штамм рекомбинантного вируса осповакцины, эксрессирующий структурные белки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей и пригодный для производства иммунобиологических препаратов и способ его получения

Формула изобретения

1. Штамм рекомбинантного вируса осповакцины ГКВ N 944, экспрессирующий структурные белки вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей и пригодный для производства иммунобиологических препаратов.

2. Способ получения штамма рекомбинантного вируса осповакцины ГКВ N 944, заключающийся в том, что из исходной плазмиды серии pUC8, содержащей ДНК-копию 26S-РНК вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВВЭЛ) длиной не менее 4000 п. н. имеющую сайт узнавания рестриктазой EcoRI на 3"-конце и сопряженные BamHI и SalGI-сайты на 5"-конце, удаляют SalGI-ApaI-фрагмент, обрабатывают плазмиду ДНК-полимеразой фага T4 для образования тупых концов, рециклизуют ДНК-лигазой фага T4, трансформируют полученной плазмидой клетки Escherichia coli и отбирают клоны с плазмидой, содержащей ДНК-копию только 26S-РНК ВВЭЛ без 5"-концевой последовательности, затем BamHI-EcoRI-фрагмент данной плазмиды соединяют с помощью ДНК-лигазы фага T4 с фрагментом, содержащим промотор гена белка 7,5 К вируса осповакцины, и плазмидой pTK 1285, гидролизованной рестриктазами SalGI и EcoRI, полученной рекомбинантной ДНК трансформируют клетки Escherichia coli, отбирают клоны с плазмидой, содержащей ДНК-копию 26S-РНК ВВЭЛ под контролем промотора 7,5 К в составе гена тимидинкиназы вируса осповакцины, выделяют указанную плазмиду, которую используют для рекомбинации с геномом вируса осповакцины, и отбирают путем селекции заданный штамм.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и, в частности к генетической инженерии, представляет собой штамм рекомбинантного вируса осповакцины, обуславливающий синтез структурных белков вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) в инфицированных клетках, и протективный иммунитет против ВЭЛ у вакцинированных им лабораторных животных, а также способ конструирования данного штамма.

Вирус ВЭЛ представляет собой один из наиболее патогенных для животных представителей рода Альфавирусов семейства Тогавирусов, вызывающий наиболее серьезные заболевания человека, грызунов и лошадей и приводящий, для целого ряда видов животных, к летальному исходу. Данный вирус переносится в природе несколькими видами москитов и вызывает широкомасштабные эпизоотии в Южной, Центральной и Северной Америке.

Для профилактики заболевания, вызванного вирусом ВЭЛ, в настоящее время применяется вакцинация людей и сельскохозяйственных животных живой вакциной на основе аттенуированных штаммов ТС-83 и 230, а также инактивированной вакциной, изготавливаемой на основе обработанного формалином вируса ВЭЛ, однако существует вероятность реверсии этих штаммов к вирулентному варианту [1] и включению ревертантов в природную циркуляцию [2] Кроме того, штаммы ТС-83 и 230 реактогенны (в 80% случаев), возможно обладают тератогенным потенциалом вируса ВЭЛ [3] и у 30% вакцинированных вызывают симптомы, сходные с симптомами заболевания ВЭЛ [4] Иммунизация же инактивированным вирусом предполагает использование больших количеств материала, что ведет к крупномасштабным наработкам патогена и высокой себестоимости такого рода вакцин.

В современной литературе описано несколько векторов, позволяющих экспрессировать чужеродные гены в эукариотических клетках. Созданные к настоящему времени вектора на основе ретровирусов, аденовирусов, папилломавирусов и паповавирусов обладают целым рядом существенных недостатков: малой скоростью размножения на культуре клеток, небольшой емкостью относительно встраиваемых генетических последовательностей, неспособностью размножаться в организме животных и др. [5] Определенные успехи по созданию рекомбинантных вакцин были достигнуты при использовании вируса осповакцины. В геном этого вируса были встроены последовательности генов гемагглютинина вируса гриппа [6] N- и G-белков вируса везикулярного стоматита [7] гликопротеина вируса бешенства [8] антигена малярийного плазмодия [9] и др. Во всех случаях наблюдалась эффективная экспрессия чужеродных для осповакцины белков в культуре клеток. В ряде случаев в организме вакцинированных животных были обнаружены антитела, специфичные к данным белкам и способные защищать от летальной инфекции, вызываемой вирусом, чьи гены были встроены в геном рекомбинантного вируса осповакцины. Потенциальная возможность экспрессии структурных белков альфавирусов в составе генома рекомбинантного вируса осповакцины была продемонстрирована на примере вируса Синдбис [10] В качестве прототипа выбран известный способ конструирования штаммов рекомбинантной осповакцины VACC/TRD и VACC/TC-83, экспрессирующих структурные белки американского варианта штамма Тринидад данки вируса ВЭЛ и полученного из него вакцинного штамма ТС-83 [11] который заключается в следующем:

1. Конструируется плазмида, содержащая последовательность генов структурных белков под контролем 7.5К промотора вируса осповакцины, фланкированную с двух сторон последовательностями гена тимидинкиназы (ТК) вируса осповакцины.

2. Проводится рекомбинация между "ТК-плечами" полученной плазмиды и ДНК генома ОВ в клетках, зараженных вирусом осповакцины.

3. Проводится отбор клонов рекомбинантного вируса осповакцины с фенотипом ТК^- на селективной среде, содержащей бромдезоксиуридин.

4. Проводится отбор методами гибридизации клонов осповакцины, имеющих фенотип ТК^-, содержащих в геноме последовательность встраиваемого гена.

