способ получения фрадизина

Формула изобретения

Способ получения фрадизина, включающий выращивание культуры Streptomyces fradiae в ферментационной среде на основе мелассы, кальция углекислого, муки и воды в условиях термостатирования и аэрации среды с последующим обезвоживанием культуральной жидкости и смешиванием целевого продукта с наполнителем, отличающийся тем, что выращивание культуры осуществляют на среде, содержащей следующие компоненты, г/л:

Меласса свекловичная - 23,0 - 27,0

Мука пшеничная - 13,0 - 17,0

Глютен кукурузный - 8,0 - 12,0

Масло соевое или жир животный - 10,0 - 12,0

Дрожжи кормовые - 2,0 - 3,0

Кальций углекислый - 1,8 - 2,2

Однозамещенный фосфорнокислый аммоний - 0,8 - 1,2

Хлористый натрий - 0,8 - 1,2

Вода - До 1 л

термостатирование проводят при температуре 35 - 37^oС в течение первых 10 - 12 ч с последующим ее снижением до 28 - 30^oС за 4 - 6 ч и поддержанием на этом уровне до конца процесса и при уровне аэрации 0,5 - 0,6 л воздуха/л среды в 1 мин в течение первых суток с последующим увеличением ее интенсивности до 1,0 - 1,2 л воздуха/л среды в 1 мин в течение 2 - 5 суток и дальнейшем снижением до 0,7 - 0,9 л воздуха/л среды в 1 мин и поддержанием на этом уровне до конца процесса.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения фрадизина - препарата макролидного антибиотика тилозина сельскохозяйственного назначения. Фрадизин представляет собою обезвоженную культуральную жидкость продуцента антибиотика тилозина Streptomyces fradiae с внесенными в нее при необходимости наполнителями.

Фрадизин может выпускаться в виде сухого препарата ( если культуральная жидкость обезвожена полностью) или в виде жидкого препарата (если культуральная жидкость обезвожена частично).

Известные способы получения фрадизина заключаются в том, что культуру Str.fradiae выращивают на ферментационной среде при постоянной температуре и при постоянном уровне аэрации, после чего культуральную жидкость обезвоживают и вносят наполнитель.

Известен, например, способ получения фрадизина, предусматривающий выращивание культуры Str. fradiae NRRL 2702 на ферментационной среде, содержащей, мас. %; крахмал 4,0; меласса 2,0; мука рыбная 2,0; кальций углекислый 0,2, при температуре 25^oC и при уровне аэрации, равном 1 л воздуха/л среды в минуту, после чего культуральную жидкость высушивают [1].

В результате с 1 м³ ферментационной среды получают примерно 62 кг готового продукта, содержащего 40 г тилозина в 1 кг продукта.

Цель изобретения - повышение съема готового продукта с 1 м³ ферментационной среды.

Поставленная цель была достигнута за счет стимулирования прироста биомассы процента, обеспечиваемого оптимизацией условий развития культуры.

В свою очередь оптимизации условий развития культуры включала:

выращивание культуры-процента на ферментационной среде следующего состава, г/л: меласса свекловичная 23,0-27,0; мука пшеничная 13,0-17,0; глютен кукурузный 8,0-12,0; масло соевое или жир животный 10,0-12,0; дрожжи кормовые 2,0-3,0; углекислый кальций 1,8-2,2; однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,8-1,2; хлористый натрий 0,8-1,2;

выращивание культуры-продуцента в течение первых 10-12 ч при 35-37^oC с последующим ее снижением в течение 4-6 ч до 28-30^oC и поддержанием ее на этом уровне до конца процесса;

выращивание культуры-продуцента в течение первых суток при уровне аэрации 0,5-0,6 л воздуха/л среды в минуту, в последующие 2-5 сут - при уровне аэрации 1,0-1,2 л воздуха/л среды в минуту, а после этого и до конца процесса - при уровне аэрации 0,7-0,9 л воздуха/л среды в минуту.

