соединения на основе реакции амадори, их применение, способ получения и составы на их основе

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция для лечения и/или профилактики гематологических и/или иммунологических заболеваний и/или для стимуляции иммуной системы человека и/или млекопитающих, включающая по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или смазку и по крайней мере одно соединение на основе перегруппировки Амадори, отличающаяся тем, что она содержит эффективное количество, предпочтительно 0,01 - 10,0 мг/кг веса тела, по крайней мере одного соединения на основе перегруппировки Амадори, предпочтительно смесь соединений на основе перегруппировки Амадори формулы I

R₁ - NH - R₂,

где R₁ - остаток 1-деокси-2-кетозы, являющейся производным сахара, предпочтительно в своей D-форме, выбранного из группы, состоящей из глюкозы, ксилозы, галактозы, рамнозы, фруктозы, маннозы, 2-деокси-глюкозы, 6-деокси-глюкозы, глюкозамина, галактозамина, или из олиго- или полисахаридов предпочтительно низкого молекулярного веса в 5000 дальтон или менее;

R₂ - остаток аминокислоты предпочтительно в своей L-форме, выбранной из группы, состоящей из серина, глицина, пролина, гистидина, аргинина, аланина, аспаргиновой кислоты, глутаминовой кислоты, фенилаланина, треонина, цистеина, цистина, глутамина, валина, аспарагина, метионина, тирозина, гидроксипролина, лизина, триптофана, изолейцина и лейцина.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что она индуцирует образование цитокина.

3. Косметическая композиция для применения в качестве клеточного питания, для регенерации тканей и/или для иммуномодулирования, включающая по крайней мере один косметически приемлемый носитель, адъювант и/или смазку и по крайней мере одно соединение на основе перегруппировки Амадори, предпочтительно смесь соединений на основе перегруппировки Амадори формулы I

R₁ - NH - R₂,

где R₁ - остаток 1-деокси-2-кетозы;

R₂ - остаток аминокислоты,

отличающаяся тем, что она включает эффективное количество предпочтительно 0,01 - 10,0 вес.% по крайней мере одного соединения на основе перегруппировки Амадори формулы I, где R₁ - остаток 1-деокси-2-кетозы, являющийся производным сахара, предпочтительно в его D-форме, выбранного из группы, состоящей из глюкозы, ксилозы, галактозы, рамнозы, фруктозы, маннозы, 2-деокси-глюкозы, 6-деокси-глюкозы, глюкозамина, галактозамина, или из олиго- или полисахаридов предпочтительно низкого молекулярного веса, 5000 дальтон или менее, R₂ - остаток аминокислоты предпочтительно в ее L-форме, выбранной из группы, состоящей из серина, глицина, пролина, гистидина, аргинина, аланина, аспаргиновой кислоты, глутаминовой кислоты, фенилаланина, треонина, цистеина, цистина, глутамина, валина, аспарагина, метионина, тирозина, гидроксипролина, лизина, триптофана, изолейцина и лейцина.

4. Композиция по п.3, отличающаяся тем, что индуцирует образование цитокина, полезное для антивирусного действия.

5. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что она включает по крайней мере одно соединение на основе перегруппировки Амадори и по крайней мере один фармацевтически приемлемый носитель, адъювант и/или смазку в весовом соотношении 1 : 1 - 1 : 100, предпочтительно 1 : 8 - 1 : 20 и более предпочтительно в примерном соотношении 1 : 9.

6. Композиция по любому из пп. 1 - 5, где смазка присутствует в смеси с лактозой, причем весовое соотношение лактозы и смазки составляет 20 : 1 - 100 : 1, предпочтительно около 50 : 1.

7. Композиция по п.3 или 4, где по крайней мере одно соединение на основе перегруппировки Амадори присутствует в количестве 0,01 - 1 вес.%, предпочтительно 0,05 - 0,10 вес.%.

