давления удается существенно продлить ресурс сорбентов, применяемых для высокоэффективной хроматографии, и повысить выход с-пептида на стадии очистки.

Наилучший вариант осуществления настоящего изобретения

Для получения рекомбинантного с-пептида человека используют рекомбинантный штамм бактерии Escherichia coli JM109/рPINS07-продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека. Штамм депонирован в Центральной коллекции микроорганизмов Российского акционерного общества «БИОПРЕПАРАТ» ЦКМК «Б» под № ЦКМ В-66ИН.

Выращивание посевной и основной культуры рекомбинантного штамма проводят на питательной среде, содержащей в г/л: гидролизат казеина солянокислый - 20, экстракт пекарских дрожжей - 14, двузамещенный фосфат калия трехводный - 6, однозамещенный фосфат калия - 3, сульфат магния - 0,5, натрий хлористый - 5, глюкозу - 10, ампициллина натриевую соль - 0,05, воду очищенную - остальное. Посевной материал используют для засева ферментера общей емкостью 200-1500 л. Для индукции синтеза гибридного белка в середине логарифмической фазы роста вносят 1-изопропил-Р-В-1-тиогалактопиранозид. В процессе выращивания концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 40±15%, количество вводимой глюкозы регулируют по уровню растворенного кислорода и рН. После окончания выращивания культуру концентрируют на сепараторе и разрушают на гомогенизаторе Гаулина в 0,1 М Трис-буфере, содержащем 1,5 М мочевины и 1 мМ ЭДТА. «Тельца включения» отделяют центрифугированием.

Выделение гибридного белка из гранул проводят по следующей схеме.

«Тельца включения» растворяют в буфере, содержащем 0,1 М Трис, 8 М мочевину, после чего добавляют 5-10 мМ дитиотреитола.

Гибридный белок ренатурируют путем инкубации в 5-10-кратном объеме 0,1 М глицин-NaOH буфера, рН 9-11 при t = 10-14°С.

Кислотное осаждение проводят доведением рН до 4,0-6,0 раствором НСl. Образовавшийся осадок отделяют микрофильтрацией.

Очистку гибридного белка проводят хроматографией на КМ-сефарозе, уравновешенной 0,05 трис-HCl буфером, рН 7,0-7,5. Белок элюируют уравновешивающим буфером, содержащим 0,25 М NaCl и 1,5 М мочевины.

Ферментативное расщепление гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой В проводят при соотношении карбоксипептидаза:гибридный белок - 0,3:1000. Соотношение трипсин:карбоксипептидазы В составляет 0,75:1. Реакцию начинают при температуре 8,5-9,5°С, затем реакционную смесь постепенно нагревают до 17-20°С. После завершения процесса реакцию останавливают подкислением трифторуксусной кислотой до рН 3,3.

Продукты трипсинолиза хроматографируют на SP-сефарозе, уравновешенной 0,03 М аммоний-ацетатным буфером, рН 3,6, содержащим 3 М мочевину. На этой стадии инсулин сорбируется на носитель, а с-пептид элюируется во фракциях проскока.

Фракции проскока разводят в соотношении вода:материал - 3:1 и доводят рН до величины 4,0-6,0. Затем этот материал подвергается хроматографии на анионообменном сорбенте. Элюция осуществляется в трис-ацетатном буфере рН 5,0 повышением градиента хлористого калия до 0,5 М.

Фракции, содержащие чистый материал, подвергают очистке на стандартном оборудовании для препаративной обращенно-фазной хроматографии.

Чистый материал подвергается лиофильной сушке и хранится в таком виде до использования.

Пример получения с-пептида на опытно-промышленном оборудовании

1. Выращивание биомассы продуцента, содержащей гибридный белок

Рабочую культуру клеток рекомбинантного штамма Escherichia coli JМ109/рРINS07-продуцента гибридного полипептида (белка), содержащего проинсулин человека, хранят в водно-глицериновом растворе в стеклянных или полимерных ампулах при температуре минус 40°С.

