штамм бактерий serratia species, являющийся продуцентом внеклеточной рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью

Формула изобретения

Штамм бактерий Serratia species, являющийся продуцентом внеклеточных рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью в отношении вирусов птичьего гриппа A/chickenKurgan/05/2005 (H5N1) и вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2), и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1287.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к штамму бактерий Serratia species Bp-471, являющемуся продуцентом внеклеточных рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью, и может быть использовано в микробиологии и биотехнологии доя производства противовирусных препаратов.

В настоящее время при разработке средств профилактики и терапии вирусных инфекций все большее внимание уделяется изучению нуклеаз - ферментов, деполимеризующих нуклеиновые кислоты.

К списку нуклеаз, проявляющих противовирусные свойства на моделях in vitro, относят панкреатические РНКазы, ДНКазы. Установлено, что рибонуклеазы обладают выраженной противовирусной активностью в отношении таких РНК-содержащих вирусов, как вирусы гриппа, полиомиелита, клещевого энцефалита. Дезоксирибонуклеазы тормозят синтез и размножение ДНК-содержащих вирусов, осповакцины, аденовируса, герпеса [1].

Известно, что наиболее активными в отношении синтеза внеклеточной щелочной рибонуклеазы являются разные штаммы рода Bacillus [2, 3].

Одним из наиболее изученных энзимов этого класса является секретируемая эндонуклеаза из штамма Serratia marcescens (Sma nuc). Штаммы рода Serratia широко известны как продуценты различного рода препаратов. В качестве продуцента нуклеазы, обладающей РНКазной и ДНКазной активностями, наиболее изучен штамм Serratia marcescens В-10 M-1 [4-6].

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм BACTERIUM PRODIGIOSUM (SERRATIA MARCESCENS) В-10, М-2 - продуцент неспецифической эндонуклеазы - препарат для борьбы с вирусными инфекциями животных и насекомых (авторское свидетельство СССР № 928794, МПК C12N 1/20, опубл. 15.11.1993) [9].

Однако в описании к авторскому свидетельству не приведены данные о противовирусной активности продуцируемой штаммом SERRATIA MARCESCENS неспецифической эндонуклеазы.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение нового штамма бактерий - продуцента внеклеточных рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью, в частности, в отношении вирусов птичьего гриппа A/chikenKurgan/05/2005 (H5N1) и вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2).

Указанный технический результат достигается получением штамма бактерий Serratia species Bp-471, являющегося продуцентом внеклеточных рибонуклеазы и дезоксирибонуклеазы, обладающих противовирусной активностью в отношении вирусов птичьего гриппа A/chikenKurgan/05/2005 (H5N1) и вируса гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2), и депонированный в коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» под регистрационным номером В-1287.

Штамм выделен из образца воды озера Байкал с последующим клонированием.

Для выделения бактерий-продуцентов нуклеолитических ферментов была применена методика отбора колоний на селективных средах. Использовали среду, содержащую ДНК [7]. Из большого разнообразия штаммов было выделено несколько штаммов для последующего анализа на содержание ферментов нуклеолитического типа.

При лабораторной проверке активности выделенных штаммов оказалось, что штамм Serratia sp. Bp-471 обладает РНКазной и ДНКазной активностями.

Определение таксономической принадлежности

Для определения таксономической принадлежности бактерий Serratia sp. Bp-471 стандартными методами исследовали фенотипические признаки и определяли нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР, соответствующие гену 16S рРНК. Определение до вида проводили по определителю Бердже [8].

Для получения геномных характеристик выделяли суммарные ДНК из чистых культур и проводили ПЦР с универсальными праймерами, соответствующими гену 16S рРНК эубактерий: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' и 5'-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3'. Нуклеотидные последовательности продуктов ПЦР определяли с использованием BigDye 3,1 Terminator Cycle Sequencing Kit и автоматического анализатора ДНК модели ABI 3130х1 (Applied Biosystems, США), в Межинститутском Центре секвенирования ДНК СО РАН (г. Новосибирск). Филогенетический анализ выполняли с использованием программы MEGA версии 4 для нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, определенных в данной работе, и близкородственных видов из базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Штамм бактерий Serratia species Bp-471 имеет следующие морфологические и физиологические признаки.