8. Способ получения смеси иммунотропных соединений на основе перегруппировки Амадори формулы R₁ - NH - R₂, где R₁ - остаток 1-деокси-2-кетозы, являющийся производным сахара или низкомолекулярного олиго- или полисахарида, и R₂ является аминокислотным остатком, отличающийся тем, что: а) концентрированную водную смесь соединений сахара и аминокислоты, которая включает по крайней мере две различные аминокислоты или по крайней мере два различных сахара и/или олиго- или полисахаридов с низким молекулярным весом 5000 дальтон или менее, где аминокислоты предпочтительно находятся в своей L-форме и выбраны из группы, состоящей из серина, глицина, пролина, гистидина, аргинина, аланина, аспаргиновой кислоты, глутаминовой кислоты, фенилаланина, треонина, цистеина, цистина, глутамина, валина, аспарагина, метионина, тирозина, гидроксипролина, лизина, триптофана, изолейцина и лейцина, и сахара предпочтительно находятся в своей D-форме и выбраны из группы, состоящей из глюкозы, ксилозы, галактозы, рамнозы, фруктозы, маннозы, 2-деокси-глюкозы, 6-деокси-глюкозы, необязательно вместе с неорганическими микроэлементами, присутствующими в природных торфяных экстрактах, нагревают с протеканием химических реакций, необязательно под давлением и в присутствии воды в качестве растворителя, причем содержание твердых составляет 0,67 - 2,75 pbw на 1 pbw водного растворителя, а молярное соотношение сахаров и/или сахаридов и аминокислот составляет 2 : 1 - 1 : 1, более предпочтительно 1,5 : 1; b) продолжают нагревание с введением конечных продуктов реакции в перегруппировку Амадори, в том время как водный растворитель одновременно или впоследствие удаляют до тех пор, пока цвет реакционной смеси не превратится в оранжево-коричневый и биологическая активность и ферроцианид-восстанавливающая способность не будет обнаружена в образцах, отобранных из реакционной смеси, после чего c) останавливают перегруппировку Амадори, предпочтительно перед разложением, приводящим к соединениям, потерявшим свою биологическую активность, и d) высушивают реакционную смесь и/или дополнительно подвергают ее очистке посредством колоночной хроматографии, собирая биологически активные фракции, вызывающие восстановление ферроцианида калия.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что смесь на стадии (а) реагирует при температурах примерно 70 - 121^oC предпочтительно в течение примерно 30 - 120 мин.

10. Способ по п.8 или 9, отличающийся тем, что сахара и/или низкомолекулярные сахариды, с одной стороны, и/или аминокислоты, с другой стороны, и необязательно неорганические микроэлементы присутствуют в основном в том же составе и/или, по существу, в том же весовом соотношении, которое имеет место в природном торфяном экстракте.

11. Способ по любому из пп.8 - 10, отличающийся тем, что по крайней мере одна аминокислота имеет две карбонильные группы и реакцию осуществляют в присутствии буферной соли, предпочтительно бикарбоната натрия, при молярном соотношении с аминокислотой 1 : 1.

12. Композиция по любому из пп.1 - 7, где по крайней мере одно соединение на основе перегруппировки Амадори или смесь соединений на основе перегруппировки Амадори представляет собой часть реакционной смеси, полученной способом по любому из пп.8 - 11.

13. Композиция по п.12, отличающаяся тем, что включает остатки 1-деокси-2-кетозы и/или остатки аминокислот и необязательно неорганические микроэлементы, по существу, в том же составе и/или, по существу, в том же весовом соотношении, которое имеет место для природного торфяного экстракта.

14. Композиция по п.12 или 13 для орального, и/или поверхностного, и/или внутривенного применения.

