способ защиты организма от инфекции, вызванной штаммами субтипа h1n1 вируса гриппа а препаратом на основе альфа-2 интерферона человека

Формула изобретения

1. Способ защиты организма от инфекции, вызванной штаммами субтипа H1N1 вируса гриппа А, включающий введение в организм препарата альфа-2 интерферона человека, отличающийся тем, что в качестве препарата альфа-2 интерферона человека используют «Реаферон ЕС-Липинт», полученный включением рекомбинантного альфа-2 интерферона в липосомы, который вводят в организм сублингвально или перорально в разовой дозе от 10000 до 30000 МЕ/кг веса.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при профилактике инфекции препарат принимают один раз в сутки два раза в неделю в течение 1 месяца.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что при лечении инфекции препарат принимают 2 раза в сутки через 12 часов ежедневно в течение 3-5 дней.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что препарат назначают за 30 мин до еды взрослым и детям старше 15 лет - при профилактике заболеваний в дозе 20000 МЕ/кг, при лечении - по 30000 МЕ/кг, а детям с 3-х до 15 лет при профилактике заболеваний препарат назначают в дозе 10000 МЕ/кг и лечении - по 15000 МЕ/кг.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, иммунологии, фармакологии, и касается способа защиты от инфекции, вызванной штаммами субтипа H1N1pdm09 вируса гриппа А препаратом на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона человека в липосомальной форме, обладающего противовирусным действием.

Проблема профилактики и лечения гриппа, вызванного штаммами субтипа H1N1, актуальна в связи с тем, что на протяжении всего периода слежения за этой инфекцией субтип H1N1 практически всегда циркулировал в популяции людей. Благодаря наличию белка NS1, который может функционировать как антагонист интерферона, вирус гриппа при размножении может подавлять продукцию этого цитокина [Hale BG, Randall RE, Ortin J, Jackson D: The multifunctional NS1 protein of influenza A viruses. J Gen Virol 2008, 89:2359-2376]. В связи с этим введение эндогенного интерферона эффективно корректирует течение заболевания, уменьшая осложнения и нежелательные последствия болезни и снижая тяжесть и риск летального исхода. Таким образом, заболевания, вызываемые новыми штаммами вируса гриппа субтипа H1N1 с мутациями в NS1 белке, определяющими устойчивость к интерферонам, могут корректироваться интерферонсодержащими препаратами.

В 2009 году мир охватила пандемия, вызванная новым вариантом вируса гриппа субтипа H1N1. Новый вариант пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 является тройным реассортантом возбудителей классического гриппа свиней (HA, NP, NS гены) гриппа свиней Евразийской линии (М ген), гриппа птиц (PB2 и PA гены) и человека (PB1).

В связи с тем, что ранее штаммы вируса гриппа A(H1N1)pdm09 не циркулировали в популяции людей, защиты к этому варианту вируса гриппа у людей нет. Заболевание имеет, как правило, тяжелое течение, и у людей из групп риска может окончиться летальным исходом. По данным официальной статистики за период эпидемии (октябрь-декабрь 2009 г.) в России переболело гриппом и ОРВИ (суммарно) 13,26 млн человек, что на 5,82 млн больше, чем за аналогичный период 2008 года, когда эпидемия гриппа не была зарегистрирована, что составляет 4,09% от общей численности населения. В ряде регионов удельный вес переболевших составил от 6 до 11%. По данным официальной статистики в Российской Федерации в 2009 г. зарегистрировано более 33,3 млн случаев заболеваний острыми инфекциями верхних дыхательных путей множественной и неуточненной локализации, в 2010 году - более 28 млн случаев, в 2011 году - более 30 млн случаев. Диагноз «грипп» был поставлен в 2009 году у 592516 человек, в 2010 году - у 27346 человек, в 2011 году - у 309510 человек [О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2009 году: Государственный доклад. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. - 456 с.; О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2010 году: Государственный доклад. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011. - 431 с.; О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2011 году: Государственный доклад. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2012. 316 с.].

В общей сложности в 2009-2010 гг. количество летальных случаев от пандемического гриппа (лабораторно подтвержденных) в мире составило более 17,4 тыс. (по данным ВОЗ, ECDC, CDC). Наиболее пострадавшими регионами признаны Американский (более 8,1 тыс. летальных исходов) и Европейский (более 4,6 тыс. летальных исходов) [Письмо № 01/5578-10-32 от 13.04.2010 Роспотребнадзора «Об итогах пандемии гриппа A/H1N1/09 в мире и Российской Федерации в эпидсезон 2009-2010 гг. и прогнозе на эпидсезон 2010-2011 гг.»].

