новые нутрицевтические композиции, содержащие экстракт stevia или компоненты экстракта stevia, и их применения

Формула изобретения

1. Способ улучшения когнитивной функции у животного или человека, включающий введение соединения, которое выбирают из группы, состоящей из:

стевиола, изостевиола и смеси стевиола и изостевиола,

в количестве, улучшающем когнитивную функцию.

2. Способ по п.1, который дополнительно улучшает психологическое благополучие.

3. Способ по п.1, в котором когнитивную функцию выбирают из группы, состоящей из:

поддержания хорошего когнитивного состояния и баланса, способности к обучению, анализа языковой информации, решения задач, интеллектуальной деятельности, способности справляться с психосоциальными нагрузками, внимания и концентрации, памяти, способности к запоминанию, интеллектуальной восприимчивости, интеллектуальной активности, интеллектуальной утомляемости, стабилизации интеллектуального статуса, способности к снятию стресса, стресса из-за перегрузок на работе, связанного со стрессом истощения и/или переутомления и стимуляции релаксации.

4. Композиция, применяемая в производстве нутрицевтика или лекарственного средства для улучшения когнитивной функции у животного или человека, которая включает соединение, которое выбирают из группы, состоящей из:

стевиола, изостевиола и смеси стевиола и изостевиола,

в количестве, улучшающем когнитивную функцию.

5. Композиция по п.4, в которой когнитивную функцию выбирают из группы, состоящей из:

поддержания хорошего когнитивного состояния и баланса, способности к обучению, анализа языковой информации, решения задач, интеллектуальной деятельности, способности справляться с психосоциальными нагрузками, внимания и концентрации, памяти, способности к запоминанию, интеллектуальной восприимчивости, интеллектуальной активности, интеллектуальной утомляемости, стабилизации интеллектуального статуса, способности к снятию стресса, стресса из-за перегрузок на работе, связанного со стрессом истощения и/или переутомления, и стимуляции релаксации.

6. Нутрицевтик для улучшения когнитивной функции, включающий соединение, которое выбирают из группы, состоящей из:

стевиола, изостевиола и смеси стевиола и изостевиола,

в количестве, улучшающем когнитивную функцию.

7. Нутрицевтик по п.6, предназначенный для применения в ветеринарии.

8. Нутрицевтик по п.6, где когнитивную функцию выбирают из группы, состоящей из:

поддержания хорошего когнитивного состояния и баланса, способности к обучению, анализа языковой информации, решения задач, интеллектуальной деятельности, способности справляться с психосоциальными нагрузками, внимания и концентрации, памяти, способности к запоминанию, интеллектуальной восприимчивости, интеллектуальной активности, интеллектуальной утомляемости, стабилизации интеллектуального статуса, способности к снятию стресса, стресса из-за перегрузок на работе, связанного со стрессом истощения и/или переутомления, и стимуляции релаксации.

Описание изобретения к патенту

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение имеет отношение к новой нутрицевтической композиции или пищевой добавке, включающей экстракт Stevia или его компоненты, такие как стевиол и стевиозид, в качестве активного ингредиента (активных ингредиентов) для улучшения когнитивных функций, таких как способность к обучению, память и восприимчивость, а также для снятия психосоциального давления.

Сведения о предшествующем уровне техники

Память, способность к обучению и восприимчивость обусловлены нейронными цепями в среднем мозге, в особенности, в гиппокампе, в котором происходит обработка информации и закрепление памяти. Умственная деятельность и способность к обучению зависят от синаптической пластичности; т.е. от усиления нейрональных контактов путем введения в действие новых рецепторов, образования новых синапсов и в конечном итоге генерации новых нейрональных контактов.

Формирование памяти (долговременной) и эффективное функционирование мозга зависят от синтеза новых белков, предназначенных для усиления коммуникативной интенсивности взаимодействий между нейронами. Продукция новых белков, призванных усиливать синапсы, регулируется с помощью химических и электрических сигналов внутри нейронов.

Долговременная потенциация (LTP) представляет собой термин, применяемый для описания продолжающейся длительное время активации синаптической передачи (часы in vitro, дни или недели in vivo), которая имеет место в определенных синапсах в центральной нервной системе (ЦНС) и которая сменяется коротким, условнорефлекторным, всплеском предсинаптической электростимуляции (приблизительно 100 Гц в 1 секунду). Широко принято, что этот феномен представляет собой один из основных механизмов, посредством которого формируется и сохраняется память в мозге. LTP наблюдали как in vitro, так и у живых животных. В экспериментальных условиях приложение серии коротких, высокочастотных электрических стимулов к синапсу может потенцировать упрочнение химического синапса на длительное время, от минут до часов. Важнее всего то, что LTP вносит вклад в синаптическую пластичность у живущих животных, обеспечивая основу для высокоадаптивной нервной системы.

Исходно, в процесс LTP вовлечены два различных типа рецепторов, а именно рецепторный комплекс N-метил-D-аспартата (NMDA) и рецептор -амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты (АМРА). В процессе LTP основной возбуждающий нейротрансмиттер, глутамат, освобождается из предсинаптического нейрона, связывается с АМРА-рецептором на постсинаптической мембране и активирует этот рецептор, что приводит к его деполяризации. При мембранном потенциале покоя канал NMDA-рецептора блокирован ионами магния, а деполяризация постсинаптической мембраны снимает этот блок, позволяя происходить активации NMDA-рецептора и последующему входу кальция в клетку. Считается, что это повышение в концентрации кальция активирует протеинкиназы, что приводит к транскрипции генов и к созданию усиливающих белков (Niehoff (2005), The Language of Life: How Cells Communicate in Health and Disease, 210-223) и в результате к усилению чувствительности АМРА-рецептора, дополнительно содействуя, таким образом, нейротрансмиссии и поддержанию LTP.

NMDA-рецепторы состоят из ансамблей NR1- и NR2-cyбъeдиниц; глутамат-связывающий домен сформирован в месте соединения этих субъединиц. Кроме глутамата, для модуляции функций рецептора NMDA-рецептору необходим ко-агониста, глицин. Глицин-связывающий участок обнаружен на NR1-субъединице, тогда как NR2-субъединица имеет участок связывания для полиаминов, регуляторных молекул, которые модулируют функционирование NMDA-рецептора.

Таким образом, известно, что аминокислота глицин действует как положительный аллостерический модулятор и облигатный со-агонист с глутаматом комплекса NMDA-рецептора (Danysz и Parsons 1998 Pharmacol. Rev., 50(4):597-664). Транспортеры глицина (GlyT) играют важную роль в терминации постсинаптического глицинергического действия и в поддержании низкой концентрации внеклеточного глицина путем обратного поглощения глицина в предсинаптические нервные окончания или глиальные клетки. Следовательно, терминация действия глицина в значительной степени медиируется с помощью быстрого обратного поглощения. Известны два транспортера глицина, GlyT1 и GlyT2, в структуре которых предполагается наличие 12-ти трансмембранных участков, были также идентифицированы три варианта GlyTl (GlyTl a, b и с), кодируемые тем же геном (Borowsky и Hoffman 1998 J. Biol. Chem., 273(44):29077-29085).

GlyT1 представляет собой зависимый только от хлорида натрия переносчик глицина в переднем мозге, в котором он ко-экспрессируется вместе с NMDA-рецептором. Считается, что в этом месте GlyT1 ответственен за контролирование внеклеточного уровня глицина в синапсе (Lopez-Corcuera et al. 2001 Mol. Membr. Biol., 18(1):13-20), что в результате приводит к модуляции функции NMDA-рецептора.

Действительно, в присутствии селективного антагониста GlyTl 7V-[3-(4'-фторфенил)-3-(4'-фенилфенокси)]пропилсаркозина (NFPS) наблюдали усиление ответов NMDA-рецептора в СА1 пирамидальных клетках под действием коллатеральной стимуляции Шеффера, как в мышиных, так и в крысиных препаратах срезов гиппокампа (Bergeron, et al. 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. США, 95(26): 15730-15734). In vivo, системное введение NFPS увеличивает LTP в зубчатой извилине и усиливает предымпульсное ингибирование ответа в акустической реакции испуга у взрослых мышей, указывая на то, что ингибирование GlyTl влияет на функцию NMDA-рецептора, что сказывается на поведении (Kinney, et al 2003, J. Neurosci., 23(20):7586-7591).