На всех стадиях размножения микробных культур используют питательную среду следующего состава (г/л):

Таблица 1
Гидролизат казеина солянокислый, типа Дифко	20
Экстракт пекарских дрожжей	14
Двузамещенный фосфат калия трехводный	6
Однозамещенный фосфат калия	3
Сульфат магния	0,5
Натрий хлористый	5
Глюкоза	10
Ампициллина натриевая соль	0,05
Вода очищенная	Остальное

Опытно-промышленная линия для выращивания биомассы продуцента состоит из качалки-инкубатора на 12 качалочных колб и ферментеров вместимостью 15, 150 и 1500 л. Посевные культуры готовят в количестве 1/10 от объема засеваемой питательной среды. На первом этапе размножения 2 колбы с питательной средой засевают содержимым одной ампулы с рабочей культурой и инкубируют в качалке при 37°С в течение 18 час. Выращенной культурой засевают 10-12 колб, содержащих по 100 мл питательной среды, и выращивают до оптической плотности (ОП) 4-6 ед. (длина волны - 540 нм, длина оптического пути - 10 мм).

Цепь ферментеров, изготовленная по индивидуальному заказу, имеет согласованные геометрические, физические и масс-обменные характеристики. Управление процессами подготовки питательных сред и проведения культивирования осуществляется по программам, заложенным в компьютеры.

Основные условия выращивания посевных культур

Таблица 2
Рабочая емкость ферментеров	10 и 100 л
Объем питательной среды	9 и 90 л
Рабочая температура	36,5±0,5°С
рН	6,9±0,2
рО2	40±15%
Пеногашение (химическое и/или механическое)	По сигналу датчика
Аэрация и режим работы мешалки	По уровню рО2
Количество вводимой глюкозы и щелочи	По уровню рО2 и рН
Длительность	4-6 час
Окончание процесса	При ОП 7-8

Для всех посевных культур проводят структурно-морфологический анализ, при котором оценивается не только «чистота» культур, но и морфологическая структура клеток микроорганизма. По результатам анализа принимается решение о возможности дальнейшего использования посевного материала.

Выращивание основной культуры продуцента проводят в ферментере общей емкостью 1500 л. Состав питательной среды и основные условия культивирования такие же, как и для посевных культур, однако для индуцирования биосинтеза гибридного белка на определенной стадии развития культуры в нее вносится индуктор 1-изопропил-р-0-1-тиогалактопиранозид. Максимальное накопление гибридного белка происходит в том случае, когда индукцию гибридного белка провоцируют в середине логарифмической фазы роста. Для выбранных нами условий выращивания это соответствует накоплению биомассы 7-10 ед. ОП. После добавления индуктора выращивание продолжают до образования внутриклеточных включений гибридного белка «телец включения» у 90-95% клеток. Экспресс-контроль процесса накопления «телец включения» (ТВ) осуществляют с помощью фазово-контрастной микроскопии препаратов «раздавленная капля».

Основные параметры процесса приведены в таблице.

Таблица 3
№	Параметр	Величина	Примечание
1	Полная вместимость ферментера	1500 л
2	Рабочая емкость ферментера	1000 л
3	Количество питательной среды	900 л
4	Количество посевной культуры	100 л
5	Рабочая температура	36,5±0,5°С
6	рН	6,9±0,2
7	рО2	40+15%
8	Пеногашение (химическое и/или механическое)	По сигналу датчика
9	Аэрация и режим работы мешалки	По уровню рО2
10	Количество вводимой глюкозы и щелочи	По уровню рО2 и рН	До 15 кг
11	Введение индуктора	Через 4-6 час роста	При ОП 7-10 ед.
12	Окончание процесса	При образовании ТВ у 90-95% клеток	7-9 час

После образования ТВ у 90-95% клеток дальнейшее культивирование может привести к частичному лизису клеток и потере накопленного гибридного белка.

Согласно результатам ретроспективного анализа в культурах накапливается до 3 г/л гибридного белка.

2. Выделение «телец включения»

Рост культуры в ферментере останавливают путем резкого сокращения интенсивности перемешивания, включая аэрацию, и охлаждение до 10-14°С. Охлажденную культуру концентрируют на сепараторе в 8-10 раз. Получают 100-125 л суспензии, в которую вводят концентрат буфера (на 50 л воды очищенной - 15 кг мочевины, 1,4 кг натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,9 кг Трис-буфера).