Приоритет по пунктам:

13.02.92 по пп.1 - 10, 12 - 14;

03.03.92 по п.11.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к соединениям на основе реакции Амадори, получаемым на их основе составам, к способу получения продукции из них, а также к новому способу применения этих составов и их продуктов, которые по крайней мере частично прошли перегруппировку Амадори согласно следующей схеме реакции и/или по реакции Майяра:



Известны продукты реакции Амадори, такие, как например, продукты реакции аминокислоты или гликопептида с олиго- или полисахаридом, прошедшие перегруппировку Амадори (J.Biol.Soc.215 (1955) Henri Boreook et al.).Так, например, в патенте ФРГ DE-C- 3914354 описан водорастворимый гликопротеин аминокислоты и сахар, который выделен из экстракта семян Avena sativa. Далее в патенте ЕР-А-406087 описаны водорастворимые комплексные соединения сахаридов с гликопептидами, полученные из клеточных стенок грамположительных бактерий, а в журнале J.Biol.Chem.1965, 260/9 описано использование нанометровой спектроскопии для характеристики продуктов реакции Амадори, образующихся при реакции глюкозы со свободными аминогруппами протеина.

Настоящее изобретение относится к специфическому новому соединению на основе перегруппировки Амадори в соответствии с пунктом 1 формулы и преимуществами, изложенными в пунктах формулы 2-4.

Эти соединения восстанавливают феррицианид калия, причем контрольная тест-реакция для биологически активных веществ производится при реакции сахара и аминокислоты.

Изобретение также относится к новому применению таких соединений и в то же время к новому способу применения продуктов реакции Амадори, в частности сахаров и аминокислот, описанных в п.11-17 формулы изобретения. Ранее никем не проводилось тестирования на биологическую активность различных стадий очищения экстракта продукта реакции Амадори (для удаления балластных веществ и загрязнений).

Известны иммуностимулирующие лекарственные препараты, получаемые из натуральных продуктов, например экстракты из омелы белой, из торфа и т.п., основной недостаток использования которых заключается в необходимости дорогостоящей обработки большого количества сырья для получения нескольких граммов активного вещества. К тому же неподдающиеся контролю загрязнения могут оказывать токсичное действие и вызывать побочные эффекты и вследствие этого при практическом применении зачастую нелегко применить препарат из-за его сложных свойств и трудновоспроизводимого состава.

Производство подобных сопоставимых продуктов или их смеси, получаемых из искусственных веществ, например интерферона, а также другими методами генной инженерии, являются еще более дорогостоящим.

Кроме того, молекулы интерферона человека зачастую слишком велики, чтобы проникнуть через стенку человеческой клетки, поэтому эффективное действие оказывает только часть назначаемой дозы. К тому же, продукты генной инженерии обычно оказывают побочные действия, а некоторые даже являются токсичными. Более того, по причинам, неизвестным до настоящего времени, некоторые из них в один день оказывают эффективное действие и нейтральное - на следующий день.

Неожиданно было обнаружено, что почти любой простой комплекс аминокислота/сахар после по крайней мере частичной перегруппировки Амадори не обнаруживает ни одного из вышеупомянутых недостатков, а напротив приобретает удивительно высокую иммунологическую активность.

Вследствие этого их можно использовать в фармацевтических составах и в косметике. Эти малые молекулы легко проникают через стенку клетки и фактически действуют как питательное вещество. Они индуцируют образование естественного интерферона и других цитокинов, включая фактор некроза опухоли. Даже через три дня после назначения препарата они все еще обнаруживают этот эффект стимуляции биологической активности. Этот эффект возрастает по мере завершения перегруппировки и затем снижается в ходе декомпозиции комплекса.

Вместо простых сахаров, предпочтительно с низким молекулярным весом, в частности, менее 1000 дальтон, также можно использовать полисахариды аналогичной реакции, например декстран. Полисахариды обладают биологической активностью и могут сохранять некоторые виды такой активности даже после того, как они превращаются в олигосахариды.

До настоящего времени было очень мало известно о биологической активности этих составов. Было обнаружено, что комбинации этих веществ при взаимодействии с лейкоцитами человека вырабатывают интерферон и другие цитокины. Это явление называется поликлональной активацией клеток.

Можно протестировать вещества, вырабатываемые под действием этих составов, и определить в международных единицах измерения их биологическую активность по отношению к определенным цитокинам.