Такие данные проливают свет на потенциальную полезность соединений, которые могут усилить синаптическую функцию NMDA-рецептора путем увеличения внеклеточного уровня глицина в локальном микроокружении синаптических NMDA-рецепторов, для предупреждения психотических синдромов и для поддержания или усиления физиологических когнитивных функций, таких как память и способность к обучению, у нормальных индивидов.

Возрастает интерес к созданию соединений, а также нутрицевтических композиций, которые могут быть применены для улучшения способности к обучению, памяти и восприимчивости, как у пожилых, так и у молодых людей, лиц, в особенности, нуждающихся в сильной памяти и внимании в своей повседневной работе, включая студентов, строителей, водителей, летчиков, врачей, продавцов, руководителей, домохозяек, «высокоэффективных профессионалов» и людей, которые находятся в состоянии нервно-психического напряжения или ежедневного стресса, а также персон, которые предрасположены к психической нестабильности, такой как шизофрения.

Таким образом, соединение или нутрицевтическая композиция, которые усиливают функцию NMDA-рецептора и способны улучшить способность к обучению, память и восприимчивость, были бы крайне желательны.

Ранее, экстракт Stevias добавляли к напиткам/пищевым композициям (например, смотри Japanese Kokai 2005-278467 to Nippon Paper Chemical Co., Ltd), но экстракт Stevia функционировал в качестве заменителя сахара.

Сущность изобретения

Было обнаружено, что в соответствии с этим изобретением соединения, имеющие приведенную ниже формулу I и II, представляют собой активаторы функции гиппокампа, благодаря их способности индуцировать LTP, и как таковые полезны в качестве нутрицевтиков и/или лекарственных средств, которые усиливают когнитивные функции. Эти соединения могут функционировать как путем ингибирования транспортера глицина, GlyT1, и, таким образом, ингибирования обратного поглощения глицина или путем активации другого пути, который ведет к индукции LTP, или с помощью обоих механизмов. Таким образом, это изобретение имеет отношение к способу усиления когнитивных функций путем введения такого количества соединения, имеющего формулу I, II, или их смеси животному (включая людей), которое усиливает когнитивную функцию.

Было также обнаружено в соответствии с изобретением, что экстракт Stevia обладает способностью ингибировать обратный захват глицина путем ингибирования транспортера глицина, GlyT1. Результирующее увеличение уровня внеклеточного глицина приводит к усиленной активации NMDA-рецепторов, которые представляют собой первый этап в индукции транскрипционной активации ряда генов и последующей индукции LTP, основного клеточного механизма, вовлеченного в формирование и укрепление памяти.

Кроме того, в соответствии с этим изобретением было обнаружено, что стевиол, изостевиол и стевиозид, соединения, которые могут быть обнаружены в экстрактах Stevia, индуцируют LTP через другой механизм. Так как оба способа обладают одинаковой биологической полезностью, т.е. они оба способствуют функции гиппокампа, другой аспект этого изобретения представляет собой применение одного или нескольких из этих активных ингредиентов для усиления когнитивных функций.

Следовательно, один аспект изобретения представляет собой новую нутрицевтическую композицию, включающую экстракт Stevia или одно или несколько соединений, имеющих формулу I или II, для усиления когнитивной функции. Среди соединений, представленных в таблице 1, особенно предпочтительное соединение представляет собой стевиол и стевиозид, в дополнение к изостевиолу.

Формула I: смотри таблицу 1 для уточнения R-групп

Таблица 1. Структуры стевиола и родственных гликозидов (формула I). Glc, Xy1 и Rha представляют собой остатки сахаров: глюкозы, ксилозы и рамнозы, соответственно, (Kuznesof (2007) Steviol glycosides - chemical and technical assessment, 68^th JECFA meeting).

Соединение	R1	R2
Стевиол	Н	Н
Стевиолбиозид	Н	-Glc- -Glc(2 1)
Стевиозид	-Glc	-Glc- -Glc(2 1)
Ребаудиозид А	-Glc	-Glc(3 1)
Ребаудиозид В	Н
Ребаудиозид С (дулкозид В)	-Glc
Ребаудиозид D	-Glc- -Glc(2 1)
Ребаудиозид Е	-Glc- -Glc(2 1)	-Glc- -Glc(2 1)
Ребаудиозид F	-Glc
Рубузозид	-Glc	-Glc
Дулкозид А	-Glc	-Glc- -Rha(2 1)

Формула II: изостевиол (CAS-номер, 27975-19-5) представляет собой продукт распада стевиолгликозида.

Соединения, имеющие формулу I и II, могут быть получены синтетически с помощью известных способов, путем экстракции из природных источников, таких как растения, с помощью известных методов экстракции, или они могут быть применены как компонент растительного экстракта, предпочтительно экстракта Stevia, который содержит достаточное количество стевиола и/или стевиозида для того, чтобы быть эффективным усилителем функции гиппокампа.

Перечень фигур

Фигура 1 показывает дозо-зависимую кривую эффекта экстракта Stevia на ингибирование GlyT1. Результаты экспериментов представлены как процент ингибирования интернализации радиоактивного глицина в клетки. Фигура 1 ясно показывает, что экстракт Stevia может специфически ингибировать действие GlyTl в экспериментах на клетках.

Фигура 2а показывает частоту появления ошибок в тесте по спуску с высоты; а: значимо отличается от получавших раствор однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода обучения. b: значимо отличается от получавших раствор однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода испытаний, с: значимо отличается от получавших раствор однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода выведения препарата из организма, d: значимо отличается от мышей, получавших Гинкго билоба в течение периода выведения препарата из организма. Во всех случаях значимость обозначают как р<0,05. Эти данные показывают, что мыши, получавшие Stevia, не только обучаются лучше по сравнению с другими группами, но также сохраняют свою память в течение более продолжительного периода времени.

Фигура 2b показывает результаты по продолжительности латентного периода в поведенческом тесте по спуску с высоты (для того, чтобы избежать электрического удара) b: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода проведения тестирования, с: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода выведения препарата из организма, d: значимо отличается от мышей, получавших Гинкго Билоба, в течение периода выведения препарата из организма. Во всех случаях значимость обозначают как р<0,05. Таким образом, мыши, получавшие 150 мг/мкг экстракта Stevia, продемонстрировали существенно лучшую способность к обучению и поведению, связанному с запоминанием, чем контрольные мыши той же возрастной группы, тогда как, мыши, получавшие Stevia в самых больших дозах, выполняли задание лучше, и чем контрольные мыши в той же возрастной группе, и чем мыши группы положительного контроля, получавшие Гинкго билоба.

Фигура 3а показывает латентный период в нахождении на предыдущей позиции скрытой платформы в водном лабиринте Мориса в период обучения, а: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение первого дня, подчеркивая тот факт, что обработка экстрактом Stevia в низких дозах (50 мг/мкг) значимо улучшает способность животных к обучению. Значимость обозначают как р<0,05.

Фигура 3b: латентный период в нахождении на предыдущей позиции скрытой платформы в водном лабиринте Мориса в день тестирования (день 4). а: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе, показывая, что обработка экстрактом Stevia в промежуточных (150 мг/мкг) и высоких (450 мг/мкг) дозах значимо улучшает поведение животных, связанное с запоминанием, до той же степени, как наблюдали у мышей, которым вводили препарат сравнения, Гинкго билоба и в большей степени, чему животных, получавших ролипрам. Значимость обозначают как р<0,05.

Фигура 4а показывает частоту появления ошибок при тестировании в челночной камере: а: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода проведения тестирования. b: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода угасания рефлекса. Значимость обозначают как р<0,05. Таким образом, в течение периода тестирования проэкзаменованные животные, получавшие Stevia в самых больших дозах, демонстрировали значимо лучшие характеристики запоминания, чем однопометные животные, получавшие растворитель, и эквивалентные характеристики по сравнению с мышами, которым вводили ролипрам, соединение, представляющее собой положительный контроль.

Фигура 4b показывает время избегания электрического разряда в челночной камере: а: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода проведения тестирования. b: значимо отличается от получавших Гинкго билоба однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода проведения тестирования. Значимость обозначают как р<0,05. Эти результаты показывают, что мыши, получавшие Stevia (в дозах, равных 150 и 450 мг/мкг), обучаются избегать электроболевого раздражения, при этом они выполняют задание лучше, и чем получавшие растворитель контрольные мыши, и чем мыши, которым в качестве препарата сравнения вводили Гинкго билоба.