Экспериментальным путем было показано, что желаемый эффект может быть достигнут лишь при соблюдении всех указанных условий. Несоблюдение хотя бы одного условия не позволяет придти к достижению поставленной цели, что вытекает из табл.1.

Предложенная ферментационная среда имела следующий состав, мас.%: меласса свекловичная 2,5; мука пшеничная 1,5; глютен кукурузный 1,0; масло соевое 1,0; дрожжи кормовые 0,25; углекислый кальций 0,2; однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,1; хлористый натрий 0,1, вода водопроводная до 100,0. Предложенный температурный режим предусматривал выращивание культуры при 36+1^oC в течение первых 12 ч с последующим ее снижением в течение 5 ч до 29+1^oC и поддержанием ее на том же уровне до конца процесса. Предложенный режим аэрации предусматривал выращивание культуры в течение первых суток при уровне аэрации 0,5 л воздуха/л среды в минуту, в последующие 5 сут - при уровне аэрации 1,0 л воздуха/л среды в минуту, а затем до конца процесса - на уровне 0,8 л воздуха/л среды в минуту. Общая длительность ферментации составила 155 ч. В качестве продуцента тилозина был использован штамм Streptomyces fradiae ВНИИгенетика 25-A. Наполнитель вносили в таком количестве, чтобы содержание тилозина в готовом продукте составляло 4%. Активность концентратов (содержание тилозина) колебалась от 82 до 85 г тилозина/кг концентрата (в среднем 83,5 г/кг). Приведенные данные - средние по 5 загрузкам.

Как видно из представленных данных, использование отдельных отличительных приемов предложенного способа не обеспечивает ощутимого повышения съема готового продукта с единицы объема ферментационной среды и лишь одновременная реализация всех отличительных приемов предложенного способа приводит к повышению съема готового продукта на 20%.

Некоторые технико-экономические показатели известного и предложенного способов получения фрадизина приведены в табл.2.

Можно сделать вывод о большей экономической целесообразности использования предложенного способа перед известными способами получения фрадизина.

Более подробно сущность предложенного способа иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. В качестве продуцента тилозина был использован штамм Streptomyces fradiae ВНИИгенетика 25-A, хранившийся в виде лиофильно-высушенной клеточно-споровой суспензии в ампулах. Музейную культуру рассеивают на отдельные колонии на чашках Петри со средой, содержащей, г/л: мука соевая 5,0; кукурузный экстракт 5,0; меласса свекловичная 5,0; крахмал картофельный 5,0; аммоний сернокислый 0,5; натрий хлористый 0,5; магний сернокислый водный 0,7; агар микробиологический 1,0; вода питьевая до 1 л.

Затем культуру выращивают в колбах Эрленмейера вместимостью 750 мл, заполненных 100 мл посевной среды следующего состава, г/л: мука соевая 5,0; дрожжи кормовые 3,0; кукурузный экстракт 3,0; углекислый кальций 3,0; масло соевое 10,0 и вода водопроводная до 1 л. Процесс осуществляют при 29+1^oC на термостатированной качалке (240 об/мин) в течение 48 ч.

Полученный посевной материал в количестве 1,2 л используют для засева 640 л посевной среды того же состава в аппарате вместимостью 1600 л. Продолжительность выращивания при 36+1^oC и уровне аэрации 1 л воздуха/1 л среды в минуту составляет 36 ч.

Приготовленный таким образом материал в количестве 600 л переносят в ферментер вместимостью 20 м³, заполненный 10 м³ ферментационной среды следующего состава, г/л: меласса свекловичная 23,0; мука пшеничная 13,0; глютен кукурузный 8,0; масло соевое 10,0; дрожжи кормовые 2,0; кальций углекислый 1,8; однозамещенный фосфорнокислый аммоний 0,8; хлористый натрий 0,8.

В процессе ферментации осуществляют дополнительное введение в ферментационную среду соевого масла, причем общий расход его составляет 2% от общей среды. Процесс биосинтеза тилозина ведут при постоянно работающей мешалке.

Температурный режим ферментации следующий: первые 10 ч культивирования (стадия накопления биомассы продуцента) - 36+1^oC,постепенное в течение 4 ч снижение температуры до 29+1^oC и поддержание на этом уровне до конца процесса.