5. Полученные клоны анализируются на культуре клеток для определения уровня экспрессии встроенных последовательностей.

Однако в каждом конкретном случае, в зависимости от последовательности, вводимой в геном осповакцины, и промотора, который выбирается для осуществления экспрессии, описанные этапы этой методики настолько сильно различаются, что она не может выступать в качестве универсальной. Наиболее близкой по структуре из всех встроенных последовательностей является область генов структурных белков американского варианта вируса ВЭЛ Тринидад данки. Однако, как показано нами ранее [12] нуклеотидные последовательности 26 S РНК используемого в прототипе американского и используемого нами отечественного варианта патогенного штамма вируса ВЭЛ Тринидад данки имеют ряд различий, приводящих к аминокислотным заменам в кодируемых 26 S РНК белках. В белке C 62-ой Ser на Pro; в белке 6К 48-ой Met на Val, 53-ий Ala на Gly, 54-ый Pro на Ala, 55-ый Ala на Gly и дополнительный Ala в положении 56; в белке Е2 (основной иммуноген) 85-ый His на Tyr, 147-ой Val на Ala, 187-ой Thr на Jle, 192-ой Val на Ala и 408-ой Jle на Met. Для введения генов структурных белков ВЭЛ в геном вируса осповакцины в прототипе предлагается использовать рестриктазу Tth III I, что приводит к удалению из встраиваемой ДНК-копии 26 S РНК 3"-нетранслируемой области вместе с поли-A трактом. Кроме этого, при использовании этой рестриктазы на 5"-конце встраиваемой ДНК-копии остается часть последовательности, кодирующей неструктурный белок nsp 4, способная помешать эффективной транскрипции последовательности, кодирующей структурные белки вируса ВЭЛ. В литературе отсутствует анализ защитных свойств рекомбинантного вируса VACC/TRD, несущего встройку 26 S РНК американского варианта штамма Тринидад данки вируса ВЭЛ.

Целью изобретения является создание штамма рекомбинантного вируса осповакцины, вызывающего синтез всех структурных белков вирулентного штамма TRD вируса ВЭЛ в инфицированных клетках и обеспечивающего эффективную защиту вакцинированных им лабораторных животных от летальной инфекции ВЭЛ.

Эта цель достигается путем встройки в ген тимидинкиназы коммерческого штамма вируса осповакцины-ЛИВП под контролем промотора белка 7,5К вируса ОВ последовательности, кодирующей только структурные белки вируса ВЭЛ (полноразмерной ДНК-копии всей 26 S РНК), для извлечения которой из ДНК-копии геномной РНК отечественного варианта вирулентного штамма ТРД вируса ВЭЛ, используется рестриктаза Apal, сайт узнавания которой расположен непосредственно перед 5"-концом субгеномной 26 S РНК и является уникальным для этой последовательности.

В результате полученный рекомбинантный штамм осповакцины содержит в геноме, по сравнению с исходным коммерческим осповакцинным штаммом (ЛИВП), дополнительную последовательность, состоящую: 1) из фрагмента длиной 300 н.п. включающего в себя район промотора гена белка 7,5К; 2) из фрагмента длиной около 4000 п.о. содержащего последовательность генов белков C, Е3, Е2, 6К и Е1 вируса ВЭЛ, отечественного варианта штамма Тринидад данки, в указанном порядке; встроенная ДНК-копия 26 S РНК не имеет на 5"-конце других последовательностей геномной РНК ВЭЛ, способной помешать транскрипции [12] Схема встроенного фрагмента приведена на фиг. 1. Необходимо отметить, что встройка полноразмерной ДНК-копии 26 S РНК вирулентного штамма вируса ВЭЛ ведет к формированию наиболее полноценного иммунного ответа против вируса ВЭЛ.

Указанная встройка проводится в два этапа. На первом этапе из фрагмента ДНК-копии геномной РНК вируса ВЭЛ удаляют последовательность генов неструктурных белков, которые могут помешать впоследствии правильной трансляции, после чего перечисленные выше фрагменты, содержащие последовательности промотора и генов структурных белков ВЭЛ, собирают в составе единой плазмиды внутри гена тимидинкиназы вируса осповакцины. Для этого используются следующие плазмиды: 1) плазмида на основе вектора pUC8 (pVE-4, pVET7-91, pVEI47), содержащая последовательность 5"-конца 26 S РНК вируса ВЭЛ длиной по крайней мере 4000 п. о. и COOH-концевую область гена белка Nsp4; 2) плазмида, содержащая клонированный между сайтами рестрикции SalGI и BamHI полилинкера SalGI-HinfI фрагмент ДНК вируса осповакцины, штамм WR, размером 253 п.н. соответствующий промотору гена белка 7,5К этого вируса [13] (обозначена как p7,5K); 3) плазмида pTK1285 [14] содержащая последовательность гена тимидинкиназы вируса осповакцины, штамм ЛИВП, со встроенным полилинкером.

Этот этап конструирования нового штамма заключается в удалении из любой из плазмид, упомянутых выше в пункте 1 (например pVE4, pVET7-91, либо pVE147) фрагмента кДНК, соответствующего области неструктурных белков вируса ВЭЛ. Для этого плазмиды разрезают по уникальному сайту рестрикции ApaI, прилегающему непосредственно к началу субгеномной 26 S РНК вируса ВЭЛ, и одному из сайтов рестрикции расположенных в полилинкере векторной плазмиды (SalGI, либо BamHI), после чего гидролизат обрабатывают ДНК-полимеразой фага Т4 согласно [15] с последующей циклизацией плазмиды с помощью ДНК-лигазы фага Т4. После трансформации клеток E.coli полученной лигазной смесью отбирают клоны, в плазмидах которых отсутствует SalGI-ApaI-фрагмент, соответствующий области неструктурных белков вируса ВЭЛ, размер которого может варьировать в зависимости от исходно выбранной из клонотеки плазмиды, и восстановлен сайт узнавания рестриктазы SalGI. Из отобранных клонов E.coli выделяют плазмиду, обозначенную как pVE5.