Характерной особенностью вируса гриппа A(H1N1)pdm09 является то, что даже при исходно маловыраженной симптоматике грипп A(H1N1)pdm09 может очень быстро трансформироваться в смертельное заболевание (в течение 24 часов или менее) [Кутсар К. Пандемический грипп (H1N1) 2009 в Европе. ЭпиНорт. 2010; 11 (3): 73-74]. Эта особенность вируса гриппа A(H1N1)pdm09 наблюдалась и у лиц молодого возраста, практически здоровых и не входящих в группы риска высокой заболеваемости по ОРВИ. Отмечали высокий риск заболеваемости и тяжелое течение гриппа среди беременных женщин, новорожденных и других наиболее уязвимых групп населения.

Тяжелое течение гриппа A(H1N1)pdm09 характеризуется:

- формированием синдрома острого повреждения легких (ОПЛ), дыхательной недостаточностью, усилением одышки в покое и при минимальной нагрузке, в том числе разговоре;

- развитием полиорганной недостаточности (миокардит, ОПН, токсический гепатит, ДВС-синдром).

Пандемия гриппа A(H1N1)pdm09 2009-2010 гг. и ее неблагоприятные исходы явились основанием для анализа и коррекции организационных и терапевтических мероприятий, направленных на своевременную диагностику и терапию гриппа и его осложнений.

В схемах временных методических рекомендаций Минздравсоцразвития Российской Федерации от 30.10.2009 г., разработанных для лечения и профилактики гриппа, вызванного вирусом гриппа A(H1N1)pdm09 у взрослых и детей, предпочтение отдается отечественным лекарственным препаратам, рекомендуется использовать Арбидол, Кагоцел, Интерфероны, а также Озельтамивир и Занамивир [Письмо Минздравсоцразвития РФ № 24-0/10/1-4053 от 30 июня 2009 г. «Временные методические рекомендации «Схемы лечения и профилактики гриппа, вызванного высокопатогенным вирусом типа A H1N1 для взрослых»]. Спектр противовирусных препаратов для лечения гриппа A(H1N1)pdm09 ограничен, так как вирус является устойчивым к действию противовирусных препаратов амантадину (amantadine) и римантадину (rimantadine).

Osterlund и другие авторы продемонстрировали чувствительность вируса гриппа A(H1N1)pdm09 к интерферону [Osterlund P, Pirhonen J, Ikonen N, Ronkko E, Strengell M, Makela SM et al. Pandemic H1N1 2009 influenza A virus induces weak cytokine responses in human macrophages and dendritic cells and is highly sensitive to the antiviral actions of interferons. J Virol. 2010; 84(3): 1414-22]. Так как интерферон проявляет иммуномодулирующее и противовирусное действие, своевременное назначение лекарственных форм интерферона способствует элиминации возбудителя, предотвращает развитие тяжелых форм инфекции и развитие осложнений. Биологическое действие интерферона характеризуется универсальностью (активны против многих ДНК и РНК-содержащих вирусов), тканевой специфичностью (активны только в гомологичных структурах) и последействием (вирусы подавляются в обработанных клетках даже после удаления интерферона).

По результатам клинических наблюдений установлено, что наличие осложненного преморбидного фона угнетает интерферон-продуцирующую активность иммунокомпетентных клеток больных гриппом и ОРЗ, что нередко коррелирует с их сниженной антиоксидантной активностью. При наличии длительной интоксикации, независимо от отсутствия или наличия осложнений, было выявлено достаточно низкое сывороточное содержание ИФН- (70, 84, 16 и 71, 45, 52 пг/мл соответственно) [Steel J, Staeheli P, Mubareka S, Garcia-Sastre A, Palese P, Lowen AC. Transmission of pandemic H1N1 influenza virus and impact of prior exposure to seasonal strains or interferon treatment. J Virol 2010;84(1):21-6]. Что является прямым показанием к проведению интерферонотерапии.

Известны способы назначения препаратов индукторов интерферона. Рекомендуемые схемы применения Кагоцел - в первый день 72 мг, последующие 3 дня по 36 мг в день в сочетании с приемом препарата Арбидол [Письмо Минздравсоцразвития РФ № 24-0/10/1-4053 от 30 июня 2009 г. «Временные методические рекомендации «Схемы лечения и профилактики гриппа, вызванного высокопатогенным вирусом типа А H1N1 для взрослых»].