Забуференную суспензию дважды пропускают через гомогенизатор Гаулина при давлении 700-800 атм. Температура суспензии не должна быть выше 15-20°С, что достигается охлаждением питателя и приемника гомогенизатора.

Гомогенат клеток пропускают через проточную центрифугу (g = 18000). Основная масса «телец включения» (не менее 90%) осаждается в роторе центрифуги, а растворимые белки и остатки клеточных стенок сбрасываются из центрифуги в сборник для инактивации. Влажный осадок «телец включения», 8-10 кг, выгружают из ротора центрифуги, фасуют в полиэтиленовую тару, замораживают и хранят в морозильнике при температуре минус 40°С. Срок хранения - до 6 месяцев. Потери гибридного белка при выделении «телец включения» не превышают 15%.

3. Выделение гибридного белка

В реактор объемом 250 л заливают 100 л буферного раствора, содержащего 8 М мочевины, загружают 10-12 кг пасты «телец включения» и включают перемешивающее устройство. После растворения «телец включения» добавляют в реактор 0,150 кг дитиотреитола и продолжают перемешивать в течение 10-12 час.

В реактор с рубашкой объемом 1200 л заливают 900 л глицин-NaOH буфера, рН 9-11 и охлаждают его до температуры 10-14°С, подавая в рубашку охлажденную воду. После того как буфер охладится, начинают насосом подавать в реактор раствор гибридного белка с восстановленными дисульфидными связями. В течение 20-24 час инкубируют раствор гибридного белка, перемешивая и поддерживая температуру в реакторе 10-14°С.

После того как 75-80% гибридного белка (ГБ) ренатурирует с образованием правильно замкнутых S-S связей (контроль методом ОФ ВЭЖХ), проводят подкисление реакционной среды в реакторе до рН 4,0-5,5 раствором соляной кислоты. Останавливают перемешивание и через 4-5 час отделяют сформировавшийся осадок на микрофильтрационной установке. Правильно свернутый гибридный белок сорбируют из фильтрата на ионообменную колонку объемом 20 л, заполненную КМ-сефарозой, предварительно уравновешенной 0,05 М трис-HCl буфером, рН 7,0-7,5.

Сорбированный белок элюируют с колонки, пропуская через нее уравновешивающий буфер с добавлением 0,25 М NaCl и 1,5 М мочевины.

Фракции, содержащие гибридный белок с чистотой не менее 95% (ОФ ВЭЖХ), объединяют и используют для дальнейшей работы.

4. Ферментативный гидролиз гибридного белка

Расщепление ГБ трипсином и карбоксипептидазой В ведут в реакторе из нержавеющей стали, снабженном перемешивающим устройством и рубашкой.

Раствор ГБ в количестве 100-150 л (содержание белка 1-1,2 кг) вносят в реактор, включают перемешивающее устройство и подают в рубашку охлажденную воду с температурой 8-9°С. Через 30-40 мин после того как раствор ГБ охладится до температуры 10-12°С, измеряют показатель рН раствора ГБ и с помощью 1 М раствора трис-(оксиметил)аминометана доводят его значение до рН 7,0-7,5. Затем в реактор вносят раствор карбоксипептидазы В и трипсина из расчета, что массовое соотношение внесенной в реактор карбоксипептидазы В и гибридного белка равно 0,3:1000, а массовое соотношение трипсина и карбоксипептидазы В составляет 0,75:1. Через 1000-1200 мин реакцию расщепления ГБ трипсином останавливают, подкисляя содержимое реактора трифторуксусной кислотой до рН 3,3.

Полученный раствор наносят на хроматографическую колонку объемом 20 л, заполненную SP-сефарозой, предварительно уравновешенной 0,03 М аммоний-ацетатным буфером, рН 3,6 с добавкой 3 М мочевины и собирают фракции, содержащие с-пептид. На данной стадии на SP-сефарозу сорбируется инсулин, а с-пептид не взаимодействует с сорбентом и выходит во фракциях проскока.