Затем ДНК плазмиды рТК1285 гидролизуют эндонуклеазами рестрикции SalGI и EcoRI, после чего продукт гидролиза с помощью ДНК-лигазы фага Т4 соединяют с фрагментами SalGI-BamHI плазмиды р7,5К и BamHI-EcoRI плазмиды pVE5. После трансформации клеток E. coli из выросших клонов выделяют плазмиду, обозначенную как pVE5.1. Эта плазмида содержит ген тимидинкиназы вируса осповакцины, штамм ЛИВП, в кодирующей части которого встроена последовательность кДНК-копии 26 S РНК вируса ВЭЛ (с возможным сопутствующим фрагментом другой плазмиды на ее 3"-конце) под контролем промотора гена белка 7,5К вируса осповакцины.

Второй этап работы заключается в осуществлении рекомбинации между ДНК коммерческого штамма ЛИВП вируса осповакцины и ТК-плечами плазмиды pVE5.1, что достигается путем контрансфекции ими монослоя клеток CV-1, инфицированного этим же вирусом, с последующей селекцией рекомбинантных клонов осповакцины по приобретаемому ими ТК^- -фенотипу на культуре клеток Human 143 (ТК^-) в присутствии 5-бром-2"-дезоксиуридина и способности гибридизирования с радиоактивным зондом, комплементарным встроенным чужеродным генам, приготавливаемым на основе плазмиды pVE4. Дальнейшая характеризация клонов осповакцины проводится путем излучения продуктов экспрессии ее генов в культуре зараженных клеток с помощью сывороток, специфичных к поверхностным белкам ВЭЛ, а также путем изучения защитного эффекта против инфекции вирусом ВЭЛ, возникающего при иммунизации животных рекомбинантным вирусом осповакцины.

Полученный в результате рекомбинантный штамм вируса осповакцины принадлежит к семейству Poxviridae роду Orthopoxvirus и обладает свойствами типичного представителя рода ортопоксвирусов. Имеет криптограмму: Т/2:160/5: X/^*:Y/0.

Вирионы имеют характерную форму брикета с размером 200х300 нм и по данным электронной микроскопии не отличаются от исходного штамма вируса осповакцины ЛИВП, то есть имеют нуклеопротеиновую сердцевину двояковогнутой формы, в углублениях которой расположены так называемые боковые тельца. Различают два типа варионов: внутриклеточный, покрытый одной липопротеиновой оболочкой, и внеклеточный, имеющий дополнительную оболочку, образующуюся в результате почкования вируса из клетки.

Физико-биохимическая характеристика и культуральные свойства штамма.

Основными компонентами вириона являются: белки ( 90%), липиды ( 5%) и ДНК ( 4% ). Геном рекомбинантного штамма вируса осповакцины представлен двухцепочечной ДНК размером 190000 п.н. которая в кодирующей части гена тимидинкиназы содержит ДНК-копию субгеномной 26 S РНК отечественного варианта вируса ВЭЛ Тринидад данки под контролем промотора белка 7,5К вируса осповакцины. В Hind III гидролизате изолированной вирусной ДНК рекомбинантного штамма вместо Hind III-K-фрагмента ДНК исходного штамма ЛИВП присутствуют два фрагмента, имеющих размеры около 800 и 9000 п.н. последний из которых по данным ДНК-ДНК блот-гибридизации содержит гены, кодированные в субгеномной 26 S РНК вируса ВЭЛ.

При размножении рекомбинантного штамма на куриных эмбрионах характер поражений на хорионаллантоисной оболочке аналогичен поражениям, образуемым штаммом ЛИВП, и через 48 ч инкубации при 37^oC дает сливные поражения при дозе 10⁵ о.о.е. на эмбрион. Кроме того, полученный рекомбинантный штамм достоверно не отличается от штамма ЛИВП по продуктивности в монослое перевиваемых линий клеток CV-1, Human 143 (ТК^-), Rat 2 и суспензионной культуре ВНК21, давая конечные титры, аналогичные титрам исходного вируса осповакцины. В отличие от штамма ЛИВП полученный рекомбинантный штамм обладает ТК^--фенотипом и способен репродуцироваться на перевиваемых линиях клеток Human 143 (TK^-) и Rat 2 в присутствии 25 мкг/мл 5-бром-2"-дезоксиуридина.

Патогенность для животных.

Исследование свойств полученного рекомбинантного штамма вируса осповакцины при внутрибрюшинном, подкожном и интраплантарном введении различных доз белым беспородным мышам, а также при внутрикожном введении кроликам показало, что по токсичности и некротической активности рекомбинантный штамм не отличается от исходного штамма ЛИВП.

Основным существенным отличием рекомбинантного штамма от штамма ЛИВП является способность экспрессировать на плазматической мембране инфицированных полученным штаммом клеток гликопротеины суперкапсидной оболочки вируса ВЭЛ.