Недостатком описанного способа лечения с применением индукторов является отсроченность действия, необходимого для наработки эндогенного интерферона и индивидуальные различия в интенсивности интерферонового ответа организма у пациентов.

Известны способы назначения Интерферона альфа-2b для лечения и профилактики гриппа, вызванного вирусом гриппа A(H1N1)pdm09 у взрослых и детей при различной степени тяжести процесса. Согласно рекомендациям [Львов Д.К., Малышев Н.А., Колобухина Л.В. и др. Грипп, вызванный новым пандемическим вирусом A/H1N1 swl: клиника, диагностика, лечение. Методические рекомендации. М.: Департамент здравоохранения г. Москвы, 2009. 18 с.]. Интерферон альфа-2b применяется для лечения легких, среднетяжелых и тяжелых форм заболевания, а также для проведения неспецифической профилактики по схеме: Интерферон альфа-2b 1 раз в день по 50000 ME через день в течение 10 дней.

Известны способы лечения беременных женщин (начиная с 14-й недели беременности) препаратами Интерферон альфа-2b в суппозиториях из расчета - суточная доза - 1000000 ME (по 500000 ME 2 раза в день) в течение 10 суток. Затем поддерживающая терапия по 300000 ME (по 150000 ME 2 раза в день) по 2 раза в неделю в течение 3 недель [Львов Д.К., Бурцева Е.И., Щелканов М.Ю. Распространение нового пандемического вируса гриппа A(H1N1) v в России // Вопросы вирусологии. 2010. Т.55. № 3. 4-9].

Основным недостатком известных схем лечения и профилактики гриппа A(H1N1)pdm09 у взрослых является отсутствие терапевтического ответа на проводимую монотерапию интерфероном альфа и необходимость комбинирования с препаратами интерферона гамма.

Известно использование препаратов типа амантадина и ремантадина в качестве противовирусных профилактических и лечебных средств, которые обладают низкой противовирусной активностью в отношении штаммов вируса гриппа птиц [Watts J. Asian nations step up action to curb spread of avian influenza. Lancet, 2004; 363(9406): 373]. Это связано с мутациями в гене, кодирующим белок М2, которые делают вирус устойчивым к этому классу соединений [Li K.S., Guan Y., Wang J., Smith G.J.D., Xu K.M., Duan L., Rahardjo A.P., Puthavathana P., Buranathai C., Nguyen T.D., Estoepangestle A.T.S., Chaisingh A., Auewarakul P., Long H.T., Hanh N.T.H., Webby R.J., Poon L.L.M., Chen H., Shortridge K.F., Yuen K.Y., Webster R.G., Peiris J.S.M. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature, 2004; 430(6996): 209-213], эти мутации возникают примерно в 30% случаев. Новый вариант вируса гриппа A(H1N1)pdm09 также содержит мутацию устойчивости к действию препаратов амантадинового ряда.

Разработан новый противогриппозный препарат Тамифлю, являющийся ингибитором нейраминидазы вирусов гриппа А и В - озельтамивир фосфат (oseltamivir), который, соединяясь с гидрофобным участком активного участка нейраминидазы вируса гриппа, блокирует способность последнего отщеплять остатки сиаловой кислоты с поверхности инфицированной клетки, тем самым подавляя выход из нее новых сформировавшихся вирионов. Однако в литературе опубликованы данные, что вирус гриппа, вызвавший инфекцию у детей, которых лечили озельтамивиром, может приобретать устойчивость к озельтамивиру [Kiso М., Mitamura K., Sakai-Tagawa Y., Shiraishi K., Kawakami С., Kimura K., Hayden F.G., Sugaya N., Kawaoka Y. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. Lancet 2004; 364(9436): 759-765], и дальнейшее его применение может оказаться менее эффективным. Кроме того, есть данные о появлении штаммов вируса гриппа A(H1N1)pdm09, устойчивых к действию озельтамивира.

Известен способ повышения резистентности организма при вирусных инфекциях путем введения в организм сублингвально гранул, содержащих по 2000 ME реаферона, использовались по схеме: 5 гранул (10000 ME) 1 раз в день утром за 30 минут до еды в течение 10 дней. Препарат предлагается использовать для повышения резистентности к инфицированию вирусами и другими инфекционными агентами, такими как вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, простого герпеса, Эпштейна-Бара, короновирусы, энтеровирусы, риновирусы, респираторно-синтициальный вирус, хламидии, микоплазмы (Патент РФ 2191594, МПК A61K 38/21, опубл. 27.10.2002 г.).