Фигура 5 показывает продолжительность посещения каждого угла за 3 часа до и через 3 часа после того, как там присутствовали объекты. Стрелки указывают на место положения объекта. Гинкго билоба и экстракт Stevia существенно увеличивают продолжительность посещения углов, содержащих новые объекты, по сравнению с контрольными мышами, получавшими растворитель (р=0,004 и р=0,005 соответственно). Обе обработки, таким образом, увеличивают исследовательскую активность мышей в тесте по распознаванию объекта.

Фигура 6 показывает частоту возникновения ошибок при поиске места (процент посещения неправильных углов). Обработка экстрактом Stevia приводит к значительному снижению процента частоты возникновения ошибок по сравнению как с контрольными мышами, получавшими растворитель, так и с мышами, которым вводили Гинкго билоба (р=0,012 и р=0,017 соответственно). Этот эффект наблюдали с начала модуля, и он сохранялся в течение первых 12 часов (активная фаза) и показал, что обработка Stevia приводит к повышению уровня внимания и к улучшению поведения, связанного с запоминанием.

Фигура 7 показывает частоту возникновения ошибок при поиске стороны (процент тыканья носом в неправильную сторону правильного угла). Экстракт Stevia опять индуцирует значительное снижение процента частоты возникновения ошибок по сравнению как с контрольными мышами, получавшими растворитель, так и с мышами, получавшими Гинкго билоба (р=0,002 и Р=0,035 соответственно). Этот эффект наблюдали с начала модуля, и он сохранялся в течение первых 12 часов (активная фаза), указывая на улучшение внимания и памяти у мышей, получавших Stevia.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения

Экстракт Stevia

Экстракт Stevia может быть приготовлен из любого вида рода Stevia, такого как Stevia rebaudiana, Stevia eupatoria, Stevia ovata, Stevia plummerae, Stevia salicifolia и Stevia serrata. Обычно, экстракт Stevia должен содержать, по меньшей мере, примерно 10-95% стевиозида и стевиола, предпочтительно от примерно 40-85%.

Как применено во всем описании и формуле изобретения, термин «экстракт Stevia» предназначен для применения в широком смысле и может охватывать растительные экстракты, полученные с помощью общепринятых способов, таких как перегонка с водяным паром, водные экстракции, спиртовые экстракции или экстракции органическими растворителями, такими как этилацетат, и ионно-обменная хроматография.

Единственные критические параметры в отношении экстракта Stevia представляют собой следующее:

1) он должен быть приемлемым для применения в качестве нутрицевтической композиции для животных или для людей. Таким образом, растворитель, который применяют для его получения, должен быть протестирован с помощью различных контролирующих органов на предусмотренное применение. Следовательно, предпочтительные экстрагирующие растворители представляют собой горячую воду, пар, спирт и этилацетат;

2) он должен содержит достаточное количество стевиозида, изостевиола и/или стевиола для того, чтобы быть эффективным.

Кроме того, было обнаружено, что высушенные части растений (такие как листья) содержат достаточное количество активных ингредиентов. Соответственно, предполагается, что Stevia в высушенных формах также должна быть включена в это изобретение в качестве полезного источника экстракта Stevia и его компонентов.

Экстракт Stevias обычно содержит другие соединения, которые также могут быть биологически активны и/или увеличивать биодоступность активных компонентов Stevia. Количество, в котором они присутствуют в экстракте Stevia, будет варьировать в зависимости от ряда факторов, включая: примененные виды Stevia, условия выращивания растения, и, конечно, способов, примененных для получения экстракта Stevia. Типичный экстракт Stevia, полученный с помощью способов водной экстракции, будет содержать стевиол, изостевиол, стевиозид и ребаудиозиды.

Экстракт Stevia и его компоненты оказывают благоприятное воздействие на психическое состояние

Как было описано выше, LTP или укрепление нейрональных соединений, которое происходит посредством активации АМРА и NMDA-рецепторов в мозге, в особенности, в гиппокампе, представляет собой основу памяти, способности к обучению и психической устойчивости. Будучи ингибиторами обратного захвата глицина, посредством его влияния на GlyT1, экстракты Stevia позволяют накапливаться глицину в ближайшей к NMDA-рецептору области, таким образом, активируя его и в конечном итоге вызывая индукцию LTP, основного клеточного механизма, вовлеченного в формирование и укрепление памяти.

Кроме того, стевиол, изостевиол и стевиозид также индуцируют активацию того же биохимического пути (хотя и на другой стадии, чем экстракт Stevia), что приводит к индукции LTP, и также представляют собой соединения, оказывающие благотворное влияние на улучшение функций памяти.

Экстракт Stevia и его компоненты, следовательно, могут активировать функции гиппокампа и улучшать формирование и укрепление памяти, а также психическое здоровье. Таким образом, как применено во всем описании и в формуле изобретения, термин "количество, усиливающее когнитивную функцию" означает, что доза достаточна для активации функций гиппокампа и может привести к улучшению когнитивной функции, которая будет дополнительно определена ниже.

Состояния, которые могут быть улучшены с помощью этого изобретения:

В контексте этого изобретения «лечение» также охватывает совместное лечение, а также предупреждение, ослабление симптомов, связанных с определенным состоянием, уменьшение времени до возникновения определенного состояния, ослабление тяжести состояния и снижение вероятности того, что индивид, не обнаруживающий симптомов заболевания, продемонстрирует это состояние в будущем.

Во всем этом описании и формуле изобретения, термин «улучшенная когнитивная функция» введен для обозначения состояния способствования и поддержания когнитивного здоровья и баланса, такого как:

- возросшая способность к обучению, которая включает:

- анализ языковой информации;

- решение задач;

- интеллектуальная деятельность;

- способность справляться с психофизическими нагрузками;

- возросшее внимание и концентрация;

- возросшая память и емкость памяти, в особенности, краткосрочной памяти;

- возросшая интеллектуальная восприимчивость и интеллектуальная активность, снижение интеллектуальной утомляемости;

- стабилизация интеллектуального статуса, включая:

- снятие послеродового состояния;

- снятие психологической нагрузки, связанной с расставанием с партнером, детьми, смертью любимых людей или связанной с супружескими проблемами;

- снятие проблем, связанных со сменой места жительства или работы, или с похожими событиями;

- снятие напряженного состояния, возникшего в результате дорожно-транспортного происшествия или другого отрицательного социально-психологического давления;

- снятие напряжения, включая:

- лечение, предупреждение и смягчение симптомов, которые имеют отношение к работе с перегрузкой, изнурению и/или переутомлению;

- увеличенное сопротивление или устойчивость к стрессу;

- благоприятствующий и способствующий расслаблению индивидуумов с нормальным здоровьем;

- «улучшение состояния», включая:

- снижение раздражительности и утомляемости;

- способность справляться с новыми ситуациями;

- снижение, предупреждение или смягчение физической и интеллектуальной утомляемости;

- стимуляция доброкачественного сна, которая представляет собой действие против бессонницы и нарушений сна и увеличивает энергичность в более широком смысле, у заболевших индивидуумов или у индивидуумов с нормальным здоровьем.

В предпочтительном аспекте настоящего изобретения композиции могут быть применены в качестве пищевых добавок, в особенности, для людей, которые могут чувствовать необходимость в усилении когнитивной функции и/или в психосоциальной поддержке. Неполный список людей, которые могут получить пользу в результате усиления когнитивной функции, может включать:

- пожилых людей,

- студентов или лиц, готовящихся к прохождению экзаменов,

- детей, у которых очень важно развивать способности к обучению, т.е. младенцев, детей ясельного возраста, детей дошкольного возраста,

- дети и дети школьного возраста,

- строителей, или тех, чья деятельность связана с потенциально опасными механизмами,

- водителей грузового автотранспорта, летчиков, машинистов поездов или других лиц, работающих на транспорте,

- авиадиспетчеров,

- продавцов, администраторов и других «высококвалифицированных профессионалов»

- сотрудников полиции и военнослужащих,

- домохозяек,

или любое лицо, часто сталкивающееся со стрессовыми ситуациями в своей повседневной работе, или того, кто особенно нуждается в поддержании повышенного внимания/ повышенной концентрации внимания/высокой интеллектуальной и психологической работоспособности в своей повседневной работе, как те, кто участвует в спортивных соревнованиях, шахматистов, игроков в гольф, профессиональных исполнителей (актеров, музыкантов и им подобных).

Для того чтобы достигнуть улучшения введение рекомендуют проводить в течение нескольких дней (например, по меньшей мере, в течение шести или десяти дней), и, как правило, предпочтительно ежедневное введение в течение нескольких недель.