Штамм рекомбинантного вируса осповакцины VR26S с встроенной ДНК-копией 26 S РНК отечественного варианта вируса ВЭЛ Тринидад данки в литературе не описан и обладает существенными отличиями от известных штаммов рекомбинантных вирусов. Данный штамм депонирован в Государственной коллекции вирусов. Штамму присвоен номер депонента ГКВ N 944.

Существенные отличия предлагаемого способа получения рекомбинантного вируса осповакцины заключаются в следующем: для встройки вирионных белков генов ВЭЛ в геном отечественного коммерческого штамма осповакцины ЛИВП может быть использована любая исходная плазмида, содержащая вставку ДНК, комплементарной COOH-концевой области гена белка NS4, начала субгеномной 26 S РНК ВЭЛ и последовательности, кодирующей структурные белки, включающей в себя гены белка С, Е3 и Е2; добавление к этой последовательности генов белков 6К и Е1 приводит к появлению более полноценного иммунного ответа к ВЭЛ у лабораторных животных после вакцинации таким вирусом рекомбинантной осповакцины. Вторым существенным отличием предлагаемого метода является использование в процессе конструирования рестриктазы ApaI. Сайт узнавания данной рестриктазы находится в последовательности гена белка NS4 непосредственно перед началом 26 S РНК и ее использование позволяет отщепить мешающие эффективной трансляции последовательности гена неструктурного белка без использования трудоемких процедур, таких как, например, гидролиз нуклеазой Bal 31.

Существенные признаки полученного штамма рекомбинантной осповакцины состоят в следующем:

во-первых, штамм получен на основе отечественного коммерческого вакцинного штамма вируса осповакцины ЛИВП;

во-вторых, на плазматической мембране клеток, инфицированных рекомбинантным вирусом, экспрессируются гликопротеины суперкапсидной оболочки вируса ВЭЛ;

в-третьих, двукратная иммунизация животных полученным штаммом вируса осповакцины приводит к появлению в их крови высокого титра антител, специфичных к вирусу ВЭЛ, и защите от летальной инфекции, вызываемой последующим введением больших доз вируса ВЭЛ.

Существенным признаком способа получения штамма рекомбинантного вируса осповакцины является то, что в геном отечественного коммерческого штамма ЛИВП вируса осповакцины встраивается чужеродный генетический материал, состоящий из генов структурных белков вируса ВЭЛ, штамм Тринидад данки (Сов), под контролем промотора гена белка 7,5К ОВ. Отбор клонов рекомбинантного штамма проводится по наличию эффекта защиты иммунизированных им лабораторных животных от летальной инфекции, вызываемой введением больших доз патогенного вируса ВЭЛ.

На фиг. 1 показана схема конструирования генома штамма рекомбинантного вируса осповакцины, содержащего ДНК-копию 26 S РНК вируса ВЭЛ в составе гена тимидинкиназы под контролем промотора гена белка 7,5К.

Буквами обозначены сайты узнавания следующих рестриктаз: E EcoRI, B - BamHI, S SalGI, P PstI, A ApaI, C ClaI, X XmaI, H Hind III

В последней строке приведена схематическая карта рестрикции рестриктазой Hind III генома вируса осповакцины.

На фиг. 2 радиоиммунологический анализ проб с использованием: А) кроличьей антисыворотки против вируса ВЭЛ и Б) моноклонального антитела В5, специфичного к белку Е2 вируса ВЭЛ.

1,8 исходные клетки Human 143;

2,3 клетки Human 143, взятые через 4 и 8 ч после заражения исходным штаммом ЛИВП вируса осповакцины;

4,5 клетки Human 143, взятые через 4 ч после заражения рекомбинантными клонами 159 и 3110 соответственно;

6,7 то же самое, но через 8 ч после заражения;

9 то же, что и 3, но с использованием моноклонального антитела;

10,11 то же, что и 6, 7, но с использованием моноклонального антитела.

Способ получения штамма рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего гены структурных белков ВЭЛ, его наработки, хранения и исследования иммуногенных свойств иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1.

Клетки бактерий Escherichia coli, содержащие плазмидную ДНК pVE4 (см. фиг. 1), наращивают в 100 мл бульона до насыщения. Плазмидную ДНК выделяют согласно общепринятой методике. Проводят совместный гидролиз 1 мкг плазмидной ДНК рестриктазами ApaI (10 ед. акт.) и SalGI в течение 3 ч при 37^oC; после завершения инкубации следует фенольная депротеинизация с последующим спиртовым осаждением.

Далее ведут достройку концов плазмидной ДНК до тупых, проводят в буфере В (0,033 М трис-ацетат pH 7,9; 0,66 М ацетат калия; 0,01 М ацетат магния; 0,001 М 2-меркаптоэтанол) ДНК-полимеразой фага Т4 (1 ед. акт.) (при комнатной температуре в течение 10 мин). Первые 2 мин инкубация проводится в отсутствии нуклеозидтрифосфатов, затем их добавляют до концентрации 0,1 мМ. После фенольной депротеинизации и спиртового осаждения плазмиду циклизуют с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (0,1 ед. акт.) в буфере C (0,05 М трис-HCl pH 7,5; 0,025 М MgCl₂; 0,01 М NaCl; 0,005 М 2-меркаптоэтанол; 0,1 мМ АТФ) в течение 1 ч при 12^oC.