Эти составы обладают особенно высокой биологической активностью в пределах концентраций чистого вещества от 1 до 100 мг/мл. На уровне молекулы специфические свойства аминокислоты имеют более важное значение, чем свойства сахарной части молекулы.

Продукты реакции L-аспарагиновой кислоты с глюкозой или галактозой, прошедшие перегруппировку Амадори, при взаимодействии с лейкоцитами человека и инкубированные в среде тканевой культуры при 37^oC в течение 20 часов в 5% CO₂, вырабатывают от 30 до 1000 антивирусных единиц интерферона.

Интерферон анализировали посредством биопроб с раковыми клетками человека. Под действием этих составов могут вырабатываться также составы некроза опухоли.

Продукты, дающие возможность такого неожиданного применения, имеют общую формулу:

R"₁-NH-R₂

где R"₁ - 1-амино-1-деокси-2-кентоз-радикал, производный группы простых сахаров, олиго- и полисахаридов предпочтительно низкомолекулярного веса, в частности менее 1000 дальтон.

R"₂ - аминокислота или радикалы пептида, предпочтительно низкомолекулярные, в частности ниже 1000 дальтон.

Таким образом, группа биологически активных соединений может включать как описанные выше специфические соединения перегруппировки Амадори, так и N-замещенные производные ряда различных составов аминокислот и один простой сахар, олиго- или полисахарид, предпочтительно низкомолекулярного веса, в частности меньше 1000 дальтон, или N-замещенные производные одного состава аминокислоты и ряд простых сахаров, олиго- и/или полисахариды, либо другую комбинацию таких производных, причем каждый из них обладает достаточной биологической активностью.

Предпочтительно, чтобы R"₁ в вышеприведенной формуле был радикалом, выбранным из простых сахаров D-формы, в частности (но не обязательно) из глюкозы D-формы, ксилозы, галактозы, рамнозы, фруктозы, маннозы, G-деоксиглюкозы, глюкозамина и галактозамина, R"₂ - был радикалом, выбранным из составов аминокислот L-формы, таких, как серин, глицин, гистидин, аргинин, глутамин, аспарагин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, фенилаланин, треонин, цистеин, цистин, метионин, гидроксипролин, триптофан, пролин, валин, изолейцин, лейцин и лизин либо другие пептиды этих аминокислот в любой комбинации.

Изобретение также относится к способу получения упомянутых составов и продуктов, описанных в п.5 формулы изобретения, посредством которого получают промежуточный продукт формулы

R"-NH-R""

где R" - G-деокси-радикал в прямой карбоновой цепочке, или любой из простых сахаров O-мостообразной формы, либо олиго- или полисахариды, и

R""-аминокислота или радикал пептида, причем данный промежуточный продукт по крайней мере частично подвергается перегруппировке Амадори и/или реакции Майяра посредством длительного нагревания реакторной смеси, предпочтительно под давлением, и одновременного или последовательного удаления растворителей.

Предпочтительный вариант осуществления процесса по настоящему изобретению описан в пунктах 6-10 формулы.

В некоторых случаях, особенно при использовании аминокислоты, имеющей две карбоксильные группы, желательно применение буферной соли, например, бикарбоната натрия, предпочтительно в молярном соотношении 1:1.

Также было обнаружено, что продукты перегруппировки Амадори достаточно чувствительны к разложению и что продукты разложения имеют смолообразную консистенцию и темно-коричневый цвет, причем не поддающиеся определению составы теряют биологическую активность. Вследствие этого предпочтительно остановить реакцию перегруппировки Амадори на стадии, когда реакционная смесь приобретает слабый оранжево-коричневый оттенок.

Следует отметить, что промежуточные продукты реакции, образующиеся, когда первоначально непрозрачный раствор аминокислоты становится чистым (до перегруппировки Амадори), легко гидролизуются, т.е. реакция является обратимой.