Помимо применения для людей, композиции этого изобретения имеют дополнительное применение в области ветеринарии. Животные, на которых может оказать благоприятное воздействие усиление когнитивной функции, включают тех животных, которые испытывают напряженное состояние. Такое состояние имеет место, например, после отлова или транспортировки или может быть связано с условиями содержания (такими как смена места жительства или хозяина), когда у животных развиваются аналогичные расстройства и они находятся в подавленном состоянии или агрессивны, или проявляют стереотипное поведение или тревогу и обсессивно-компульсивное поведение. Животные, которые испытывают стресс, также включают тех животных, которые участвуют в бегах (например, собак, лошадей, верблюдов) или участвуют в различных спортивных соревнованиях, животных, которые участвуют в выступлениях (такие как цирковые животные, и те, которые появляются на сцене, в телевизионных передачах или в фильмах), и лошадей, участвующих в соревнованиях по выездке и других программах, требующих высокой дисциплины.

Предпочтительные «животные» представляют собой домашних животных или животных-компаньонов и сельскохозяйственных животных. Примеры домашних животных представляют собой собак, кошек, птиц, аквариумных рыбок, морских свинок, (американских зайцев) кроликов, зайцев и хорьков. Примеры сельскохозяйственных животных представляют собой рыб, выращиваемых в рыбоводческих хозяйствах, свиней, лошадей, жвачных (крупный рогатый скот, овец и коз) и домашнюю птицу.

Применение/композиции/дозировки нутрицевтиков

Термин «нутрицевтические», такой как применен в этом документе, означает полезность как в пищевой, так в фармацевтической области применения. Таким образом, новые нутрицевтические композиции могут быть применены в качестве добавок к пище и напиткам и в качестве фармацевтических композиций для энтерального или парентерального применения, которые могут представлять собой твердые композиции, такие как капсулы или таблетки, или жидкие композиции, такие как растворы или суспензии.

Нутрицевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут дополнительно содержать защитные гидроколлоиды (такие как камедь, белки, модифицированные крахмалы), связующие вещества, пленкообразующие средства, средства/материалы для заключения в капсулу, материалы для формирования стенки/оболочки капсулы, соединения для формирования матрикса, покрытия, эмульгаторы, поверхностно-активные средства, солюбилизирующие средства (масла, жиры, воски, лецитины и т.д.), адсорбенты, основы, наполнители, совместно применяемые соединения, диспергирующие средства, увлажняющие средства, технологические добавки (растворители), средства, придающие текучесть, средства, придающие вкус, утяжелители, желефицирующие средства, гелеобразующие средства, антиоксиданты и антибактериальные средства.

Кроме того, к нутрицевтической композиции настоящего изобретения могут быть добавлены поливитамины и минеральные добавки для получения адекватного количества необходимых питательных веществ, которые теряются в некоторых диетах. Поливитамины и минеральные добавки также могут быть полезны для предупреждения заболевания и защиты от потери и дефицита питательных веществ, связанных с особенностями образа жизни.

Нутрицевтические композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть в любой из галеновых форм, которые подходят для введения в организм, в особенности, в любой форме, общепринятой для перорального введения, например, в твердых формах, таких как дополнения/добавки к пище или корму, заранее приготовленные пищевые или кормовые смеси, обогащенная пища или корм, таблетки, пилюли, гранулы, драже, капсулы и шипучие композиции, такие как порошки и таблетки, или в жидких формах, таких как растворы, эмульсии или суспензии, такие, например, как напитки, пасты и масляные суспензии. Пасты могут быть включены в капсулы с жесткой или мягкой оболочкой, жесткость оболочки определяется свойствами основы капсулы, например, такой как желатин (рыбий, свиной, куриный, коровий), растительные белки или лигнинсульфонат. Примеры других форм применения представляют собой формы, предназначенные для трансдермального, парентерального введения или введения с помощью инъекции. Диетические и фармацевтические композиции могут быть в форме композиции с контролируемым (отсроченным) высвобождением.

Примеры пищи представляют собой молочные продукты, включая, например, маргарины, пастообразные продукты, масло, сыры, йогурты или молочные напитки.

Примеры обогащенной пищи представляют собой сладкую кукурузу, хлеб, батончики из злаков, выпечку, такую как кексы и печенье, и картофельные чипсы или хрустящий картофель.

Напитки охватывают неалкогольные и алкогольные напитки, жидкие препараты также могут быть добавлены к питьевой воде и к жидкой пище. Неалкогольные напитки представляют собой, например, прохладительные напитки, напитки для спортсменов, фруктовые соки, лимонады, чаи и напитки на основе молока. Жидкая пища представляют собой, например, супы и молочные продукты. Нутрицевтическая композиция, содержащая экстракт Stevia, его компоненты или обогащенный экстракт Stevia, может быть добавлена к прохладительному напитку, питательному батончику или к конфете, так чтобы взрослый потреблял от 1 до 1000 мг, более предпочтительно 50-750 мг и наиболее предпочтительно 100-500 мг экстракта Stevia, его компонентов или обогащенного экстракта Stevia на ежедневную порцию (ежедневные порции).

Если нутрицевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию, то композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемые эксипиенты, разбавители или вспомогательные лекарственные средства. Для их создания могут быть применены стандартные методики, такие как раскрыты, например, в руководстве in Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th edition Williams & Wilkins, PA, USA. Для перорального введения предпочтительно применяют такие таблетки и капсулы, которые содержат подходящее связывающее средство, например желатин или поливинилпирролидон, подходящие наполнители, например лактозу или крахмал, подходящее скользящее вещество, например стеарат магния, и, необязательно, дополнительные добавки. Предпочтительные композиции представляют собой композиции, содержащие от 10 до 750 мг, более предпочтительно от 50 до 500 мг, экстракта Stevia или его компонентов, на введенную единицу, например на таблетку или капсулу.

Для животных, включая человека, подходящие ежедневные дозы экстракта Stevia или его компонентов, для целей настоящего изобретения, могут быть в диапазоне от 0,15 мг на кг массы тела до примерно 10 мг на кг массы тела в день. Более предпочтительные композиции представляют собой нутрицевтические композиции настоящего изобретения, которые содержат экстракт Stevia или его компоненты, предпочтительно в количестве, достаточном для введения взрослому человеку (весящему примерно 70 кг) дозы, равной от примерно 10 мг/день до примерно 750 мг/день, предпочтительно от примерно 50 мг/день до примерно 500 мг/день.

Следующие неограничивающие примеры приведены для лучшей иллюстрации изобретения.

Пример 1
Композиция и получение экстракта Stevia
Типичный водный экстракт Stevia, раскрытый в этом изобретении, содержит:
Стевиозид	приблизительно 70%
Ребаудиозиды	приблизительно 20%
Стевиол, Изостевиол	приблизительно 10%

Растертые листья Stevia rebaudiana перемешивают с горячей водой в течение 20-30 мин. Затем водный экстракт удаляют с помощью осушения, применяя давление с целью получить максимальное количество экстракта. Может быть применено несколько типов процессов экстрагирования/высушивания. Экстракт охлаждают до комнатной температуры. Для удаления частиц экстракт может быть оставлен отстаиваться до тех пор, пока твердые частицы не осядут, или их можно отделить центрифугированием. Экстракт затем высушивают или с помощью распылительной сушки, или с помощью лиофилизации. Этот экстракт содержит основы, придающие сладкий вкус, растительные пигменты и другие водорастворимые компоненты.

Экстракт Stevia («экстракт листьев Stevia, 85%-ный порошок»; номер по каталогу S1964), примененный в следующих примерах, получали от компании «Spectrum Laboratory Products Inc.», Gardena, CA, США.

Пример 2

Ингибирование глицинового переносчика-1 в исследованиях на клетках

СНО-клетки, стабильно экспрессирующие кДНК переносчика глицина 1b (GlyT1) человека, выращивали по стандартной методике в среде Игла, модифицированной по Дульбекко («Invitrogen», Carlsbad, США), содержащей 10%-ную диализованную фетальную телячью сыворотку, пенициллин, стрептомицин, пролин и антибиотик G418. Клетки собирали с помощью трипсинизации за один день до исследования и пересевали в вышеописанную среду. Непосредственно перед исследованием среду заменяли буфером поглощения, содержавшим 150 мМ Nad, 1 мМ CaCl₂, 2,5 мМ КС1, 2,5 мМ MgCl₂, 10 мМ глюкозу и 10 мМ Н-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES-буфер).