Морфологические признаки. Величина клеток односуточной культуры на мясопептонном агаре 0,6-0,8×1,0-2,0 мкм. Клетки палочковидные, в основном одиночные, реже соединяются в короткие цепочки, подвижные, перитрихи, грамотрицательные. На мясопептонном агаре штамм образует гладкие, округлые, блестящие, белесые, влажные, непрозрачные колонии с ровным краем, пигмент отсутствует. Старые культуры формируют матовые, слегка шероховатые, плоские колонии, легко снимающиеся с агара петлей.

Физиологические признаки. Аэроб, максимум роста при 30-37°C, штамм отрицателен по уреазе, коагулазе, в тестах на индол, сероводород, амилазу; образует РНКазу и ДНКазу, гидролизует желатин, утилизирует цитрат, с образованием кислоты гидролизует сахарозу, манит, мальтозу, глюкозу, но не лактозу; восстанавливает нитраты, отрицателен в реакции MR и в реакции FP.

Штамм содержит плазмидную ДНК, устойчив к ампициллину, клиндамицину, рифампицину, эритромицину, оксациллину.

При культивировании применяли питательную среду "S" (Пептон, NaCl, MgCl₂×6 H ₂O, Трис-гидроксиметиламинометан, pH 8.0) или "LB" (дрожжевой экстракт, пептон, NaCl, pH 7,2) "Difco".

Хранение штамма: Субкультуры штамма хранят периодическими пересевами на агаризованную среду РПА или LA, в 15%-ном растворе глицерина при низкотемпературном замораживании (минус 65°C) и в лиофильно-высушенном состоянии.

Штамм Serratia species Bp-471 депонирован в «Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов Федерального Бюджетного Учреждения Науки Государственный Научный Центр Биотехнологии и Вирусологии «Вектор» (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор») под коллекционным номером В-1287 (Справка о депонировании штамма прилагается).

Посевной материал получали при выращивании штаммов на жидких или агаризованных средах: LB (0,25% LB "Difco", 1,7% агара) и среде А (0,7% пептона "Difco", 0,4% рыбного гидролизата, 0,5% NaCl, 1,7% агара). Значение pH 7,0-7,2.

Для получения образцов культуральной жидкости (КЖ) штаммы культивировали в среде «S» или Lb в течение 18 час при 37°C с последующим центрифугированием 20 мин при 8000 об/мин. Полученные образцы КЖ и биомассы хранили в замороженном состоянии при - 20°C.

Для получения клеточных экстрактов бактериальные клетки лизировали лизоцимом (05,мг/мл) с добавлением тритона Х-100 (0,1%) в TN-буфере (0,01М Трис pH 7,5; 0,5М NaCl, H₂O деионизованная) или разрушали ультразвуком в 4-х мл H₂O на дезинтеграторе "MSE" (Великобритания).

Количественное определение РНКазной и ДНКазной активности проводили по превращению субстратных нуклеиновых кислот: суммарной дрожжевой РНК (НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор») и ДНК из молок лосося (Медиген, Новосибирск) во фрагменты, которые растворимы в 4%-ной HClO₄, с появлением кислоторастворимого материала с адсорбцией при 260 нм.

Средняя рибонуклеазная активность штамма составила 252,5 ед.акт/мл КЖ, а активность клеточного экстракта 261,8 ед.акт/мл или 2094,4 ед.акт/г влажной биомассы. Максимальная активность КЭ была получена на среде "S" и составила 6692,4 ед.акт/г биомассы.

Ниже приведены данные по исследованию КЖ штамма Serratia sp. Вр-471 на ДНКазную активность

На фиг.1 представлена электрофореграмма анализа КЖ бактериальных штаммов на содержание внеклеточных ферментов.

Время инкубации с ДНК фага :

(1,4,7) - 5 мин, (2,5,8) - 10 мин,

(3,6,9) - 30 мин.

Из электрофореграммы на фиг.1 видно, что ферменты КЖ штамма Serratia sp. Bp-471(Bp-471) полностью гидролизуют ДНК фага уже за 5 мин инкубации (дорожки 1-3). В то время как КЖ двух других штаммов не гидролизуют ДНК в этих же условиях даже за 30 мин, и ДНК хорошо видно на гелевой пластине.

Штамм бактерий Serratia sp. Bp-471 обладает ДНКазной активностью и гидролизует не только ДНК фага (фиг.1), но и ДНК фага Т7 и ДНК из молок лосося (табл.1).