По мере перегруппировки обратимость уменьшается, т.к. продукты становятся более стабильными, а цвет постепенно изменяется от светло-желтого до светло-оранжевого и наконец - до оранжево- коричневого по окончании перегруппировки Амадори. Взятые во время реакции перегруппировки Амадори образцы подвергали тестированию (согласно различным описанным ниже процедурам), при этом были получены доказательства возрастания биологической активности по мере прохождения реакции Амадори и ее уменьшения, если дальнейшее нагревание приводит к разложению, показателем которого является изменение цвета до темно-коричневого.

Мгновенная редукция феррицианида и происходящее в результате изменение цвета происходит в случае, если реакционная смесь содержит другие кето-группы и/или серосодержащие аминокислоты, например цистеин; в других случаях это протекает в течение от 3 до 5 мин, что позволяет легко контролировать степень прохождения перегруппировки Амадори. Не вступающие в реакцию сахара выявляют изменения цвета только спустя полчаса или даже несколько часов.

Выделение чистых продуктов перегруппировки Амадори производится согласно известным способам, основанным на связывании смеси сильными катионообменниками, такими как Amberlite^(R) или Dowex^(R), последующей элюацией с аммонийной водой, выпаривании под давлением определенных выбранных фракций элюата и кристаллизации чистого состава из ангидроз метанола (J.E.Hodge and B.E. Fisher, Mtthods in Carbohydrate Chemistry, Vol.II, Reactions of Carbohydrates, Academic Press, N.Y., London, 1963, page 105-106; or Borsook at al. as quoted earller; or J.Dubourg and P.Devilliers).

В способе по настоящему изобретению сохраняются без изменения все вышеупомянутые преимущества, касающиеся радикалов, полученных из простого сахара и аминокислотных составов. Вдобавок смесь субстратов сахаров предпочтительно содержит D-формы глюкозы, ксилозы, галактозы, рамнозы и фруктозы в весовом соотношении приблизительно 20:10:4:1:1, а смесь субстратов аминокислот предпочтительно включает L-формы серина, глицина, гистидина, аргинина, пролина, тирозина, валина, лейцина, изолейцина и лизина в весовом соотношении 20.5:35.6:35.8:132:180:360:216:160:72:68:780.

Как уже упоминалось, продукты перегруппировки Амадори способны редуцировать феррицианид калия, причем такая контрольная химическая реакция дает возможность быстро определять биологическую активность составов, получаемых при реакции сахара и аминокислоты.

Было обнаружено, что продукты реакции особенно активны, когда смесь простых сахаров такой же композиции и весового соотношения, как и в натуральных экстрактах торфа, вступает в реакцию со смесью составов аминокислот такой же композиции и такого же весового соотношения, как в натуральных экстрактах торфа в присутствии водного растворителя, предпочтительно при добавлении низшего спирта, а также произвольных неорганических микроэлементов, присутствующих в натуральных экстрактах торфа. Реакция протекает под произвольным давлением при повышенной температуре. Далее нагревание продолжают для завершения перегруппировки Амадори у полученных продуктов, затем одновременно или последовательно удаляют растворители и прекращают реакцию перегруппировки на стадии, когда реакционная смесь приобретает слабый оранжево- коричневый цвет, после чего полученные продукты высушивают и очищают при помощи колоночной хроматографии, затем собирают фракции, тем самым обеспечивая максимальную редукцию феррицианида калия.

Согласно одному из вариантов осуществления изобретения быстродействующие фармацевтические составы содержат в качестве активного ингредиента по меньшей мере один продукт реакции формулы R"₁-NH-R"₂ или специфический состав формулы R₁-NH-R₂ с фармацевтически допустимым носителем и/или произвольное смазочное средство в весовом отношении активного ингредиента к остальным компонентам в диапазоне от 1:1 и 1:100, предпочтительно от 1:8 до 1:20, а наиболее предпочтительно около 1:9.

