производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, рекомбинантная днк, кодирующая производное гирудина, и способ его получения

Формула изобретения

1 1. Производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, обладающее специфической активностью не менее 10000 АТ ед/мг, имеющее выведенную аминокислотную последовательность I, приведенную ниже, полученное культивированием секреторного мутанта Escherichia coli, трансформированного плазмидой, содержащей рекомбинантную ДНК, кодирующую упомянутое производное гирудина. 2 2. Рекомбинантная ДНК, кодирующая производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, и имеющая следующую нуклеотидную последовательность II, приведенную ниже, где Z - кодон для аминокислоты Ала. 2 3. Способ получения производного гирудина, действующего как ингибитор тромбина, предусматривающий конструирование плазмиды, содержащей рекомбинантную ДНК, трансформацию ею штамма Escherichia coli, культивирование трансформированных клеток в среде и выделение продукта, отличающийся тем, что трансформируют секреторный мутант Escherichia coli плазмидой, содержащей рекомбинантную ДНК по п.2.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к получению производного гирудина с N-концевой последовательностью аминокислот Ала-Тре-Тир-Тре-Асп в секреторных мутантах E.coli.

Гирудин - это полипептид из 65 аминокислот, выделяемый из кровяного геля Hirudo medicinalis. Он действует как высокоспецифический ингибитор тромбина путем образования стабильных комплексов с ним и обладает благодаря этому широкими терапевтическими возможностями, в особенности для антикоагуляционной терапии (F. Markguardt, Biomed. Biochim. Acta. 44 (1985), 1007 - 1013).

После опубликования полной последовательности аминокислот гирудина (J. Dodt и др., FEBS LETTERS 165 (2), (1984), 180 - 184) были созданы предпосылки для получения гирудина с помощью техники рекомбинантных ДНК и экспрессии в микроорганизмах.

В EP-A-О 158564 (Transgene) представлены векторы клонирования для экспрессии гирудина или его аналога в клетке-хозяине, в частности в бактериальной клетке. Ген, кодирующий гирудин, получают при этом синтезом ДНК на матрице mРНК кровяного геля Hirudo medicinalis. Описано также производное гирудина с N-концевой последовательностью Иле-Тре-Тир-Тре-Асп и способ его получения.

В EP-A-O 168342 (Ciba Geigy) представлены ДНК-последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность природного гирудина, который имеет N-концевую последовательность аминокислот Вал-Вал-Тир-Тре-Асп. Экспрессию гирудина осуществляют в микроорганизмах E.coli и Saccharomyces cerevisiae внутриклеточно.

В EP-A-O 171024 (Hoechst AG) представлен способ генно-инженерного получения пептидов с активностью гирудина, преимущественно в клетках E.coli, при этом клетки разрушают и из клеточного экстракта получают полипептид с активностью гирудина. Образующийся слитый белок можно разделить путем протеолитического или химического расщепления и очистить освободившиеся молекулы гирудина.

Предметом изобретения WO 86/03517 и DE-OS 3445571 (GEN-BJO-TEC) является последовательность ДНК, которая кодирует белок с биологической активностью гирудина, а также способ получения такого белка из клеток E. coli, которые трансформируют пригодным рекомбинантным вектором, путем лизиса клеток.

В работе Бергмана и др. (Biol. Chem. Hoppe Seyler 367, (1986), 731 - 740) описан синтез гирудина в E. coli. Выделение гирудина из клеток осуществляют путем обработки толуолом, причем достигается лишь незначительный выход около 500 нг/л культуры с плотностью A₅₇₈ единиц.

В EP-A-O 200655 (Transgene), EP-A-O 252854 (Transgene) и EP-A-O 225633 (Ciba Geigy) представлено получение белка с активностью гирудина путем секреции из эукариотического хозяина, в особенностей дрожжей, трансформированных вектором, который содержит ДНК-последовательность сигнального пептида перед структурным геном. Описана секреция производных гирудина с N-концевой последовательностью Вал-Вал-Тир-Тре-Асп, а также с N-концевой последовательностью Иле-Тре-Тир-Тре-Асп в дрожжах. При этом указан выход до 100 мг/л.

В DE-OS 39 00 626 (Hoechst AG) представлено производное гирудина с N-концевой последовательностью Лей-Тре-Тир-Тре-Асп. Экспрессия преимущественно имеет место в дрожжах, причем применяют промотор и сигнальную последовательность гена феромона дрожжей MF для экспрессии и секреции производного гирудина.