Фракции, содержащие с-пептид, объединяют, разводят водой в объемном соотношении материал:вода 3:1 и после подведения рН до 4-6 наносят на колонку. Затем колонку промывают 20 мМ трис-ацетатным буфером, рН 5,0 до достижения базовой линии контрольного проточного денситометра. Сорбированный с-пептид элюируют линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 М в том же буфере.

Объединяют фракции, содержащие с-пептид с чистотой не менее 90% (контроль осуществляется методом аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии - ОФ ВЭЖХ), и передают на стадию препаративной ОФ ВЭЖХ. Затем доводят рН раствора до значения 6,3-6,5 10% раствором аммиака. Средний выход на данной стадии очистки превышает 85%.

5. Очистка с-пептида методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ОФ ВЭЖХ)

Очистку с-пептида методом ОФ ВЭЖХ проводят на стандартном оборудовании Kiloprep 250 фирмы Waters, США или аналогичном оборудовании других фирм. Установка включает в свой состав следующие элементы:

блок управления,

двуголовочный мембранный насос высокого давления,

насос высокого давления для закачки пробы на разделение,

ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны,

препаративная колонка с устройством для радиального сжатия,

пневморегулируемые клапаны потока на выходе,

компьютер для управления и обработки данных.

Подготовку хроматографической установки к работе проводят согласно инструкции фирмы-изготовителя для отдельных блоков и установки в целом.

Для проведения работ устанавливают картридж, заполненный силикагелем с привитой фазой C₁₈ фирмы "Videk", США, в колонку и создают в рубашке колонки давление согласно прилагаемому к картриджу паспорту. Подключают колонку гибкими армированными шлангами к хроматографу. Промывают колонку последовательно раствором 0,1% ТФУ в количестве 2-3 объема колонки, затем 1-2 объемами ацетонитрила (В) и 1-2 объемами воды. Подготовленная таким образом колонка используется на стадии очистки.

В подготовленную колонку при помощи насоса для подачи пробы из емкости подают раствор с-пептида с предыдущей стадии в количестве 35-40 г белка. Включают программирующее устройство и ведут разделение по следующей программе:

Таблица 4
Время, мин	Скорость элюции, см3	% раствора В
0	350	26
5	350	27,5
15	350	28,5
20	350	30
25	350	70
30	350	26

Регистрацию процесса разделения ведут при 220 нм на проточном спектрофотометре при чувствительности прибора 2,0. Сбор фракций белка ведут при помощи коллектора хроматографа или вручную. Собранные фракции основного пика с-пептида анализируются на содержание примесей методом аналитической обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Выход с-пептида на данной стадии превышает 80%. Таким образом, суммарный выход по двум стадиям хроматографической очистки составляет более 70%, что более чем в 1,5 раза превышает полученный Nilsson еt al.

6. Финишная очистка и лиофилизация с-пептида

Фракции, содержащие не менее 95% с-пептида, объединяют в стеклянном реакторе, снабженном рубашкой, датчиками температуры и рН. Затем доводят рН раствора до значения 6,3-6,5 10% раствором аммиака. Материал подвергается стерилизующей фильтрации и в стерильных условиях разливается по флаконам. Затем осуществляется лиофильное высушивание препарата и укупорка флаконов в стерильных условиях. Таким образом, применение данного способа позволяет с высоким выходом получать с-пептид проинсулина человека с чистотой не менее 95% из отходов, образующихся в процессе получения рекомбинантного инсулина человека.

Список литературы

1. Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. Integrated production of human insulin and its C-peptide. 1996, Journal of biotechnology, v. 48, p. 241-250.

2. Патент RU 2144957, 27.01.2000.

3. Johansson et al., 1992.

4. Ido, Science, 1997, 277, 563-566.

5. Forst, 1998, Exp. Clin. Endocrinol. Diabetes, 106, 270-276.

6. Huang, Acta Biochim. Biophys. Sin. 2006, 38: 586-592.

7. Jonasson, Journal of Biotechnology 76 (2000) 215-226.