Поглощение глицина клетками определяли путем добавления 60 нМ меченного радиоизотопом [ ³H]-глицина (Amersham Biosciences GE Healthcare, Slough, UK) и инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре. После удаления невключившейся метки с помощью мягкого трехкратного отмывания в вышеописанном буфере поглощенный глицин количественно определяли с помощью жидкостного сцинтилляционного измерения.

Поглощение глицина через GlyT1-переносчик ингибировали добавлением экстракта Stevia дозо-зависимым образом. Саркозин, ORG24598 и ALX5407 (все реактивы поставлены компанией «Sigma», St. Louis, США) применяли в качестве известных ингибиторов GlyT1. Полученные величины IС₅₀ ингибирования поглощения глицина (экстракт Stevia, компоненты экстракта и контрольные соединения) и типичная кривая доза-ответ (экстракт Stevia) приведены в таблице 2 и на фигуре 1 соответственно.

Таблица 2
Полученные величины IС50 ингибирования поглощения глицина в СНО-клетки экстрактом Stevia и его основными компонентами: стевиолом, изостевиолом и стевиозидом, в дополнении к контрольным соединениям: саркозину, ORG24598 и ALX5407. Данные представлены как среднее±станд. ош. средн. (если эксперименты проводили больше одного раза); IС50 выражено в мкг/мл для экстракта и в мкМ для чистого соединения.
Вещество	IC50 для поглощения меченого глицина
Экстракт Stevia (композиция по примеру 1)	45±6,9 мкг/мл
Стевиол («Chromadex»; Cat. No. ASB-000193 52-025)	неактивен
Изостевиол («Wako Chemicals»; Cat. no. 090-02341)	неактивен
Стевиозид («Indofme Chemical Co.»; Cat. no. 023718)	неактивен
Саркозин («Sigma»; Cat. no. S7672)	35,9 мкМ
ORG24598 («Sigma»; Cat. no. 07639)	0,02 мкМ
ALX5407 («Sigma»; Cat. no. A8977)	6,46 нМ
Ребаудиозид А	неактивен
Gingko biloba («Huisong Pharmaceuticals», GB 102-070116)	Неактивен

Пример 3 Культуры срезов гиппокампа

Семидневных крыс Wistar декапитируют с помощью гильотины. Менее чем через 1 минуту вскрывают череп, отделяют и извлекают полушария головного мозга, оба гиппокампа вырезают и переносят в охлажденный на льду буфер, содержащий 137 мМ NaCl, 5 мМ КС1, 0,85 мМ Na₂ HPO₄, 1,5 мМ СаСl₂ 0,66 мМ КН₂ РO₄, 0,28 мМ MgSO₄, 1 мМ MgCl₂ , 2,7 мМ NaHCO₃, 1 мМ кинуреновой кислоты и 0,6% D-глюкозы.

Поперечные срезы гиппокампа (400 мкм) получают с помощью микротома с вибрирующим ножом (VT1200S; «Leica Microsystems» (Schweiz) AG, Heerbrugg, Швейцария) в том же буфере. Срезы гиппокампа, каждый по отдельности, помещали на мембранные вставки (Millicell Culture Plate Inserts, 0,4 мкМ) и культивировали при 35°С, в 5%-ном CO₂, при 95%-ной влажности в среде, содержавшей смесь ВМЕ и MEM (все реактивы компании «Invitrogen») в отношении 1:1, которая содержала 25%-ную термоинактивированную лошадиную сыворотку, lx GlutaMAX, lx пенициллин/стрептомицин, 0,6%-ную глюкозу и 1 мМ кинуреновую кислоту (Stoppini 1991 J. Neurosci. Methods 37(2): 173-82).

После 48 часов культивирования синаптические NMDA-рецепторы активировали добавлением экстракта Stevia, его основных компонентов или контрольных веществ в течение 15 мин в 140 мМ NaCl, 5 мМ КСl, 1,3 мМ CaCl₂ , 25 мМ HEPES (рН 7,3), 33 мМ D-глюкозе и 0,02 мМ бикукуллина метиодиде. Саркозин (100 мкМ) и ALX5407 (20 нМ) применяли стандартно в качестве позитивных контролей. Дополнительный позитивный контроль включал добавление 200 мкМ глицина к парной культуре. После обработки срезы промывают и фиксируют для иммуногистохимии. Проводят количественную оценку маркеров возросшей синаптической активности, в норме связанных с долговременной потенциацией и представляющих собой ex vivo модель способности к обучению и запоминанию (смотри таблицу 3, приведенную ниже).

Таблица 3
Относительная активация синаптических маркеров после обработки экстрактом Stevia или каким-либо из соединений, представляющих собой его компоненты (стевиол, изостевиол, стевиозид и ребаудиозид А), в сравнении с парными культурами, в которые добавляли только буфер. Активацию любого из этих маркеров (или их комбинации) регистрировали в классических LTP экспериментах.
Вещество	pCREB	рМАРК	GluRl
Экстракт Stevia	±	+	255%
Стевиол	++	±	340%
Изостевиол	+	±	361%
Стевиозид	±	++	±
Ребаудиозид А	±	±	±
Гинкго билоба	±	+	±

++++показывает качественно оцененную максимальную активацию, ++ и + обозначают полумаксимальную и умеренную активацию, соответственно, тогда как ± указывает на отсутствие изменений в иммунореактивности; для GluR1, величины приведены в виде процента увеличения от контрольной величины.

Обработка культур гиппокампа экстрактом Stevia, стевиолом, изостевиолом и стевиозидом индуцирует один или несколько биохимических маркеров, типичных для LTP (pCREB: активированная форма сАМР-зависимого элемента связывающего белка; рМАРК: активированная форма митоген-активируемой протеинкиназы; GluRl: присутствующий на клеточной поверхности АМРА-рецептор 1).

Пример 4

Влияние экстракта Stevia в трех традиционных моделях по определению способности к обучению и запоминанию:

1 - Тест на спуск с высоты

Мыши проходили тест на спуск с высоты, который представляет собой методику анализа ассоциативной способности к обучению и запоминанию. Мышей поодиночке помещали в испытательную камеру, на дне которой находилась решетка, по которой пропускали электрический ток, мощностью 36V. При получении животными удара электрическим током, их нормальной реакцией, для того, чтобы избежать болевого воздействия, было запрыгнуть на изолированную платформу. Так, большинство животных, спустившихся на решетку, после получения удара электрическим током будет быстро запрыгивать обратно на платформу. В день 0, животных тренировали в течение 5 мин и отмечали то, сколько раз каждая мышь получала удар током, т.е. делала ошибку. Эти данные представляют собой данные по способности к обучению. Мышей повторно тестировали через 24 часа (день 1, тренировочный день) и через 48 часа (день 2, день тестирования) с помощью таких же испытаний, которые служили в качестве теста на память. Регистрировали число животных, получивших удар током, в каждой группе, время до первого спуска с платформы (латентный период) и число ошибок в первые 3 мин. Через шесть дней после завершения тренировок, на день 8, тестировали угасание памяти (тест на выведение препарата из организма).

Исследование включало шесть тестируемых групп (n=12 на группу). Всем мышам вводили тестируемые вещества или растворитель посредством ежедневного перорального кормления через желудочный зонд (10 мл/кг) в течение 30-ти дней перед обучением животных. Экстракт Stevia тестировали в 3-х дозах, 50 (низкая), 150 (средняя) и 450 (высокая) мг/мкг, тогда как препарат сравнения, Гинкго билоба, вводили в дозе, равной 100 мг/мкг. Фармакологический позитивный контроль, ролипрам (0,1 мг/мкг), вводили с помощью внутрибрюшинной инъекции за 30 мин до тестирования.

При сравнении с однопометными животными, получавшими растворитель (негативный контроль), все группы животных, получавшие Stevia, демонстрировали существенно лучшую способность к обучению и поведению, связанному с запоминанием, на протяжении фаз тренировки, запоминания и после периода выведения препарата из организма, как было показано по снижению в частоте появления ошибок (фигура 2а). Кроме того, во время фазы тренировки мыши, получавшие Stevia (в дозе 50 мг/мкг), вели себя так же, как мыши, которым вводили препарат сравнения, Гинкго билоба, и лучше, чем мыши, получавшие ролипрам; за время фазы тестирования экстракт Stevia, введенный во всех трех дозах, приводил к поведению, похожему на то, которое наблюдали в обеих группах мышей, получавших как Гинкго билоба, так и ролипрамом; за время фазы выведения препарата из организма мыши, которым вводили низкие и промежуточные дозы экстракта Stevia, снова вели себя так же, как мыши, получавшие препарат сравнения и позитивный контроль, тогда как самая высокая доза Stevia индуцировала значимо лучшее поведение, чем демонстрировали мыши, получавшие Гинкго.