Все описанные выше способы получения производных гирудина имеют недостатки. Так, при применении дрожжей в качестве хозяина для продукции и секреции гирудина в культуральной среде получают относительно высокий выход, однако культивирование дрожжевых клеток является более длительным процессом, требующим соблюдения определенных условий, чем в случае с бактериями E. coli. В клетках E. coli, наоборот, имеет место относительно низкий выход и/или при увеличении числа клеток усложняется способ выделения.

Задачей изобретения в связи с эти является разработка простого способа получения производных гирудина, при котором эти производные можно получить с высоким выходом из бактериальных клеток, не прибегая к необходимости использования их избытка.

Предметом изобретения является способ получения производных гирудина с использованием секретирующих мутантов E. coli, по которому 1) конструируют рекомбинантный вектор, в котором ген, кодирующий производные гирудина, следует за ДНК-фрагментом, кодирующим в свою очередь бактериальный сигнальный пептид, 2) трансформируют секретирующие мутанты E. coli рекомбинантным вектором, сконструированным по п. 1), 3) трансформированные клетки культивируют в среде и 4) выделяют из среды производные гирудина.

Под понятием производного гирудина согласно изобретению понимают происходящие от гирудина белки, которые действуют как тромбинингибиторы и обладают специфической активностью, равной по меньшей мере 10000 AT-U/мг, где AT-U антитромбиновые единицы (Dodt и др., Biol. Chem. Hoppe Seyler 366 (1985), 379 - 385).

Способом согласно изобретению получают производные гирудина со следующей последовательностью аминокислот:

(X)_m-Z-Тре-Tир-Тре-Acп,

где

m = 0 - 50;

X - одинаковые или различные генетически кодированные аминокислоты;

Z - генетически кодированная аминокислота из группы Лей, Иле, Ала, Вал, Гли, Сер, Асп, Глу, Асн, Глн, Гис, Мет, Фен и Тир.

Поскольку m>0, то последовательность X содержит протеолитически или химически расщепляемое место, предпочтительно у своего конца. Если, например, последняя аминокислота X - является Арг- остатком, то можно слитую последовательность X отщепить путем триптического переваривания (расщепление после Арг) и очистить активное производное гирудина. Отщепление слитой части, однако, можно проводить с использованием и других известных протеолитических ферментов или химических расщепляющих реагентов. Если, например, аминокислотная последовательность X оканчивается Мет- остатком, то можно слитый белок расщепить с помощью галогенциана (E. Gross и B. Wittkop, J. Am. Chem. Soc., 82 (1961), 1510 - 1517). Если, например, C - конец последовательности аминокислот X включает аминокислотную последовательность Иле-Глу-Глу-Арг, то расщепление можно проводить фактором Xa (EP-A 0025190 и EP-A 0161973).

Если в способе согласно изобретению m = 0, то Z - преимущественно ГЛН, Гис, Фен, Тир, Гли, Сер, Асп или Асн, в особенности Ала, Гли, Сер, Асп или Асн. Наиболее предпочтительно производное гирудина, если m = 0, а Z - Ала.

Таким образом, предметом изобретения являются также производные гирудина с N-концевой последовательностью А-Тре-Тир-Тре-Асп, где А-Ала-Глн, Гис, Фен, Тир, Гли, Сер, Асп или Асн, предпочтительно Ала, Гли, Сер, и Асп или Асн. Наибольшее предпочтение отдают производному с N-концевой последовательностью Ала-Тре-Тир-Тре-Асп. Это производное гирудина можно получить в культуре секреторного мутанта E. coli с выходом активной формы до 2 г/л среды.

Преимущество способа согласно изобретению также состоит в том, что благодаря секреции производного гирудина в среду дисульфидные мостики гирудина легко образуются при создании окислительных условий вне клетки.

Под определением "секреторные мутанты E. coli", согласно изобретению принимают штаммы E. coli, которые дают массовую секрецию белков в культуральную среду. Способ получения этих мутантов представлен в EP-A-O 338410. При получении пригодных мутантов E. coli можно исходить из E. coli DS 410/DSM 4513/ или E/coli BW 7261/DSM 5231/. Штамм E. coli трансформируют сначала плазмидой, которая включает ДНК-последовательность, кодирующую выделяемый белок. Затем трансформированный штамм E. coli подвергают мутагенезу, например, путем обработки N-метил-N"-нитро-N- нитрозогуанидином и проводят селекцию пригодных штаммов-мутантов. Если выбирают в качестве выделяемого белка, например, -циклодекстрингликозилтрансферазу, то можно обнаружить мутанты по резистентности в D-циклосерину, веществу, проявляющему активность относительно стенок клетки. Далее секреция -циклодекстрингликозилтрансферазы (CGTase) способствует гидролизу крахмала в окружающей среде, что при использовании амилопектин-азур-среды приводит к дополнительной возможности селекции мутантов.