Таблица 1
Гидролиз ДНК из молок лосося и дрожжевой РНК КЖ и КЭ штамма Serratia sp. Bp-471.
№ образца	Вид образца	Белок, мг/мл	ДНКазная активность (ед./мл)	РНКазная активность (ед./мл)
11-19	КЖ	4,7	83,6	238,7
11-11	КЭ	3,8	92,4	261,8
11-29	КЖ	9,2	86,9	266,2
12-57	КЭ	12,9	258,4	836,5

Подготовка к тестированию штаммов вируса гриппа и культуры клеток.

Для оценки противовирусной эффективности полученных препаратов использовали высокопатогенный вирус гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (A/H5N1) из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор, наработанный на 10-суточных развивающихся куриных эмбрионах (РКЭ). Концентрация вируса составила: 10^3,5-6,5 lg ТЦД₅₀/мл. Вирус гриппа человека A/Aichi/2/68, титр 10^2,5-3,5 lg ТЦД₅₀/мл вирусаллантоисной жидкости (ВАЖ)). Для тестирования токсичности и противовирусной активности препаратов использовали перевиваемую культуру клеток MDCK.

Определение токсичности препарата. Для определения токсических доз препараты разводили в 2, 5, 10 раз средой Axcevir-MDCK, вносили по 150 мкл в соответствующие лунки планшета с клетками MDCK и ставили в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2 суток. Через 2 суток с помощью инвертированного микроскопа оценивали наличие токсического действия в монослоях клеток MDCK, инкубированных с разными концентрациями препаратов.

Для определения противовирусной активности препаратов использовали максимально переносимые концентрации (МПК).

Определение противовирусной активности препаратов. Для определения противовирусной активности препаратов готовили десятикратные разведения ВАЖ от 1 до 8 с использованием среды Axcevir-MDCK, содержащей 2 мкг/мл трипсина. В монослой культуры клеток MDCK вносили по 50 мкл выбранного разведения препарата и 100 мкл от 1 до 8 разведения ВАЖ. Клетки инкубировали 2 суток при температуре 37°C в атмосфере 5% CO₂ в термостате ТС-1/80 СПУ (Россия). Через 2 суток в каждой лунке с помощью инвертированного микроскопа регистрировали ЦПД в монослое клеток и определяли наличие вируса в среде культивирования по реакции гемагглютинации (РГА) с 1% эритроцитами петуха. Ниже приведены примеры конкретного применения заявляемого штамма.

Определение наличия нуклеолитической и противовирусной активности штамма Serratia species Bp-471 относительно вирусов птичьего гриппа A/chicken/Kurgan/05/2005 (А/H5N1) и гриппа человека A/Aichi/2/68 проводится впервые, в связи с чем можно сделать вывод о соответствии предлагаемого штамма критериям изобретения «Новизна» и «Изобретательский уровень».

Изобретение подтверждено следующими примерами практического применения.

Получение образцов (препаратов).

Пример 1. Получение препарата (образца) 11-19 на основе культуральной жидкости (КЖ) штамма Serratia sp. Bp-471.

Суспензию клеток готовили с использованием культуры штамма Serratia sp. Вр-471, наработанного на агаризованной среде в течение 18 часов при температуре 28-30°C. Суспензию вносили в количестве 1% в колбы с 50 мл среды LB и культивировали в течение 24 часов на термостатированной качалке (КТ 104, Россия). Для приготовления препарата на основе культуральной жидкости полученную КЖ штамма центрифугировали при 10000 об/мин в течение 30 мин на центрифуге JA-21. Надосадочную жидкость стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм и использовали для испытания в качестве противовирусного препарата. Хранили препарат до использования при температуре минус 20°C.

Пример 2. Получение препарата (образца) 11-11, на основе экстракта клеток (КЭ) штамма Serratia sp. Bp-471.

Осадок клеток штамма, полученный после центрифугирования и освобождения от надосадочной жидкости в примере 1, ресуспендировали в 4 мл дистиллированной H₂O и обрабатывали 4 раза по 30" с интервалом 30", на ультразвуковом(УЗ)-дезинтеграторе. После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием при 10000 об/мин на микроцентрифуге "Eppendorf", КЭ отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°C.

Пример 3. Испытание противовирусного действия препарата № 11-19, приготовленного на основе КЖ штамма Serratia species Bp-471 (в профилактической схеме). Для испытания препарат № 11-19 развели в 5 раз и внесли на клетки MDCK в объеме 50 мкл на лунку 96-луночного планшета. Инкубация 2 часа. Удалили препарат, затем в лунки внесли среду RPMI-1640 без сыворотки и без трипсина. Добавили вирус A/chikenKurgan/05/2005 (H5N1) с -1 по -7 по 50 мкл на лунку. Инкубация 2 сут. Учет с 1% эритроцитами петуха.