За время фазы тестирования латентный период значимо увеличился у мышей, которым вводили промежуточную дозу экстракта Stevia, по сравнению с получавшими растворитель контрольными мышами. Кроме того, этот эффект был эквивалентен эффекту, наблюдаемому у мышей, получавших ролипрам. За время фазы выведения препарата из организма самая высокая доза экстракта Stevia индуцирует значимое увеличение латентного периода по сравнению как с контрольными мышами, получавшими растворитель, так и с мышами, которым вводили экстракт Гинкго билоба (фигура 2b).

Таким образом, суммируя, с помощью экстракта Stevia возможно улучшать способность к обучению и поведению, связанному с запоминанием, до такой же степени или даже до большей степени, как с помощью природного вещества, взятого для сравнения, Гинкго билоба, так и с помощью соединения, взятого в качестве фармацевтического позитивного контроля, ролипрама.

Фигура 2а: Частота возникновения ошибок в тесте на спуск с высоты; а: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода обучения. b: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода проведения тестирования, с: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода выведения препарата из организма, d: значимо отличается от мышей, получавших Гинкго билоба в течение периода выведения препарата из организма. Во всех случаях, значимость обозначают как р<0,05. Эти данные показывают, что мыши, получавшие Stevia, не только лучше обучаются, чем мыши в других группах, но также сохраняют свою память в течение более продолжительного периода времени.

Фигура 2b показывает результаты поведенческого тестирования по спуску с высоты; продолжительность латентного периода до избегания удара электрическим током b: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода проведения тестирования, с: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода выведения препарата из организма, d: значимо отличается от мышей, получавших Гинкго билоба в течение периода выведения препарата из организма. Во всех случаях, достоверность обозначают как р<0,05. Таким образом, мыши, получавшие 150 мг/мкг экстракт Stevia, демонстрируют значимо лучшую способность к обучению и характеристики запоминания, чем их контроли в той же возрастной группе, тогда как мыши, получавшие Stevia в самых больших дозах, выполняли задание лучше, чем и контрольные мыши в той же возрастной группе, и лучше, чем мыши позитивных контролей, получавшие Гинкго билоба.

Пример 5

Влияние экстракта Stevia в трех традиционных моделях на грызунах по определению способности к обучению и запоминанию:

2 - Водный лабиринт Морриса

Водный лабиринт Морриса представляет собой один из наиболее распространенных подходов для тестирования пространственной памяти у грызунов. Мышей вынуждают плавать в круглом бассейне и искать спрятанную платформу путем применения визуальных ориентиров в экспериментальном помещении.

В этом эксперименте применяли те же дозы и такое же время обработки, как в постановке в тесте на спуск с высоты.

Водный лабиринт Морриса (диаметр=1,5 м), примененный в этом исследовании, включает спрятанную платформу (10 см × 10 см), расположенную в 10 см от края бассейна в северном квадранте (на «10 часах»). В день 0 мышей акклиматизируют на тестируемой арене, и они получают два тренировочных испытания, во время которых они учатся подплывать к платформе.

В дни от 1-го до 3-го платформу удаляют из водного лабиринта и мыши получают два тренировочных испытания в день. После каждого испытания (90 сек) платформу помещают обратно в то же самое место и дают мышам возможность найти ее и залезть на нее. Эта процедура подтверждает то, что мыши эффективно выучили положение платформы в каждый из дней тренировки и вспоминают положение платформы при последующих испытаниях. Регистрировали начальное время обнаружения той области, где помещалась платформа (начальное время пересечения платформы; FCPT) и число раз, которое мыши переплывали область, где помещалась платформа (число пересечений), и рассчитывали среднее число баллов для каждого дня тренировок (дни от 1 до 3: баллы, полученные при тренировках). На день 4 мыши дополнительно получали два испытания, результаты которых представляли собой баллы, полученные при тестировании.

На день 1 тренировочной сессии мыши, которым вводили самые низкие дозы Stevia, демонстрировали значимо лучшие характеристики, чем контрольные мыши, получавшие растворитель, и чем мыши, которым вводили соединение, представляющее собой положительный контроль, ролипрам (фигура 3а). На день 4, во время тестовых испытаний, мыши, получавшие средние и высокие дозы Stevia, продемонстрировали значимо более короткий латентный период по сравнению с контрольными животными той же возрастной группы (фигура 3b). Таким образом, эти данные указывают на то, что обработка экстрактом Stevia влияет как на способность мышей к обучению, так и на характеристики запоминания, и что этот эффект зависит от примененной дозы.

Фигура 3а показывает латентный период в обнаружении на предыдущей позиции скрытой платформы в водном лабиринте Мориса в период обучения, а: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение первого дня, подчеркивая тот факт, что обработка в низких дозах экстрактом Stevia (50 мг/мкг) значимо улучшает способность животных к обучению. Значимость обозначают как р<0,05.

Фигура 3b показывает латентный период в обнаружении скрытой платформы на предыдущей позиции в водном лабиринте Мориса в день тестирования (день 4). а: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе, показывая, что обработка экстрактом Stevia в промежуточных (150 мг/мкг) и высоких (450 мг/мкг) дозах значимо улучшает характеристики запоминания животных до той же степени, как у мышей, которым вводили препарат сравнения, Гинкго билоба, и в большей степени, чем у животных, получавших ролипрам. Значимость обозначают как р<0,05.

Пример 6

Влияние экстракта Stevia в трех традиционных моделях на грызунах по определению способности к обучению и запоминанию:

3 - Тест в челночной камере

Идея, заложенная в этом тесте на животных, заключается в активном уклонении от неблагоприятных стимулов. Одна часть челночной камеры оборудована решеткой, на которую подается электрический ток. Удару электрическим током предшествует звуковой сигнал (шум в форме коротких тональных посылок, длящийся 7 сек). Животное должно научиться перебегать к другой стороне челночной камеры, пересекая при этом луч инфракрасного света.

В этом эксперименте применяли те же дозы и такое же время обработки, как в постановке теста на спуск с высоты.

Мышей тренировали один раз в день в течение 5-ти дней. Программа тренировок включала 15 сессий; каждая сессия включала (1) 15 сек паузу, (2) 7 сек звуковой сигнал («пикающий период») и (3) 8 сек удар электрическим током («стимулирующий период»). Если мышь пересекала один из двух инфракрасных лучей в каждом углу челночной камеры в течение пикающего или стимулирующего периода, ее переводили на следующую секцию. Число активных избеганий (пикающий период) и число пассивных избеганий (стимулирующий период) регистрировали и рассчитывали общее число избеганий. Если мышь не пересекала инфракрасные лучи в течение пикающего периода, ее записывали как ошибку. Ошибки и число избеганий, зарегистрированные на день 4, брали в качестве баллов, полученных в период тренировок, на день 5 в качестве баллов, полученных в период тестирования, и на день 8 в качестве баллов, полученных в период угасания сигнала.

За время фазы тестирования (день 5) самая высокая доза экстракта Stevia индуцирует значимо меньшее число ошибок по сравнению с контрольными мышами, получавшими растворитель; влияние на частоту возникновения ошибок равно частоте, наблюдаемой у мышей из положительного контроля, получавших ролипрам. Кроме того, средние и высокие дозы экстракта Stevia значимо снижают число избеганий по сравнению с мышами, получавшими как растворитель, так и Гинкго билоба. Таким образом, эти данные опять указывают на то, что обработка экстрактом Stevia влияет на эффективность обучения мышей, и на то, что этот эффект зависит от примененных доз.

Фигура 4а показывает частоту появления ошибок в челночной камере: а: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода проведения тестирования. b: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода угасания рефлекса. Значимость обозначают как р<0,05. Таким образом, в течение периода проведения тестирования в самых больших протестированных дозах, животные, получавшие Stevia, демонстрировали значимо лучшие характеристики запоминания по сравнению с получавшими растворитель однопометными животными, и эквивалентное поведение по сравнению с мышами, которым вводили соединение, представляющее собой положительный контроль, ролипрам.