В качестве рекомбинантного вектора для данного изобретения пригодны векторы, которые могут либо интегрировать в геном E. coli (например, бактериофаги ), либо существовать в трансформированной клетке E. coli вне хромосомы (например, плазмиды). Преимущественно применяют плазмиды.

В рекомбинантный вектор встраивают ген, который кодирует белок, состоящий из сигнального пептида и производного гирудина, и находится преимущественно под контролем индуцируемого промотора, особенно trp-lac - промотора, который может быть индуцирован добавкой лактозы или ИРТГ (изопропил- -D-тиогалактозид). Далее в векторе должен быть ген-маркер для селекции, в данном случае ген lac-репрессора.

В качестве бактериальной сигнальной последовательности, способствующей секреции производного гирудина, в принципе пригодны все известные сигнальные пептиды, отвечающие за прохождение через мембрану клеток E. coli. В основном применяют также сигнальные пептиды из грамм-отрицательных бактерий, например сигнальные пептиды следующих белков E. coli: наружный мембранный белок OmpA (DiRienzo и др., 1978 Ann. Rev. Biochem. 47: 481 - 532), щелочная фосфатаза PhoA (Inouye и др. , 1982 J. Bacteriol 149: 434 - 439), LamB - белок (Hedgpeth и др., 1980 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77: 2621 - 2625), мальтоза - связующий белок MalE (Bedouelle и др., 1980 Nature 285: 78 - 81). Преимущественно применяют сигнальный -CGTase-пептид.

Вектором, пригодным для способа согласно изобретению, являются, например, плазмида pCM705 (фиг. 1), которую получают из плазмиды pCM703, описанный в EP-A-O 383410, путем выделения Nru I - фрагмента длиной около 1 kb. Этот вектор содержит ген резистентности к ампициллину, ген lac - репрессора и CGTase - ген с участком для кодирования сигнального пептида на 5¹-конце. Последовательность, кодирующую производные гирудина, интегрируют в вектор pCM705 с тем, чтобы внутри клетки образовались промежуточные молекулы с сигнальным пептидом -CGTase на его N-конце. Сконструированный ген находится под контролем tac-промотора. Полученной таким образом плазмидой можно трансформировать мутантный штамм E. coli.

Положительно трансформированные клоны культивируют во встряхивающихся колбах или ферментерах. При достижении оптимальной плотности (OD₆₀₀) около 1 проводят индукцию с помощью ИРТГ или лактозы.

С помощью теста тромбин-инактивация (Griesbach и др., Thrombosis Research 37, (1985), 347 - 350) определяют процесс образования производного пирудина. Накопление слитых белков анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (обратимая фаза). Вспомогательную часть слитых белков потом можно отщепить и очистить образовавшееся активное производное гирудина.

На фиг. 1 показана плазмида pCM705; на фиг. 2 - ДНК-последовательность синтетического гена гирудина из pK152; на фиг. 3 - последовательности олигонуклеотидов HJP1, HJP2 и HJP3: на фиг. 4 - плазмида pCM7051; на фиг. 5 - плазмида pCM7053.

Пример 1. Конструирование вектора секреции.

Плазмида pK152 несет синтетический ген гирудина, последовательность которого представлена в EP-A 0171024. Из этой плазмиды выделяют большой ДНК-фрагмент Hinf I - Hind III размером около 200 bp путем гель-электрофореза в агарозе, содержащий большую часть ДНК-последовательности, кодирующей гирудин (фиг. 2). Отсутствующая 5¹-концевая последовательность регенерируется вновь синтезированным олигонуклеотидом (HJP1). Последовательность олигонуклеотида представлена на фиг. 3. Благодаря слиянию Hinf1- концов получают производное гирудина с N-концевой последовательностью Ала-Тре-Тир-Тре-Асп.

Плазмиду pCM705 (фиг. 1) расщепляют с помощью Pst1 и Hind III. Оба места разрыва находятся в кодирующей области гена CGTase, благодаря чему выделяется ДНК-отрезок размером 1 kb. Pst I расщепляет точно в области, которая кодирует место разрыва для сигнальной пептидазы.

PstI-Hind III фрагмент pCM705, 6,3 kb, Hind I-Hind III фрагмент pK152 0,2 kb и олигонуклеотид HJP1 лигируют друг с другом, благодаря чему образуется плазмида pCM7051 (фиг. 4). Штамм HB101 (DSM 1607) E. coli трансформируют лигирующей смесью. Колонии, которые на селективной среде с аминопектином и азуром (окрашенный амилопектин) не показывают снижения крахмала и, тем самым, -CGTase-экспрессии выделяют и очищают до однородности. ДНК-плазмиду выделяют из нескольких очищенных клонов и идентифицируют с помощью рестрикционного анализа.