Однако указанный препарат имеет следующие недостатки: сублингвальные гранулы содержат рекомбинантный человеческий ИФН 2а в дозе от 2000 до 4000 ME/гранулу, по этой причине, как указано в патенте, даже для профилактики заболевания необходимо единомоментно использовать до 5 гранул и для достижения эффекта принимать их 1-3 раза в день. Данные об эффективности сублингвальных гранул, содержащих низкие дозы рекомбинантного человеческого ИФН 2а, при использовании для лечения заболевания отсутствуют. Кроме этого препарат проявляет заявляемый эффект при совместном использовании с иммуномодуляторами ридостин, ларифан, полудан, амиксин, циклоферон, кагоцел, неовир, дибазол, курантил и др. Кроме того, нет сведений о профилактическом действии препарата в отношении заболеваний, вызванных штаммами субтипа H5N1 вируса гриппа птиц.

Известен препарат Реаферон-ЕС-Липинт, который производит российская фармацевтическая компания ЗАО «Вектор-Медика» на основе лицензионного договора на передачу прав (по патенту РФ № 2123328, МПК A61K 38/21, опубл. 20.12.1998 г.) с ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Известно, что указанный препарат рекомендован для профилактики гриппа и ОРЗ в дозе 0,5 млн ME один раз в сутки 2 раза в неделю в течение 1 месяца, а при терапии гриппа и ОРЗ препарат назначают по 0,5 млн ME ежедневно 2 раза в сутки в течение 3-х дней.

Известен также способ профилактики заболевания, вызванного вирусом гриппа птиц А субтипа H5N1, включающий введение в организм препарата альфа-2 интерферона человека. В качестве препарата альфа-2 интерферона человека используют «Реаферон ЕС-Липинт», полученный включением рекомбинантного альфа-2 интерферона в липосомы, который вводят сублингвально в дозе не менее 5000-10000 МЕ/кг веса один раз в сутки через 2 дня в течение 6 дней, а затем в той же дозе один раз в сутки через 3-4 дня в течение не более 3 недель (патент РФ № 2395295, МПК A61K 38/21, опубл. 27.07.2010 г.). Взрослым и детям старше 15 лет препарат вводят за 30 мин до еды в дозе 10000 МЕ/кг, а детям с 3 до 15 лет при профилактике заболеваний препарат назначают в дозе 5000 МЕ/кг.

Однако для защиты организма (профилактики и лечения) от инфекций, вызванных штаммами субтипа H1N1 вируса «свиного» гриппа, в том числе пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09, такая схема препарата не дает надежного эффекта и требует разработки иной схемы применения данного липосомального препарата (Olson F., Hunt С.A. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through policarbonate membranes. Biohim. et Biophys. Acta. 1979, 557: 9-23).

Наиболее близким способом защиты организма от инфекции, вызванной штаммами вируса свиного гриппа H1N1 (прототипом), является способ ингибирования вируса свиного гриппа H1N1 (штамм A/PR/8/34 (PR8) virus) с использованием химически синтезированных препаратов озельтамивир (Тамифлю), thiazolides, zanamivir, а также использование их в комплексе с интерфероном альфа 2 человека (Заявка США № 20100330173, МПК A61K 38/21, опубл. 30.12.2010 г.).