Трансформацию клеток проводят следующим образом: 0,1 мл суспензии клеток E. coli jM 103 вносят в 20 мл питательного бульона LB и выращивают до титра 510⁸ клеток/мл. Клетки из 3 мл среды собирают центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин, 0^oC), ресуспендируют в 1 мл буфера I (0,01 М MOPS pH 7,0; 0,01 М RbCl), осаждают центрифугированием, суспендируют в 1 мл буфера B (0,1 М MOPS pH 6,5; 0,05 М CaCl₂; 0,01 М RbCl) и оставляют на 15 мин во льду. После этого клетки снова собирают центрифугированием, суспендируют в 200 мкл буфера I, добавляют 3 мкл ДМСО, плазмидную ДНК в объеме 10 мкл и оставляют во льду на 30 мин. После завершения инкубации клеточную суспензию прогревают в течение 30 с при 44^oC, разбавляют в 25 раз бульоном LB, выдерживают 30 мин при 37^oC и высевают на агаризованную среду LB, содержащую ампициллин в концентрации 25 мкл/мл. Из клеток, выросших через 18 ч клонов, выделяют ДНК плазмиды, обозначенной нами как pVE5, по описанной выше методике. Данная плазмида содержит последовательность только ДНК-копии 26 S РНК вируса ВЭЛ без лишней 5"-концевой последовательности.

Гидролиз ДНК плазмид: pVE5 (10 мкг) рестриктазами BamHI и EcoRI, р7,5К (10 мкг) рестриктазами SalGI и BamHI, рТК1285 (10 мкг) рестриктазами SalGI и EcoRI, проводят, используя по 20 ед. акт. каждой из рестриктаз, в течение 8 ч при 37^oC. После фенольной депротеинизации фрагменты плазмид pVE5 и p7,5K были выделены путем разделения гидролизованной ДНК в 4% полиакриламидном геле с последующей электроэлюцией на бумагу DE-81.

Соединение фрагментов плазмид pVE5 и p7,5K в составе плазмиды рТК1285 проводят в 10 мкл буфера С в вышеописанных условиях. Векторная линеаризованная плазмида и рестрикционные фрагменты подобраны таким образом, что возможен единственный вариант их взаимной сшивки.

Полученную лигазную смесь используют для трансформации клеток E.coli, штамм jM 108. Условия трансформации описаны выше. Из клеток, выросших через 18 ч клонов, выделяют плазмидную ДНК в аналитических количествах и проводят анализ вставок с помощью рестриктаз EcoRI, PstI, SalGI и BamHI. Около 80% клонов содержат плазмиды с необходимыми последовательностями. Из этих клонов выделяют плазмиду, обозначенную нами как pVE5.1, которую после очистки щелочным методом и равновестным ультрацентрифугированием используют для проведения рекомбинации с геном вируса осповакцины.

Для получения рекомбинантного варианта вируса осповакцины, экспрессирующего структурные белки вируса ВЭЛ, монослой культуры клеток CV-1 инфицируют вирусом осповакцины штамм ЛИВП (0,04-0,05 о.о.е./клетку) и инкубируют на среде MEM, содержащей 2% эмбриональной телячьей сыворотки (ТС). Через 2 ч после начала инфекции на монослой клеток (25 см²) наносят по 0,8 мл кальцийфосфатного преципитата ДНК pVE5.1.

Монослой с нанесенным копреципитатом инкубируют 30 мин при 37^oC, заливают 7,2 мл среды МКМ, содержащей 8% ТС, инкубируют при 37^oC еще 4 ч, после чего меняют среду на 5 мл свежей и продолжают инкубацию при 37^oC еще в течение 48 ч. Затем клетки дважды замораживают оттаивают, ресуспендируют в среде и полученное таким образом вирусное потомство используют для селекции рекомбинантных вариантов вируса ОВ.

Селекцию проводят в несколько этапов согласно методике, описанной в [5]

Первый этап селекции заключается в клонировании вирусного потомства на монослое клеток Human 143 (TK^- в присутствии 5-бром-2"-дезоксиуридина. При этом отбираются клоны вируса ОВ, имеющие фенотип (ТК^-). Второй этап селекции состоит в анализе (TK^-) клонов ОВ методом дот-гибридизации на наличие в вирусном геноме встроенных генов. [³²P]-меченый зонд приготавливается на основе вставки плазмиды pVE4 методом никтрансляции согласно методике, описанной в [15]

В результате проведенного анализа было отобрано 2 клона рекомбинатного вируса ОВ: v713-31 и v713-15 со встроенными в геном последовательностями генов структурных белков ВЭЛ. После повторного клонирования вируса из этих клонов и гибридизации ДНК по аналогичной схеме с таким же зондом для дальнейшей работы были использованы клоны v713-159 и v 713-3110. После того, для постановки дополнительного контроля из рекомбинатного вируса путем фенольной экстракции согласно [5] была выделена геномная ДНК, которую гидролизовали рекстриктазой Hind III с последующим анализом фрагментов гидролиза электрофорезом в 0,8% агарозном геле согласно [15] при этом был обнаружен дополнительный фрагмент размером около 9000 п.о. содержащий последовательности части гена тимидинкиназы, 26 S РНК и РstI-EcoRI-фрагмента плазмиды pBR322. Вновь появившийся фрагмент гибридизуется с радиоактивным зондом, комплементарным генам структурных белков вируса.

Клоны полученного рекомбинантного вируса ОВ были наработаны на культуре клеток ВНК-21 и очищены по [11] Эти вирусные препараты были использованы для заражения монослоя клеток Human 143 с множественностью 10-20 00E/клетку. Уже через четыре часа после заражения на поверхностной мембране клеток с помощью твердофазного радиоиммунного анализа, описанного в [10] были выявлены структурные белки ВЭЛ. В этих экспериментах были использованы гипериммунные кроличьи сыворотки, специфичные к вирионным белкам ВЭЛ. Результаты этих экспериментов приведены на фиг. 2.