Планшеты с обработанными клетками и вирусом помещали в термостат при температуре 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности на 2-3 суток до образования монослоя. Препарат нейтрализовал 3,5 lg вируса гриппа птиц, т.е. индекс нейтрализации составил 3,5 lg (табл.2).

Пример 4. Испытание противовирусного действия препарата 11-11 на вирусе гриппа человека (профилактическая схема).

Клеточный экстракт(КЭ) штамма Serratia sp. Bp-471 (препарат № 11-11) проверили в профилактической схеме на противовирусную активность. Концентрация вируса составила 10^2,5 lg ТЦД₅₀/мл. Препарат нейтрализовал вирус гриппа A/Aichi/2/68 на 100%. KB - контроль вируса, титр 10^2,5 lg ТЦД ₅₀/мл (табл.2).

Пример 5. Испытание противовирусного действия препарата 11-19 на вирусе гриппа человека (профилактическая схема). Концентрация вируса составила 10^3,5 lg ТЦД ₅₀/мл. Препарат нейтрализовал вирус гриппа A/Aichi/2/68 на 100%. KB - контроль вируса, титр 10^3,5 lg ТЦД ₅₀/мл (табл.2).

Пример 6. Получение препарата 12-57 и испытание его противовирусного действия.

Клетки штамма Serratia sp. Bp-471 выращивали, как описано в примере 1. За исключением того, что использовали среду "S". Осадок клеток штамма, полученный после центрифугирования и освобождения от надосадочной жидкости, как в примере 1, ресуспендировали в 4 мл дистиллированной Н₂О и обрабатывали 4 раза по 30" с интервалом 30", на ультразвуковом(УЗ)-дезинтеграторе. Процент разрушения 75%. После УЗ-обработки разрушенные клетки осаждали центрифугированием при 10000 об/мин на микроцентрифуге "Eppendorf", КЭ отбирали и стерилизовали ультрафильтрацией через Whatman фильтр с размерами пор 0,2 мкм. Полученный препарат хранили до использования при температуре минус 20°C.

Полученный КЭ разводили в 2 раза и использовали для испытания на противовирусное действие на вирусе гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1). Препарат нейтрализовал вирус гриппа птиц на 100%. KB - контроль вируса, титр 10^6,5 ТЦД₅₀/мл (табл.2).

Таблица 2
Противовирусное действие КЭ и КЖ штамма Serratia species Bp-471
№ Образца	Штамм	РНКазная активность, Е/мг белка	Индекс нейтрализации вируса	Нейтрализация вируса, %
A/Aichi/2/68 (H3N2)
11-11	КЭ	68,9	2,5 lg	100,0
11-19	КЖ	50,8	3,5 lg	100,0
A/chikenKurgan/05/2005 (H5N1)
11-19	КЖ	50,8	3,5 lg	100,0
12-57	КЭ	64,8	6,5 lg	100,0

Таким образом, примеры 1-6 подтверждают достижение заявляемого технического результата.

Источники информации

1. Чижов Н.П. Противовирусное действие нуклеаз и гистонов. // Вопросы вирусологии. - 1974. - № 6. - С.647-652.

2. Юсупова О.И. //Ферменты микроорганизмов. М.: Наука. - 1973. - 163 с.

3. Ильинская О.Н., Балабан Н.П., Вершинина В.И. и др. Стрептомицинустойчивый штамм Bacillus sp. ВКПМ В-9862 - продуцент внеклеточной щелочной рибонуклеазы. Патент 2384619.

4. Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование. Рига, 1989, с.3.

5. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз. М.: Наука, 1979, с.7.

6. Детиненко Л.Д., Клименко В.П., Подгорный В.Ф., Аликин Ю.С. Средство "Эндоглюкин" для профилактики и лечения вирусных заболеваний пчел и стимуляции развития пчелиных семей. Патент 2038776, 1995 г.

7. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхарда и др. - М.: Мир, 1983. - Т.1. - 536 с.; 1984. Т.3. 264 с.

8. "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology". 8th ed. / Ed. John G. Holt. - Baltimore-London, Williams and Wilkins, 1986. - V.1-2. - 1105 p.

9. Авторское свидетельство СССР № 928794, МПК C12N 1/20, C12N 9/16, опубл. 15.11.1993 (прототип).