Однако противовирусные свойства препаратов исследовались, в частности штамма вируса гриппа птиц H1N1, только на культурах клеток животных Vero или MDCK, что недостаточно для обоснования противовирусного действия этого препарата на организмах животных и людей. Кроме того, еще в период 2004-2006 гг. у ряда больных гриппом птиц подтипа H5N1 в Юго-Восточной Азии были зафиксированы случаи устойчивости к Тамифлю и Релензе [Hurt A.C. et al. Susceptibility of highly pathogenic A(H5N1) avian influenza viruses to the neuraminidase inhibitors and adamantanes // Antivir. Res. - 2007. - V.73. - P.228-231]. В сезон 2007-2008 гг. уже 24% выделенных на территории 22 из 30 Европейских стран изолятов вируса гриппа А человека подтипа H1N1 оказались устойчивыми к Тамифлю [Ciancio B.C. et al. Oseltamivir-resistant influenza A(H1N1) viruses detected in Europe during season 2007-8 had epidemiologic and clinical characteristics similar to co-circulating susceptible A(H1N1) viruses // Euro Surveill. - 2009. - V.14. - P.19412]. А в следующий сезон 2008-2009 гг. уже 100% из 745 изолятов гриппа А H1N1, выделенных от больных гриппом на территории Японии, были Тамифлю-устойчивыми (>300-кратное падение восприимчивости к препарату) [Baranovich Т. et al. Emergence of H274Y oseltamivir-resistant A(H1N1) influenza viruses in Japan during the 2008-2009 season // J Clin Virol. - 2010. - V.47. - P.23-28]. Установлено, что резистентность к Тамифлю обусловлена новой генетической мутацией, приводящей к замене гистидина на тирозин в 274-м положении аминокислотной последовательности вирусной нейраминидазы.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание более дешевого и эффективного способа защиты организма от инфекции, вызванной штаммами субтипа H1N1 вируса гриппа А, в том числе пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09, путем применения препарата на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона человека в липосомальной форме.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе защиты организма от инфекции, вызванной штаммами H1N1 2009 pdm вируса гриппа А, включающем введение в организм препарата альфа-2 интерферона человека, согласно изобретению в качестве препарата альфа-2 интерферона человека используют «Реаферон ЕС - Липинт», полученный включением рекомбинантного альфа-2 интерферона в липосомы, который вводят в организм сублингвально или перорально в разовой дозе от 10000 до 30000 МЕ/кг веса.

При профилактике инфекции препарат принимают один раз в сутки два раза в неделю в течение 1 месяца, а при лечении инфекции препарат принимают 2 раза в сутки через 12 часов ежедневно в течение 3-5 дней в зависимости от продолжительности болезни от начала заболевания до начала лечения.

Причем препарат назначают за 30 мин до еды взрослым и детям старше 15 лет - при профилактике заболеваний в дозе 20000 МЕ/кг, при лечении - по 30000 МЕ/кг, а детям с 3-х до 15 лет при профилактике заболеваний препарат назначают в дозе 10000 МЕ/кг и лечении - по 15000 МЕ/кг.

Характеристика липосомального препарата, используемого в заявляемом способе

Препарат «Реаферон ЕС липинт» представляет собой липосомальную форму рекомбинантного альфа-2 интерферона при следующем количественном соотношении компонентов, мг/мл:

Фосфатидилхолин	80-100
Холестерин	12-20

Кроме этого в препарат добавляют витамин Е, и, таким образом, в конечный состав препарата входят интерферон альфа-2 человеческий рекомбинантный (250000, 500000 или 1000000 ME) и вспомогательные вещества: натрия хлорид - 8,01 мг, натрия гидрофосфата додекагидрат - 4,52 мг, натрия дигидрофосфата дигидрат - 0,56 мг, лецитин или липоид С100 - 41,18 мг, холестерин - 4,53 мг, витамин Е - 0,56 мг, лактоза - 91,34 мг

Пример 1. Способ защиты (профилактики) организма от инфекции, вызванной штаммами субтипа H1N1 вируса «свиного» гриппа А

Препарат «Реаферон ЕС - Липинт» вводят в организм за 30 мин до еды детям с 3-х до 15 лет перорально при профилактике заболеваний в дозе 10000 МЕ/кг веса один раз в сутки 2 раза в неделю в течение 1 месяца.

Препарат «Реаферон ЕС - Липинт» вводят за 30 минут до еды в организм взрослым и детям старше 15 лет сублингвально при профилактике заболеваний в дозе 20000 МЕ/кг веса один раз в сутки 2 раза в неделю в течение 1 месяца.

Пример 2. Способ защиты (лечения) организма от инфекции, вызванной штаммами субтипа H1N1 вируса «свиного» гриппа А

Препарат «Реаферон ЕС - Липинт» вводят в организм детей с 3-х до 15 лет за 30 мин до еды перорально при лечении заболеваний в дозе 15000 МЕ/кг веса ежедневно 2 раза в сутки через 12 часов в течение 5 дней.

Препарат «Реаферон ЕС - Липинт» вводят в организм взрослых и детей старше 15 лет за 30 мин до еды перорально при лечении заболеваний в дозе 30000 МЕ/кг веса ежедневно 2 раза в сутки через 12 часов в течение 5 дней.