Пример 2.

Клетки бактерий E.coli, содержащие плазмидную ДНК pVET7-91 с полноразмерной ДНК-копией генома вируса ВЭЛ, имеющую на 3"-конце сайт узнавания рестриктазы Hind III, наращивают в 100 мл бульона до насыщения. Плазмидную ДНК выделяют согласно общепринятой методике. Далее 10 мкг плазмиды гидролизуют рестриктазой ApaI (10 ед. активности, 3 ч, 37^oC) и после фенольной депротеинизации и спиртового осаждения достраивают концы линеаризованной плазмидной ДНК до тупых, как и в примере 1. После фенольной обработки и спиртового осаждения плазмидную ДНК дорезают рестриктазой Hind III и с помощью гель-электрофореза и электроэлюции на бумагу DE-81 выделяют фрагмент 4000 п.о. согласно методике [15] Векторную плазмиду pUC8 линеарезуют рестриктазой SalGI и достраивают ее концы до тупых фрагментом Кленова ДНК-полимеразы из E. coli, согласно [15] затем проводят дополнительный гидролиз рестриктазой EcoRI. Полученный вектор циклизуют с помощью ДНК-лигазы фага Т4, согласно описанной в примере 1 методике, в присутствии выделенного при помощи рестриктазы ApaI фрагмента 4000 п.о. плазмиды pVET7-91 и дополнительного EcoRI-Hind III полилинкерного фрагмента из плазмиды pUC18, имеющего размер 55 п. о. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli, выросшие в присутствии ампициллина на LB-агаре колоний, нарабатывают в аналитических количествах в LB-бульоне и выделяют из них плазмидные ДНК, которые анализируют на наличие и правильную ориентацию встройки при помощи рестриктаз BamHI и EcoRI.

Полученная в результате этих генно-инженерных манипуляций плазмида содержит последовательность только ДНК-копии 26 S РНК вируса ВЭЛ без лишней 5"-концевой последовательности и полностью эквивалентна плазмиде pVE5 по расположению сайтов узнавания используемых далее рестриктаз (см. схему конструирования рекомбинантного вирусного генома на фиг. 1). ДНК сконструированной плазмиды используют далее для получения инсерционной плазмиды pVE5.1, как описано в примере 1.

Пример 3.

Клетки бактерий E. coli, содержащие плазмидную ДНК pVE-147, несущую встройку 9800 3"-концевых оснований ДНК-копии генома вируса ВЭЛ и имеющую на 3"-конце этой встройки сайт узнавания рестриктазы Hind III, наращивают в 100 мл бульона до насыщения. Плазмидную ДНК выделяют согласно общепринятой методике. Далее 10 мкг плазмиды гидролизуют рестриктазой ApaI (10 ед. активности, 3 ч, 37^oC) и после фенольной депротеинизации и спиртового осаждения достраивают концы линеаризованной плазмидной ДНК до тупых как и в примере 1. После фенольной обработки и спиртового осаждения плазмидную ДНК дорезают рестриктазой Hind III и с помощью гель-электрофореза и электроэлюции на бумагу DE-81 выделяют фрагмент 4000 п.о. согласно методике [15] Векторную плазмиду pUC8 линеаризуют рестриктазой SalGI и достраивают ее концы до тупых фрагментом Кленова ДНК-полимеразы из E.coli, согласно [15] затем проводят дополнительный гидролиз рестриктазой EcoRI. Полученный вектор циклизуют с помощью ДНК-лигазы фага Т4, согласно описанной в примере 1 методике, в присутствии выделенного при помощи рестриктазы ApaI фрагмента 4000 п.о. плазмиды pVE-147 и дополнительного EcoRI-Hind III полилинкерного фрагмента из плазмиды pUC18, имеющего размер 55 п.о. Полученной лигазной смесью трансформируют клетки E.coli, выросшие в присутствии ампициллина на LB-агаре колоний, нарабатывают в аналитических количествах в LB-бульоне и выделяют из них плазмидные ДНК, которые анализируют на наличие и правильную ориентацию встройки при помощи рестриктаз BamHI и EcoRI.

Полученная в результате этих генно-инженерных манипуляций плазмида содержит последовательность только ДНК-копии 26 S РНК вируса ВЭЛ без лишней 5"-концевой последовательности и полностью эквивалентна плазмиде pVE5 по расположению сайтов узнавания используемых далее рестриктаз (см. схему конструирования рекомбинантного вирусного генома на фиг. 1). ДНК сконструированной плазмиды используют далее для получения инсерционной плазмиды pVE5.1, как описано в примере 1.

Пример 4.