Режим аэрации следующий: первые сутки - 0,5 л воздуха/л среды в минуту, 2-5 сут - 1,0 л воздуха/л среды в минуту, далее до конца процесса - 0,7 л воздуха/л среды в минуту.

Через 155 ч культивирования с трехкратным доливом ферментера водопроводной водой получают 10 м³ культуральной жидкости с активностью 5000 ед/мл.

После ее упаривания и сушки на распылительной сушилке получают 350 кг концентрата с содержанием 83 г/кг тилозина.

Для получения стандартизированного товарного фрадизина с содержанием тилозина 40 г/кг готового продукта приготовленный концентрат смешивают с 376,2 кг кукурузной муки как наполнителя. Получают 726,2 кг фрадизина. Следовательно, съем готового продукта с 1 м³ ферментационной среды составляет 72,6 кг.

Пример 2. В качестве продуцента тилозина был использован штамм Streptomyces fradiae ВНИИгенетика 25-В.

Процесс осуществляли как описано в примере 1 за следующим исключением.

Ферментационная среда имела следующий состав, г/л: меласса свекловичная 27,0; мука пшеничная 17,0; глютен кукурузный 12,0; жир животный 12,0; дрожжи кормовые 3,0; кальций углекислый 2,2; однозамещенный фосфорнокислый аммоний 1,2, хлористый натрий 1,2.

Температурный режим ферментации следующий: первые 12 ч культивирования (стадия накопления биомассы продуцента) 36+1^oC, постепенное в течение 6 ч снижение температуры до 29+1^oC и поддержание на этом уровне до конца процесса.

Режим аэрации следующий: первые сутки - 0,6 л воздуха/л среды в минуту, 2-5 сут -1,2 л воздуха/л среды в минуту, далее до конца процесса - 0,9 л воздуха/л среды в минуту.

Через 155 ч культивирования получают 10 м³ культуральной жидкости с активностью 4800 ед/мл.

После упаривания и сушки культуральной жидкости получают 346 кг концентрата, содержащего 82 г тилозина/кг концентрата.

После стандартизации продукта с использование наполнителя получают 709,3 кг фрадизина. Следовательно съем готового продукта с 1 м³ ферментационной среды составляет 70,9 кг.

По данным заявителя совокупность отличительных признаков предложенного способа (состав ферментационной среды, температурный режим, режим аэрации) ранее в технологии фрадизина не использовалась и не была описана в патентной и доступной научно-технической литературе.

Вместе с тем используемая заявителем ферментационная среда уже использовалась для культивирования продуцента тилозина с целью получения антибиотика как такового и была описана в одной из ранее поданных заявителем заявок [2]. Состав этой среды не входил в объем притязаний заявителя и она описана лишь в примере осуществления изобретения. Заявителем же было установлено, что использование этой ферментационной среды (в совокупности с другими отличительными приемами предложенного в настоящей заявке способа) является оптимальным в производстве фрадизина и может рассматриваться как существенный признак способа получения фрадизина.

Существующие способы получения тилозина (начиная с получения тилозина-сырца и заканчивая получением высокочистого кристаллического тилозина) направлены главным образом на совершенствование этапов выделения и очистки антибиотика. Предложенный способ получения фрадизина в отличие от способов получения тилозина имеет целью наиболее полное использование мицелия продуцента в составе кормового препарата, а не его наиболее полное отделение. Таким образом, предложенный способ получения фрадизина и известные способы получения тилозина имеют разную направленность.

Сам по себе принцип оптимизации составов ферментационных сред, температурного режима и режима аэрации общеизвестен. Теоретически известно и то, что изменение состава ферментационной среды или температурного режима культивирования в ряде случаев может потребовать и корректировки режима аэрации.

В данном случае речь идет о совершенствовании процесса получения конкретного продукта и известность подходов к решению этой задачи не исключает патентоспособности созданного технического решения при том, что априорно утверждать о достижении полезного результата при заявленных значениях параметров процесса не представлялось возможным.