Клинические испытания препарата. Доклиническое исследование препарата Реаферон-ЕС-Липинт показало отсутствие токсического, аллергизирующего действия на организм животных; препарат также не оказывал раздражающего действия на слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта [«Отчет о лабораторно-экспериментальном изучении липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона» предоставлен Отделом исследования рекомбинантных препаратов, руководитель к.х.н. Н.Б. Бажутин, р.п. Кольцово, 1993 г.]. Изучение всасывания опытных образцов показало, что липосомальный интерферон способен проникать через слизистую кишечника, попадать в кровь экспериментальных животных и циркулировать в кровеносном русле вдвое дольше, чем свободный интерферон, вводимый внутривенно, при этом полностью элиминируется из кровотока через 6 часов после введения. Результаты исследования позволяют сделать вывод о безвредности препарата Реаферон-ЕС-Липинт, в связи с чем он рекомендован на клинические испытания.

Клиническое исследования «Двойное слепое плацебо-контролируемое исследование препарата «Реаферон-ЕС-Липинт» липосомальный в комплексной терапии больных гриппом и другими ОРЗ при пероральном применении» по оценке эффективности Реаферон-ЕС-Липинт в терапии ОРВИ и гриппа проведено на базе Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (г. Санкт-Петербург, 2002 г.) [Отчет о проведении двойного слепого рандомизированного плацебоконтролируемого клинического исследования препарата Реаферон-ЕС-Липинт липосомальный в комплексной терапии больных гриппом и другими острыми респираторными заболеваниями при пероральном способе применения. Санкт-Петербург, Военно-медицинская академия]. Количество обследованных - 80 больных гриппом и ОРЗ средней степени тяжести. Установлено, что применение препарата Реаферон-ЕС-Липинт приводит к статистически значимому уменьшению длительности объективных признаков синдрома общей интоксикации, продуктивного кашля и снижению частоты встречаемости случаев развития осложнений гриппа и ОРЗ (пневмония, носовые кровотечения). Достоверное снижение частоты носовых кровотечений в группе больных можно связать с торможением цитопатического действия вирусов гриппа на клетки сосудистой стенки (противовирусное действие).

Клинические исследования «Рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование по оценке эффективности и безопасности препарата «Реаферон-ЕС-Липинт лиофилизированный порошок для приготовления раствора для приема внутрь (флаконы) 500000 МЕ/мл» для профилактики гриппа и других острых респираторных вирусных заболеваний у детей» проведено на базе ГУ НИИ гриппа РАМН (г. Санкт-Петербург, январь-февраль 2005 г.). В исследованиях приняло участие 384 здоровых ребенка в возрасте от 7-15 лет, которым с профилактической целью назначался Реаферон-ЕС-Липинт [Отчет о проведении клинического исследования «Рандомизированное, плацебо-контролируемое исследование по оценке эффективности и безопасности препарата «Реаферон-ЕС-Липинт лиофилизированный порошок для приготовления раствора для приема внутрь (флаконы) 500000 МЕ/мл» для профилактики гриппа и других острых респираторных вирусных заболеваний у детей». Санкт-Петербург, НИИ гриппа, 2006 г.]. Установлено, что профилактический курс способствовал снижению частоты возникновения заболеваний гриппом (ИЭ=3,5, р<0,05) и другими ОРВИ среди детей 7-10 лет по сравнению с группой, принимавшей плацебо. Препарат рекомендован для профилактики гриппа и других ОРВИ у взрослых и детей.

Обоснование выбора оптимальной дозы препарата «Реаферон ЕС липинт» для проведения испытания его противовирусной активности на мышах. При расчете эквивалентных для мышей доз препаратов были использованы ранее опубликованными сведениями [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Хабриева Р.У. М.: Медицина, 2005. - 832 с.; Трахтенберг И.М. и др. Проблема нормы в токсикологии - 2-е изд. - М.: Медицина, 1991. - 208 с.], где научно обосновано применение повышенных величин таких доз в пересчете на единицу массы мелких лабораторных животных.

Рекомендованная лечебная доза препарата «Реаферон ЕС липинт» для человека составляет 1 млн ед. У человека усредненного роста 160 см и усредненного веса (m) 60000 г поверхность тела (S) составляет 16000 см² коэффициент S/m=0,27. В то же время у мыши с длиной тела 5 см и весом (m) 15 г, S=18-20 см², просчитанный коэффициент S/m=1,2. Исходя из того что коэффициент S/m у мышей выше, чем у человека, в 4 раза, можно сделать заключение, что интенсивность обмена веществ и скорость метаболизма введенного вещества у мыши в 4 раза выше, чем у человека. По этой причине доза препарата, вводимая мыши, на единицу веса должна быть в 4 раза больше, чем у человека.