100-300 шт 11-дневных куриных эмбрионов инфицируют маточным материалом рекомбинантного вируса осповакцины VR26S, вводя внутрь воздушного мешка на хорионаллантоисную оболочку (ХАО) эмбриона по 0,1-0,2 мл вируссодержащей суспензии, имеющей титр 10⁵ 10⁶ о.о.е./мл. Зараженные эмбрионы инкубируют 48 ч при 37^oC, затем стерильно вскрывают и отделяют участки ХАО со сливным поражением. Собранный материал отмывают от посторонних включений в стерильном растворе Хенкса, добавляют к нему 2 объема стерильного 0,01 М буферного раствора трис-HCl pH 9,0 и гомогенизируют 5 мин в механическом гомогенизаторе, охлаждая смесь на ледяной бане. Полученную суспензию осветляют центрифугированием (10 мин, 750 g, 4^oC), полученный в результате супернатант наслаивают на 1/5 от объема супернатанта часть 36% раствора сахарозы в 0,01 М трис-HCl pH 9,0 и центрифугируют (30 мин, 23000 g, 4^oC). Все супернатанты осторожно удаляют, а осадок ресуспендируют в 40 мл 0,01 М раствора трис-HCl pH 9,0 гомогенизируют 1 мин и 30 с обрабатывают ультразвуком, а затем повторяют этап центрифугирования через "подушку" 36% раствора сахарозы. Полученный осадок молочнобелого цвета суспендируют в стерильном растворе Хенкса из расчета 1 мл на 5 инфицированных эмбрионов, обрабатывают 30 с ультразвуком, расфасовывают по 1 мл в стерильные микропробирки, замораживают и хранят до использования при -40^oC. Для определения титра вируса в полученном материале, обычно имеющего значения 410⁸ о.о.е./мл. размораживают одну из аликвот. Все операции по инфицированию, обработке куриных эмбрионов и очистке вируса проводят в стерильных условиях.

Для длительного хранения препаратов рекомбинантного штамма применяют технологию хранения природных штаммов ортопоксвирусов. Осветленную суспензию гомогената ХАО инфицированных куриных эмбрионов лиофильно высушивают на коллекторной сушильной установке в течение 22-24 ч. Готовые препараты хранят в ампулах, запаянных под вакуумом, при температуре минус (202^o)C.

Пример 5.

Маточный материал рекомбинантного вируса осповакцины, прошедший контроль на стерильность и наличие посторонних гемагглютинирующих примесей, с определенным титром, вводят внутрикожно в 3-4 точки лопаточной области кроликам весом 3-4 кг. Таким же образом проводится повторная вакцинация через 28 дней. Инфицирующая доза рекомбинантного вируса ОВ в обоих случаях составляет 510⁷ 10⁹ 00E на каждого кролика. Через 7 дней после повторной иммунизации каждому животному вводится подкожно по 100 ЛД₅₀ вируса ВЭЛ. Наблюдение за кроликами проводится еще в течение 14 дней. Все кролики, прошедшие двукратную иммунизацию, остаются живы и не обнаруживают признаков заболевания, тогда как все не вакцинированные или вакцинированные теми же дозами исходного коммерческого штамма вируса осповакцины ЛИВП, погибают на 5-7 день.

Тот же маточный материал рекомбинантного вируса вводят внутрибрюшинно беспородным белым мышам самцам весом 7-10 г в дозе 10⁷ о.о.е. на мышь. Повторную иммунизацию такой же дозой проводят на 21 день, а еще через 7 дней мышам вводят подкожно по 100 ЛД₅₀ вируса ВЭЛ. В этом эксперименте в качестве контрольных были использованы группы чистых мышей и мышей, прошедших двух- и однократную иммунизацию такими же дозами исходного штамма вируса ОВ ЛИВП.

Результаты эксперимента приведены в табл. 1.

У вакцинированных животных в разные сроки после иммунизации вирусом рекомбинантной ОВ берут кровь для определения концентрации антител, специфичных к ВЭЛ. Для этого используют следующий вариант твердофазного радиоиммунного анализа: 300 нг вируса ВЭЛ в 10 мкл буфера TBS (0,01 М трис-HCl pH 7,5; 0,1 М NaCl), содержащего 1% додецилсульфата натрия, наносят в лунки полистирольных плат и высушивают при 37^oC, лунки промывают этанолом и инкубируют с 20 мл буфера РИА (0,05 М трис-HCl pH 7,5; 0,5 М LiCl; 0,15 М NaCl; 0,1% тритон X 100), содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина, а затем с 20 мкл буфера РИА, содержащего 5-кратные разведения сыворотки (по 1 ч при 37^oC); после завершения инкубации лунки промывают и вносят по 20 мкл раствора [¹²⁵I] меченого белка A (в каждую лунку по 210⁵ имп/мин), инкубируют 1 ч при 37^oC и отмывают от несвязавшейся радиоактивности буфером РИА. Связавшийся радиоактивный белок А смывают М NaOH, определение радиоактивности проводят на радиоспектрометре. В случае анализа мышиных сывороток перед связыванием [¹²⁵I]-меченого белка А необходима дополнительная инкубация с кроличьей сывороткой против мышиных IgG. Под титром сыворотки понимается максимальное ее разведение, при котором количество связавшегося белка А в 2 раза превышает фоновые значения.

Результаты приведены в табл. 2.

Из этих данных следует, что двукратная иммунизация лабораторных животных получаемым штаммом рекомбинантного вируса осповакцины приводит к появлению у них в крови высокой концентрации антител, специфично связывающихся со структурными белками ВЭЛ.

Предлагаемое изобретение позволяет получить штамм рекомбинантного вируса осповакцины, вызывающего синтез всех структурных белков ВЭЛ в инфицированных клетках, наработку в высокой концентрации антител к вирусу ВЭЛ в организме вакцинированных рекомбинантной вакциной животных, а также защиту животных от летальной инфекции ВЭЛ.

Титр антител, специфичных к белкам ВЭЛ, в сыворотке крови дважды вакцинированных таким же штаммом животных составляет 1: 3000 1: 4000 для кроликов и 1: 625 1: 2000 для мышей.

Такая концентрация специфических иммуноглобулинов сравнима с концентрацией аналогичных антител, появляющихся в крови после иммунизации животных вакцинными штаммами ВЭЛ и в десятки раз превышает концентрацию антител в крови животных, иммунизированных убитыми цельновирионными вакцинами.