Другой обладающий преимуществами изобретения фармацевтический состав содержит в дополнение к активному ингредиенту также лактозу и смазочное средство, причем весовое соотношение лактозы к смазочному средству составляет диапазон от 20:1 и 100:1, предпочтительно 50:1.

Эти фармацевтические препараты применяют для лечения и/или предупреждения гематологических и/или иммунологических заболеваний, а также стимуляции иммуносистемы человека и/или животных посредством введения формации цитокина.

Другой областью применения активных ингредиентов являются косметические препараты. В таких препаратах активный ингредиент содержится в количестве 0,01-10% по весу, предпочтительно 0,01-1% по весу, и в частности 0,05-0,1%. Эти косметические составы содержат, помимо активного ингредиента, обычные носители, адъюванты, обогатительные компоненты и/или ароматические средства.

Далее настоящее изобретение подробно изложено и иллюстрировано следующими примерами, которые ни в коей мере не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. В горячую водяную баню помещали колбу вращательного испарителя объемом 25 мл, наполненную смесью следующего состава: 1,47 г (0,01 М) - L-глутаминовая кислота; 0,84 г (0,01 М) - NaHCO₃; 0,91 г - D-глюкоза; 0,91 г - галактоза и 3,00 мл - дважды дистиллированная вода.

Смесь нагревали до 80^oC при пониженном давлении до степени выпаривания 50%, затем при атмосферном давлении продолжали нагревание до температуры 80-85^oC, при которой смесь выдерживали в течение 120 мин, пока она не приобретала оранжевый цвет. Затем сиропообразный концентрированный водный раствор высушивали при пониженном давлении. Полученный твердый продукт реакции оранжево-красного цвета помечали как D-10 и сохраняли для биологических тестов.

Пример 2. В горячую водяную баню помещали колбу вращательного испарителя объемом 25 мл, наполненную смесью следующего состава: 1,33 г (0,01 М) - L-аспарагиновая кислота; 0,84 г (0,01 М) - NaHCO₃; 0,91 г - D-глюкоза; 0,91 г - галактоза; 3,00 - дважды дистиллированная вода.

Смесь нагревали до 80^oC при вращательном перемешивании, затем выпаривали под давлением до испарения 1,5 мл воды, далее обрабатывали при атмосферном давлении при температуре 80-85^oC до получения смеси слабого оранжевого цвета в течение 60 мин. Сиропообразный концентрированный водный раствор высушивали при пониженном давлении. Полученный в результате продукт реакции представлял собой сухой желто-оранжевый порошок. Его пометили как D-11 и сохранили для биологических тестов.

Пример 3. В горячую водяную баню помещали колбу вращательного испарителя объемом 25 мл, наполненную смесью следующего состава: 1,5 г (0,01 М) - L-серин; 0,91 г - D-глюкоза; 0,91 г - галактоза; 2,50 мл - дважды дистиллированная вода.

Смесь нагревали до 85-92^oC при вращательном перемешивании. Спустя 100 мин раствор приобретал оранжевый цвет. Давление уменьшали и смесь выпаривали до сухого состояния. На стенках сосуда появлялся прозрачный оранжевый слой продукта реакции, который соскребали и измельчали до состояния порошка, помечали как D-12 и сохраняли для биологических тестов.

Пример 4. В горячую водяную баню помещали колбу вращательного испарителя объемом 25 мл, наполненную смесью следующего состава: 0,66 г (0,005 М) - D-аспарагиновая кислота; 0,42 г (0,0005 М) - NaHCO₃; 0.45 г - D-глюкоза; 0,45 г - галактоза; 3,00 мл - дважды дистиллированная вода,

Смесь нагревали до 80^oC, выпаривали под давлением объем воды 1,5 мл, затем обрабатывали при атмосферном давлении при температуре 85^oC. После нагревания в течение 60 мин смесь приобретала оранжевый цвет, давление уменьшали, а полученный в результате сиропообразный водный раствор выпаривали до сухого состояния. Чтобы полностью устранить влагу, перед окончательным высушиванием осадка в колбу дважды выводили по 10 мл безводного этанола и испаряли его. Полученный в результате сухой продукт измельчали до порошка, помечали как D-13 и сохраняли для биологических тестов.