Фигура 4b показывает число избеганий в челночной камере: а: значимо отличается от получавших растворитель однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода проведения тестирования. b: значимо отличается от получавших Гинкго билоба однопометных животных в той же возрастной группе в течение периода проведения тестирования. Значимость обозначают как р<0,05. Эти результаты показывают, что мыши, получавшие Stevia (в дозах, равных 150 и 450 мг/мкг), обучились избегать электроболевого раздражения, они вели себя лучше, и чем контрольные мыши, получавшие растворитель, и чем мыши, которым вводили препарат сравнения, Гинкго билоба.

Пример 7

Влияние экстракта Stevia в новой, полностью автоматизированной модели по определению способности к обучению и запоминанию

Когнитивное поведение мышей, получавшие экстракт Stevia или Гинкго билоба, сравнивали с поведением контрольных мышей в тех же возрастных группах, получавших растворитель, в камере IntelliCage®, системе, которая позволяет автоматически следить за спонтанным поведением мышей и определять способность мышей к обучению в окружении, похожем на обстановку в клетке, где постоянно содержатся животные («NewBehavior AG», Zurich, Швейцария, www.newbehavior.com: Galsworthy et al. 2005, Behav Brain Res 157: 211-217; Onishchenko et al. 2007, Toxicol Sci 97: 428-437). Отдельных мышей распознавали с помощью сенсоров в углах камеры IntelliCage, считывающих сигнал-ответчик (идентификационной метки сравнения), которую имплантировали в загривок на шее мыши. Каждая камера IntelliCage® представляет собой достаточно просторную клетку (37,5 × 55 × 20,5 см), внутри которой помещают металлическую рамку, включающую четыре регистрирующие (оперантные) ячейки. Регистрирующие ячейки встраивают в углы клетки, каждая покрывает область поверхности пола в форме треугольника с прямым углом, размером в 15×15×21 см. В клетку помещают антенну, способную автоматически отслеживать посещение углов каждой индивидуальной мышью; лучи фотоэлементов, находящихся в каждом углу, способны автоматически регистрировать момент, когда отдельная мышь просунет свой нос в этот угол и будет облизывать горлышко бутылки. Четыре треугольных укрытия для мышей помещали в центр клетки, над которыми была расположена кормораздаточная воронка, обеспечивающая доступ к пище adiibitum.

Каждая регистрирующая ячейка включала: (1) пластиковое кольцо (30 мм внутренний диаметр), которое служило входом в ячейку и домики, круговую антенну, которая регистрировала посещения угла; (2) решетчатый пол, на котором мыши сидели, после проникновения в ячейку; (3) два круглых отверстия (13 мм в диаметре), которые делали возможным доступ к горлышкам бутылок с водой; каждое отверстие пересекали лучи фотоэлемента, который регистрировал ситуацию, когда мышь засовывала туда свой нос; (4) две двери с моторчиком, которые позволяли (дверь открыта) или запрещали (дверь закрыта) доступ к горлышкам бутылок с водой; (5) две бутылки с водой; (6) трубопровод, по которому можно было вдувать воздух в качестве негативного раздражителя; (7) светодиоды различного света, которые могут быть применены для условий экспериментов.

Экспериментальная фаза:

Исследование включает три тестируемые группы (n=12-14 на группу): растворитель (контроль), Гинкго билоба (100 мг/мкг) и экстракт Stevia (450 мг/мкг). Всем мышам вводили тестируемые вещества или растворитель путем ежедневного перорального кормления через искусственный зонд (10 мл/кг) на протяжении 8-недельного исследования.

В течение начального адаптационного периода (4-5 дня) мыши имели свободный доступ ко всем углам, воде и корму и могли свободно изучать клетки. Затем мыши должны были научиться просовывать нос (модуль адаптации к просовыванию носа, 3 дня); все двери были исходно закрыты (доступ к воде был запрещен), и мыши должны были просовывать нос для того, чтобы открыть дверь и достичь горлышек бутылок с водой. Собранные данные включают несколько параметров, таких как наименее предпочтительный угол для каждой индивидуальной мыши, который отмечали для программирования следующих модулей.

Распознавание объекта

Для исследования собственной исследовательской активности мышей, два идентичных объекта помещали в углы 1 и 2 или в углы 3 и 4, которые включали наименее предпочтительный угол для каждой группы соответственно. Животные имели возможность свободно использовать клетки с полным доступом к воде и корму. Визиты регистрировали за 3 часа до и через 3 часа после того, как появились объекты. Образцы посещения контрольной группы не изменились после появления объектов в углах 1 и 2, тогда как обработка Гинкго билоба и Stevia приводила к значимому увеличению в продолжительности посещения углов, содержащих новые объекты (углы 4 и 2 соответственно) (фигура 5). Таким образом, постоянное введение экстракта Stevia значимо увеличивает исследовательскую активность мышей, до той же степени, как и введение Гинкго билоба.

Фигура 5 показывает продолжительность посещения каждого угла за 3 часа до и через 3 часа после того, как появились объекты. Стрелки указывают на положение объекта. Гинкго билоба и экстракт Stevia значимо увеличивали продолжительность посещения углов, содержащих новые объекты, по сравнению с контрольными мышами, получавшими растворитель (р=0,004 и р=0,005 соответственно). Обе обработки, таким образом, увеличивают исследовательскую активность мышей в тесте по распознаванию объекта.

Различение сторон

Этот модуль проводят для того, чтобы протестировать внимание и ассоциативную память. Один правильный угол был назначен для каждой мыши. В этом углу только одна сторона (из двух) была задана в качестве правильной стороны, и на это животному было указано с помощью зеленого LED. В правильной стороне животные могли просунуть нос и затем пить из бутылки с водой. Во время проведения этого модуля регистрировали ошибки места (т.е. процент посещения неправильных углов) и ошибки стороны (т.е. процент тыканья носом в неправильную сторону правильного угла).

Эти данные показали, что после постоянной обработки экстрактом Stevia улучшается внимание, поскольку частота возникновения ошибок при поиске места (фигура 6) и частота возникновения ошибок при определении стороны (фигура 7) были значимо ниже таковых, как для мышей, получавших растворитель, так и для мышей, получавших Гинкго билоба, на протяжении первых 12-ти часов (активная фаза) тестирования.

Фигура 6 показывает частоту возникновения ошибок при поиске места (процент посещения неправильных углов). Обработка экстрактом Stevia приводит к значимому снижению процента частоты возникновения ошибок по сравнению как с контрольными мышами, получавшими растворитель, так и с мышами, которым вводили Гинкго билоба (р=0,012 и р=0,017 соответственно). Этот эффект наблюдали с момента начала модуля, он сохранялся в течение первых 12-ти часов (активная фаза) и показал, что обработка с помощью Stevia приводит к повышению уровня внимания и улучшению характеристик запоминания.

Фигура 7 показывает частоту возникновения ошибок при определении стороны (процент тыканья носом в неправильную сторону правильного угла). Экстракт Stevia снова индуцирует значимое снижение процента частоты возникновения ошибок по сравнению как с контролем, получавшим растворитель, так и с мышами, получавшими Гинкго билоба (р=0,002 и р=0,035 соответственно). Этот эффект наблюдали с момента начала модуля, он сохранялся в течение первых 12-ти часов (активная фаза) и указывал на улучшение внимания и памяти у мышей, получавшие Stevia.

Таким образом, результаты, полученные с помощью экспериментов в автоматизированной клетке IntelliCage®, подтвердили поведенческие результаты, полученные с помощью классических тестов (Примеры 4, 5 и 6), в отношении того, что обработка экстрактом Stevia в течение 8-ми недель приводит к значимому улучшению способности к обучению и запоминанию у мышей при сравнении с однопометными животными, получавшими растворитель. В некоторых случаях, улучшение в поведении, наблюдаемое у мышей, получавших Stevia, было даже сильнее, чем у мышей, которым вводили как природное вещество сравнения, Гинкго билоба, так и ролипрам, соединение, представлявшее собой позитивный фармацевтический контроль.

Пример 8

Получение мягкой желатиновой капсулы

Мягкая желатиновая капсула может быть получена путем включения следующих ингредиентов:

Ингредиент	Количество на капсулу
Экстракт Stevia (лиофильная сушка/сушка распылением)	200 мг
Лецитин	50 мг
Соевое масло	250 мг

Взрослый человек может получать две капсулы в день в течение 3-х месяцев. Видно, что происходит улучшение когнитивной функции, восприимчивости и способности фокусироваться на работе.