Такой рекомбинантный вирус осповакцины может быть основой для разработки нового поколения вакцин против ВЭЛ и приготовления иммунологических диагностикумов. По сравнению с аттенуированными штаммами рекомбинантный вирус ОВ не может обладать способностью реверсии к патогенному штамму ВЭЛ, не реактогенен, легко нарабатывается и не требует при работе с ним специальных мер предосторожности. По сравнению с убитыми цельновирионными вакцинами такой штамм имеет следующие преимущества: во-первых, не нужны крупномасштабные наработки с последующим выделением вируса, что может значительно снизить себестоимость вакцин; во-вторых, для убитых вакцин не исключена возможность неполной инактивации активного материала, что приводит к развитию заболевания, живая вакцина на основе рекомбинантной ОВ такими недостатками обладать не будет.

Полученный положительный эффект достигается за счет встройки полноразмерной ДНК-копии 26 S РНК, кодирующей структурные белки ВЭЛ под контролем промотора гена белка 7,5К осповакцины в ген тимидинкиназы генома коммерческого штамма осповакцины ЛИВП. Эффективность экспрессии генов ВЭЛ этим штаммом обеспечивается за счет использования фрагмента ДНК, включающего в себя ДНК-копию области только генов структурных белков геноса ВЭЛ, что приводит к сохранению правильного места инициации синтеза белка-предшественника, порядка трансляции и транспорта структурных белков ВЭЛ на клеточную мембрану, где они с большой эффективностью представляются иммунной системе организма. Высокая эффективность транскрипции обеспечивается использованием природного сильного промотора гена белка 7,5К вируса осповакцины, это определяет высокую эффективность работы собранной конструкции.

Таким образом, предлагаемый способ конструирования позволяет получить штамм рекомбинантного вируса осповакцины, обеспечивающий защиту лабораторных животных от летальной инфекции, называемой вирусом Венесуэльского энцефаломиелита лошадей.

ЛИТЕРАТУРА

1. Berge T.O. Banks I.O. Tigertt W.D. Attenuation of Venezuelan equine encephalomyelitis virus by in vitro cultivation in guinea-pig heart cells. //American Journal of Higiene. 1961. V.73. P. 209-218.

2. McKinney R.W. Inactivated and live VEE vaccines-a review. // In Venezuelan encephalitis. Scientific Publication: Washington, D.C. Pan American Health Organization. 1972. N 243. P. 369-384.

3. London W.T. Levitt N.H. Kent S.G. Wong V.G. Sever J.L. Corgenital cerebral and ocular malformations induced in Rhesus monkeys by Venezuelan equine encephalitis virus. // Teratology. 1977. V.16. P. 285-296.

4. Edelman A. Asher M.S. Oster C.N. Evaluation in human of a new inactivated vaccine for Venezuelan equine encephalitis virus (C-84) // J. Inphect. Dis. 1979. V.140. N 5. P. 516-520.

5. Мэкетт М. Смит Дж. Мосс Б. Создание рекомбинантных конструкций на основе вируса осповакцины для экспрессии чужеродных генов. // Клонирование ДНК. Методы. Мир: М. 1988 г. 538 с.

6. Smith G.L. Murphy B.R. Moss B. Construction and characterization of an infectious vaccinia virus recombinant that expresses the influenza hemagglutinin gene and induces resistance to influenza virus infection in hamsters. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V.80. N 3. P. 7155-7159.

7. Mackett M. Gilma T. Rose G.K. Moss B. Vaccinia virus recombinants: expression of VSV genes and protective immunization of mice and cattle. // Science. 1985. V.227. N 4552. P. 433-435.

8. Kieny M. P. Lathe R. Drillien R. et al. Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus. // Nature. 1984. V.132. - P. 163-166.

9. Langfort C. G. Stirling G.E. Smith G.L. et al. Anchoring a secreted plasmodium antigen on the surface of recombinant vaccinia virus infected cells increased its immunogeneicity. // Mol. Cell. Biol. 1986. V.6. N 9. P. 3191-3199.

10. Rice C.M. Franke C.A. Strauss J.H. Hruby D.E. Expression of Sindbis virus structural proteins via recombinant vaccinia virus: synthesis, processing, and incorporating into mature Sindbis virions. // J. Virol. - 1985. V. 56. N 1. P. 227-229.

11. Kinney R.M. Esposito J.J. Johnson B.L.B. Roehrig J.T. Matheus J.H. Barrett A.D.T. Trend D.W. (1988) Recombinant vaccinia/Venezuelan equine encephalitis (VEE) virus expresses VEE structural proteins. // J. gen. Virol. 1988. V.69. N 12. P. 3005-3013.

12. Фролов И.В. Колыхалов А.А. Волчков В.Е. Нетесов С.В. Сандахчиев Л.С. Сравнение аминокислотных последовательностей структурных белков аттенуированных и патогенных штаммов вируса Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. // Доклады АН СССР. 1991. Т.318. N 6. С. 1488-1491.

13. Venkatesan S. Baroudy B.M. Moss B. Distinctive nucleotide sequences adjacent to multiple initiation and termination sites of an early vaccinia virus gene. // Cell. 1981. V.25. N 3. P. 805-813.

14. Урманов И.Х. Приходько Г.Г. Серпинский О.И. Микрюков Н.Н. Чижиков В. Е. Плазмида pTK1285 для введения чужеродных генов в геном вируса осповакцины и метод ее конструирования. // Авторское свидетельство N 1640164. 8 декабря 1990 г.

15. Маниатис Т. Фрич Э. Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. Мир: М. 1984. 480 с.