ДНК-плазмиду, которая имеет корректную генную структуру для гирудина, расщепляют с помощью Nru I и Nde I и выделяют фрагмент размером 5,18 kb путем гель-электрофореза в агарозе.

После достраивания Nde I- сайта ферментом Кленова фрагмент циклизуют. Образованная плазмида обозначена как pCM7053 (фиг. 5).

Мутанты E. coli W CM100, которые получают описанным в EP-A-О 338410 методом, трансформируют полученной плазмидой pCM7053.

Пример 2. Тест на секрецию гирудина во встряхиваемых колбах.

В 10 мл B -среды с 100 мкм/мл ампиллина и оптической плотностью OD₄₂₀ = 0,1 засеивают свежую суточную культуру WCM100/pCM7053. Культуру взбалтывают при 30^oC. По достижении оптической плотности OD₄₂₀ = 1,0 добавляют индуктор лактозу в конечной концентрации 1%. После 48 ч берут пробу культуры, центрифугированием отделяют клетки и в фильтрате определяют концентрацию гирудина. Определение проводят с помощью теста тромбин-инактивации. Выход составляет до 4000 AT-U/мл или 250 мг/л.

Пример 3. Получение гирудина в 10-литровом ферментере

Минимально в 7 л среды с 100 мкм/мл ампиллина с оптической плотностью OD₆₀₀ = 0,1 засевают свежую суточную культуру WCM100/pCM7053.

Условия ферментации: температура 30^oC; скорость перемешивания 450 - 500 rpm; разрежение 0,5 - 1,5 Vvm; pH 7,00,1.

По достижении оптической плотности OD₆₀₀ = 1,0 добавляют 0,5 ммоль ИПТГ / изопропил- -D-тиогалактозид/.

Через 40 ч после добавки ИПТГ в фильтрате определяли 36000 AT-U/мл, или 2,25 г/л.

Пример 4. Секреция гирудина с N-концевой последовательностью Ала-Тре-Арг-Лей-Тре-Тир-Тре-Асп.

Опыт проводят аналогично примеру 1, но вместо олигонуклеотида HJP1 применяют олигонуклеотид HJP2 (фиг. 3). Получают слитый белок гирудин с N - концевой последовательностью Ала-Тре-Арг-Лей-Тре-Тир-Тре-Асп. Количество слитого белка в фильтрате определяют с помощью ЖХ-хроматографии высокого давления при использовании "обратимой фазы" (C₁₈ -хроматографическая колонна). Ферментация штамма WCM100 с данной генной конструкцией дает выход слитого белка 25 мг/л. Благодаря расщеплению трипсином можно получить активный гирудин с N-концевой последовательностью Лей-Тре-Тир-Тре-Асп.

Пример 5. Секреция гирудина мутантом WCM88.

Мутант WCM88, полученный описанным в EP-A-О 338410 способом, трансформируют плазмидой pCM7053 (пример 1). Получение гирудина благодаря секреции в среду тестируют с использованием способа со встряхиваемыми колбами и ферментацией.

а) Опыт во встряхиваемых колбах.

Штамм WCM88/pCM7053 культивируют аналогично примеру 1. Через 48 ч определяют в фильтрате культуры концентрацию гирудина. Выход 1800 AT-U/мл или 110 мг/л.

б) Получение в 10-литровом ферментере.

Свежий штамм обрабатывают, как описано в примере 3. Через 45 ч после добавки ИПТГ в фильтрате установлено 21000 AT-U/мл, или 1,3 г/л.

Пример 6. Конструирование вектора секреции, резистентного к тетрациклину.

Выделяют 1,1 kb NruI-фермент плазмиды pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2, 95-113 (1977)) и лигируют его с линеаризированной путем Nru I- расщепления плазмидой pCM7051 (фиг. 4). Лигирующей смесью трансформируют E. coli HB101. Трансформанты отбирают по их резистентности к тетрациклину.

ДНК-плазмиду выделенного клона повторно изолируют и расщепляют с Nde I и Ava I. Фрагменты ДНК разделяют электрофорезом в агарозном геле. Больший фрагмент выделяют и достраивают однонитевые участки с помощью энзима Кленова, а затем лигируют.

Получают плазмиду pCMT203.

Пример 7. Секреция гирудина с применением вектора секреции pCMT 203.

Секреторный мутант WCM 100 (пример 1) трансформируют плазмидой pCMT203. Полученный штамм культивируют в 1-литровом ферментере. Через 45 ч после добавки ИПТГ определяли 42000 AT-U/мл гирудина ( 2,63 г/л).