Закон зависимости обмена веществ от массы тела отражает тенденцию к установлению соответствия между теплопродукцией и интенсивностью теплоотдачи в окружающее пространство. Потеря тепла на единицу массы тела оказывается тем больше, чем больше соотношение между поверхностью и объемом тела, при этом последнее соотношение уменьшается с увеличением размера тела. Кроме того, у мелких животных изолирующий слой тела более тонкий: интенсивность метаболизма у мыши на 1 г массы тела больше, чем у человека.

Исходя из соображений, что оптимальная доза «Реаферон ЕС - Липинт» для человека со средней массой тела 60 кг составляет 16700 ед./кг массы, оптимальная доза для мыши (средняя масса тела 15 г) составит, с учетом рекомендуемого увеличения дозы в 4 раза, приблизительно 1000 ед./мышь. Для проверки эффективности повышенных доз липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека «Липинт» на мышах указанную дозу увеличили 3,75 раза, т.е. оптимальная доза препарата на 1 мышь составляла 3750 МЕ/мышь или 250 МЕ/г.

Исследования эффективности препарата в отношении штаммов вируса гриппа A(H1N1)pdm09 в экспериментах на мышах

Интраназальное заражение мышей вирусом гриппа. Инфицирование мышей вирусом гриппа производили интраназально (и/н) под легким эфирным наркозом. При этом с помощью автоматической пипетки с наконечником суммарно в обе ноздри мыши вносили соответствующее разведение вируссодержащей жидкости (ВСЖ) в объеме 40 мкл. Через 4 и 5 сут после заражения мышей подвергали цервикальной дислокации, получали 1%-ные гомогенаты легких и определяли в них наличие вируса гриппа. Концентрацию вируса в ВСЖ и гомогенатах легких определяли по результатам титрования в культуре клеток MDCK и выражали в lgТЦД₅₀/мл (десятичных логарифмах 50%-ных тканевых цитопатических доз в мл) по методу Спирмана-Кербера [Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика, 1976. - 598 с.]. Статистическую обработку и сравнение данных проводили общепринятыми методами для биологических исследований с помощью компьютерной программы методу Спирмана-Кербера с оценкой достоверности отличий для 95% доверительного уровня (195) [Закс Л. Статистическое оценивание. М.: Статистика, 1976. - 598 с.].

Пример 1. Использование штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 и беспородных белых мышей для проверки противовирусной активности препарата по индексу нейтрализации вируса. Беспородных белых мышей массой 15-17 г в контроле и в опыте инфицировали интраназально штаммами пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 заражали 5-ю десятикратными разведениями для каждого из штаммов ВГ в объеме 40 мкл. Через 4 сут в объединенных гомогенатах легких от 4-х мышей определяли 50%-ные инфицирующие дозы (ИД₅₀ ) штаммов вируса гриппа в lgТЦД₅₀/голову. На основании полученных показателей высчитывали индекс нейтрализации (ИН) вируса под влиянием препарата in vivo: ИН=ИД₅₀опыт - ИД₅₀контроль (lg).

В опыте при изучении лечебно-профилактического действия препарат Реаферон-Липинт вводили мышам перорально по 250 МЕ/г в 0,2 мл дистиллированной воды ежедневно 1 раз в сутки или по 125 МЕ/г в 0,2 мл дистиллированной воды ежедневно 2 раза в сутки через 12 часов. Через 1 час после заражения вводят первую дозу препарата, а потом в течение 4 дней после заражения штаммами вируса гриппа A(H1N1)pdm09. Контрольной группе мышей по аналогичной схеме вводили дистиллированную воду.

Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1
Лечебно-профилактическая активность препарата Реаферон-Липинт на модели гриппозной инфекции, вызванной штаммами штаммами вируса гриппа A(H1N1)pdm09 у мышей, по индексу нейтрализации (ИН)
Препарат для лечения	ИД50 штаммов в lg ТЦД50/гол. (±195) для мышей		ИН в lg #
A/Califomia/04/2009 (H1N1)v	опыт	1,8±0,4*	0,8*
	контроль	1,0±0,4
A/Califomia/07/2009 (H1N1)v	опыт	0,9±0,4*	0,8*
	контроль	0,1±0,3
A/Moscow/225/09 (H1N1)v	опыт	1,5±0,4*	0,9*
	контроль	0,6±0,3
A/Moscow/226/09 (H1N1)v	опыт	1,6±0,4*	1,0*
	контроль	0,6±0,3
A/Salekhard/01/2009 (H1N1)v	опыт	1,2±0,4@	0,7@
	контроль	0,5±0,3
A/Bishkek/03/2009 (H1N1)v	опыт	1,7±0,4*	1,0*
	контроль	0,7±0,3
Примечание:

* - величина ИД50 с вероятностью 95% отличается от контроля;
@ - величина ИД50 с вероятностью 90% отличается от контроля;
# - показатель (в lg) определяется как разница между ИД50 (в lg ТЦД 50/гол.) между опытной и контрольной группами животных.