Пример 9

Получение растворимого ароматизированного прохладительного напитка

Ингредиент	Количество [г]
Экстракт Stevia	0,5
Сахароза, тонкоизмельченный порошок	763,1
Аскорбиновая кислота, тонкоизмельченный порошок	2,0
Лимонная кислота, безводный порошок	55,0
Лимонный ароматизатор	8,0
Тринатрия цитрат безводный порошок	6,0
Трехзамещенный фосфат кальция	5,0
-Каротин 1% CWS от компании DNP AG, Kaiseraugst, Швейцария	0,4
Общее количество	840

Все ингредиенты перемешивали и просеивали через сито с размером отверстий, равным 500 мкм. Полученный порошок помешали в подходящий контейнер и перемешивали в цилиндрическом смесителе в течение по меньшей мере 20 минут. Для приготовления напитка 105 г полученного перемешанного порошка перемешивают с достаточным количеством воды и получают один литр напитка.

Готовый к употреблению прохладительный напиток содержит приблизительно 15 мг обогащенного экстракта Stevia на порцию (250 мл). В качестве укрепляющего средства и как средство для улучшения самочувствия можно выпивать 2 порции в день (500 мл). Видно, что происходит улучшение когнитивной функции, восприимчивости и способности фокусироваться на работе.

Пример 10

Получение обогащенного, не подвергнутого термической обработке крупяного батончика

Ингредиент	Количество [г]
Экстракт Stevia	0,3
Вода	54,0
Соль	1,5
Сироп глюкозы	130,0
Инвертированный сахарный сироп	95,0
Сироп сорбитола	35,0
Пальмоядровое масло	60,0
Жир для выпечки	40,0
Лецитин	1,7
Отвержденное пальмовое масло	2,5
Высушенные и нарезанные яблоки	63,0
Кукурузные хлопья	100,0
Рисовые хрустящие хлопья	120,0
Пшеничные хрустящие хлопья	90,0
Жареный фундук	40.0
Порошковое обезжиренное молоко	45,0
Яблочный ароматизатор 74863-33	2,0
Лимонная кислота	5,0
Общее количество	885

Обогащенный экстракт Stevia предварительно смешивают с порошковым обезжиренным молоком и помещают в тестомесильную машину с планетарными дежами. Добавляют кукурузные хлопья и рисовые хрустящие хлопья и все бережно перемешивают. Затем добавляют высушенные и нарезанные яблоки. В первом сосуде для варки пищи перемешивают воду и соль в указанном выше количестве (раствор 1). Во втором сосуде для варки пищи перемешивают глюкозу, сиропы из инвертированного сахара и сорбитола в указанном выше количестве (раствор 2). Составляющие жирной фазы представляют собой смесь жира для выпечки, пальмоядровое масло, лецитин и эмульгирующее средство. Раствор 1 нагревают до 110°С. Раствор 2 нагревают до 113°С и затем охлаждают на бане с холодной водой. Затем растворы 1 и 2 объединяют. Жирную фазу расплавляют при 75°С на бане с водой, затем добавляют к объединенной смеси растворов 1 и 2. Яблочный ароматизатор и лимонную кислоту добавляют к жидкой смеси сахара/жиры. Жидкую массу добавляют к сухим ингредиентам и хорошо перемешивают в тестомесильной машине с планетарными дежами. Массу помещают на мраморную плиту и раскатывают до желаемой толщины. Массу охлаждают до комнатной температуры и нарезают на кусочки. Неподвергнутый термической обработке крупяной батончик содержит приблизительно 10 мг обогащенного экстракта Stevia на порцию (30 г). Для улучшения общего самочувствия и придания бодрости можно съедать 1-2 крупяных батончика в день. Видно, что происходит улучшение когнитивной функции, восприимчивости и способности фокусироваться на работе.

Пример 11

Сухой корм для собак, содержащий экстракт Stevia

Коммерческий корм, включающий основной рацион для собак (например, Мега Dog «Brocken», MERA-Tiemahrung GmbH, MarienstraBe 80-84, D-47625 Kevelaer-Wetten, Германия), опрыскивают раствором экстракта Stevia в воде вместе с антиоксидантами, такими как витамин С (например, ROVIMIX® C-EC from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария) и его производные, т.е. аскорбилмонофосфат натрия (например, STAY-C® 50 from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария) или смесь три-, ди- и монофосфорных эфиров натрия/кальция L-аскорбата (например, ROVIMIX® STAY-С® 35 от компании DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария) в количестве, достаточном для введения собаке в ежедневной дозе, равной 4 мг экстракта Stevia на кг массы тела. Пищевую композицию высушивают до содержания сухого вещества, равного примерно 90% по массе. Для средней собаки с массой тела, равной 10 кг и поглощающей приблизительно 200 г сухого корма в день, корм для собак содержит приблизительно 200 мг экстракта Stevia на кг корма. Для более тяжелых собак кормовую смесь готовят соответственно. Для снижения стресса, страха и агрессивности у собак корм могут подавать собакам в питомниках регулярно. Перед визитом к ветеринару или пребыванием в ветеринарной клинике или разлукой на праздники корм дают, по меньшей мере, за неделю до события, вызывающего напряжение, во время этого события и в течение одной недели после него.

Пример 12

Влажный корм для кошек, содержащий экстракт Stevia

Коммерческий корм, включающий основной рацион для кошек (например. Happy Cat «Adult», Tierfeinnahrung, Siidliche HauptstraBe 38, D-86517 Wehringen, Германия), перемешивают с раствором экстракта Stevia в воде, вместе с антиоксидантами, такими как витамин С (например, ROVIMIX® C-EC from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария) и его производные, т.е. аскорбилмонофосфат натрия (например, STAY-C® 50 from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария) или смесь три-, ди- и монофосфорных эфиров натрия/кальция L-аскорбата (например, ROVIMIX® STAY-C® 35 from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария), в количестве, достаточном для введения кошке в ежедневной дозе, равной 4 мг экстракта Stevia на кг массы тела. Для средней кошки с массой тела, равной 5 кг и потребляющей приблизительно 400 г влажного корма, корм для кошек содержит 50 мг экстракта Stevia на кг корма. Пищевую композицию высушивают до содержания сухого вещества, равного примерно 90% по массе. Для снижения стресса, страха и агрессивности у кошек корм можно давать кошкам в питомниках регулярно. Перед визитом к ветеринару или пребыванием в ветеринарной клинике корм дают, по меньшей мере, за неделю до события, вызывающего напряжение, во время этого события и в течение одной недели после него.

Пример 13

Корм для собак, содержащий экстракт Stevia

Коммерческий корм для собак (например, Mera Dog «Biscuit» для собак as supplied by Mera Tiemahrung GmbH, Marienstrasse 80-84, 47625 Kevelaer-Wetten, Германия) опрыскивают раствором экстракта Stevia в воде, вместе с антиоксидантами, такими как витамин С (например, ROVIMIX® C-EC from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария) и его производные, т.е. аскорбилмонофосфат натрия (например, STAY-C® 50 from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария) или смесь три-, ди- и монофосфорных эфиров натрия/кальция L-аскорбата (например, ROVIMIX® STAY-C® 35 from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария), в количестве, достаточном для введения в лакомство 0,5-5 мг экстракта Stevia на г лакомства. Пищевую композицию высушивают до содержания сухого вещества, равного примерно 90% по массе. Для снижения страха и напряжения лакомство можно давать в течение дня как дополнение к корму или когда кормление не гарантировано, т.е. во время путешествия, до 5-ти раз в день.

Пример 14

Корм для кошек, содержащий экстракт Stevia

Коммерческий корм для кошек (например, Whiskas Dentabits для кошек, такой как поставляется компанией «Whiskas», Masterfoods GmbH, Eitzer Str. 215, 27283 Verden/Aller, Германия) опрыскивают раствором экстракта Stevia в воде, вместе с антиоксидантами, такими как витамин С (например, ROVIMIX® C-EC from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария) и его производные, т.е. аскорбилмонофосфат натрия (например, STAY-C® 50 from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария) или смесь три-, ди- и монофосфорных эфиров натрия/кальция L-аскорбата (например, ROVIMIX® STAY-С® 35 from DSM Nutritional Products Ltd, Kaiseraugst, Швейцария), в количестве, достаточном для введения в лакомство 0,5-5 мг экстракта Stevia на г лакомства. Пищевую композицию высушивают до содержания сухого вещества, равного примерно 90% по массе. Для снижения страха и напряжения лакомство можно давать в течение дня как дополнение к корму или когда кормление не гарантировано, т.е. во время путешествия, до 5-ти раз в день.