Результаты представленных исследований свидетельствуют о наличии достоверного лечебно-профилактического эффекта у препарата Реаферон-Липинт при инфекции у мышей, вызванной штаммами вируса гриппа A(H1N1)pdm09 A/Califomia/04/2009 (H1N1)v, A/Califomia/07/2009(H1N1)v, A/Moscow/225/09 (H1N1)v, A/Moscow/226/09 (H1N1)v и A/Bishkek/03/2009 (H1N1)v. Отмечена также положительная тенденция к противовирусному действию Реаферона-Липинта при инфицировании мышей штаммом вируса гриппа A/Salekhard/01/2009(H1N1)v.

Пример 2. Использование штаммов пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 и беспородных белых мышей для проверки противовирусной активности препарата по подавлению продукции вируса в легких. Беспородных белых мышей массой 15-17 г инфицировали интраназально штаммами пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 в дозе 30-50 ИД₅₀/мышь (50%-ные инфицирующие дозы на мышь). Концентрацию ВГ в легких определяли через 5 сут после заражения при титровании объединенных гомогенатов легких от 4-х мышей в культуре клеток MDCK, рассчитывали по методу Спирмана-Кербера и выражали в lgТЦД ₅₀/мл (lg 50% тканевых цитопатических доз на мл). На основании разницы между титрами вируса в гомогенатах легких у мышей в контроле и в опыте рассчитывали индекс подавления продукции вируса (ИППВ) под влиянием препарата in vivo.

При изучении лечебно-профилактического действия препарат Реаферон-Липинт вводили мышам перорально по 250 МЕ/г в 0,2 мл дистиллированной воды ежедневно 1 раз в сутки или по 125 МЕ/г в 0,2 мл дистиллированной воды ежедневно 2 раза в сутки через 12 часов. Через 1 час после заражения вводят первую дозу препарата, а потом в течение 4 дней после заражения штаммами вируса гриппа A(H1N1)pdm09. Контрольной группе мышей по аналогичной схеме вводили дистиллированную воду.

Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2
Лечебно-профилактическая активность препарата Реаферон-Липинт на модели гриппозной инфекции, вызванной штаммами штаммами вируса гриппа A(H1N1)pdm09 у мышей, по индексу подавления продукции вируса (ИППВ)
Препарат для лечения	Титры вируса в легких мышей lgТЦД 50/МЛ (±195)		ИППВ в lg #
A/California/04/2009 (H1N1)v	опыт	1,50±0,40*	2,20*
	контроль	3,70±0,40
A/California/07/2009 (H1N1)v	опыт	2,13±0,72*	2,17*
	контроль	4,30±0,43
A/Moscow/225/09 (H1N1)v	опыт	2,00±0,40*	1,90*
	контроль	3,90±0,40
A/Moscow/226/09 (H1N1)v	опыт	1,83±0,72*	1,67*
	контроль	3,50±0,40
A/Salekhard/01/2009 (H1N1)v	опыт	1,83±0,72*	2,17*
	контроль	4,00±0,50
A/Bishkek/03/2009 (H1N1)v	опыт	4,75±0,4*	1,75*
	контроль	6,50±0,00
Примечание:
* - величина титра вируса в легких с вероятностью 95% отличается от контроля;
# - показатель (в lg) определяется как разница между титрами вируса гриппа в легких (в lgТЦД 50/мл) контрольной и опытной групп животных через 5 суток после их заражения.

Результаты представленных исследований свидетельствуют о наличии достоверного лечебно-профилактического эффекта у препарата Реаферон-Липинт при инфекции у мышей, вызванной всеми исследованными штаммами вируса гриппа A(H1N1)pdm09, что подтверждает эффективность заявляемого способа защиты (профилактики и лечения) организма от инфекции, вызванной штаммами субтипа H1N1 вируса «свиного» гриппа, а также достижение технического результата, указанного в заявке.