Пример 5. Для получения синтетического эквивалента биологически активной фракции определенного натурального экстракта торфа в нагреваемую водяную баню помещали колбу ротационного испарителя, наполненную составом: 20,5 мг - L-серин; 35,8 мг - L-глицин; 35,8 мг - L-гистидин; 132,0 мг - L-аргинин; 180,0 мг - L-аланин; 360,0 мг - L-пролин; 216,0 мг - L-тирозин; 160,0 мг - L-валин; 68,0 мг - L-изолейцин; 72,0 мг - L-лейцин; 780,0 мг - L-лизин; 2000,0 мг - D-глюкоза; 1000,0 мг - D-ксилоза; 400,0 мг - D-галактоза; 100,0 мг - D-рамноза; 100,0 мг - D-фруктоза; 6,0 мл - дважды дистиллированная вода.

Смесь перемешивали вращением и нагревали под давлением в течение 45 мин при возрастании температуры от 75^oC до 86^oC. За этот период полностью выпаривали около 3 мл воды, а вещества полностью растворялись. Затем смесь обрабатывали в течение 30 мин при атмосферном давлении и температуре 85-86^oC для проведения перегруппировки Амадори. За этот период времени раствор быстро приобретал красно-коричневый цвет. Давление уменьшали, а нагревание до 84^oC продолжали, таким образом одновременно выпаривая растворители. В конце выпаривания вводили дважды по 15 мл безводного этанола, после чего реакционную смесь полностью высушивали. Колбу с высушенным продуктом реакции выдерживали в эксикаторе над хлоридом кальция в течение 18 часов. Затем измельчали до состояния порошка, в результате получали около 4,5 г порошка, который обозначили как EK₂-S.

Часть продукта реакции - 4 г - растворяли в 20 мл дистиллированной воды и помещали в колонку для хроматографии размером 25 мм х 330 мм, наполненную аналитически градуированным сорбентом Amberlite^(R) XAD-2. Колонку элюировали 0,4 мл/мин дистиллированной воды. Фракции объемом 10 мл были собраны общим объемом 450 мл. Содержимое фракции было подвергнуто хроматографическому мониторингу. Фракции последовательных номеров 11-13 были соединены и выпарены при пониженном давлении. Эти фракции характеризуются высоким содержанием продуктов перегруппировки Амадори (что подтверждено тестом на редукцию феррицианида калия). Продукт был сохранен для биологических тестов под маркировкой EK₂-S-11.

Биологические тесты для определения биологической активности проводили на иммунизированных 8-10-недельных мышах типа Balb/C обоих полов. Иммунизацию мыши осуществляли введением в брюшную полость 0,2 мл 10% суспензии эритроцитов овцы (SRBC), т.е. 610⁸ клеток. Эритроциты зафиксировали в стерильном растворе Альсевера в следующей композиции: глюкоза - 2,05 г; цитрат натрия - 0,8 г; хлорид натрия 0,42 г; лимонная кислота - 0,055 г; дважды дистиллированная вода - 100 мл.

В этот раствор Альсевера вводят асептический образец клеток крови овцы в соотношении 1: 1, затем смесь выдерживают не менее 3 дней при температуре +4^oC. Из стабилизированных таким образом эритроцитов затем отбирают асептические образцы и вводят в фосфатный буфер (PBS) для того, чтобы их промыть. Эритроциты дважды промывают раствором PBS, центрифугируют в течение 10 мин при 2000 об/мин. Вымытые клетки применяют в виде 10% суспензии в PBS. Такую суспензию используют для иммунизации мыши типа Balb/C.

Подлежащий тестированию образец вводили 4 раза внутрибрюшинно или орально в выбранной дозировке, причем первое введение проводили за 2 часа до иммунизации мыши раствором SRBC, а остальные три дозы были введены после иммунизации с интервалами в 24 часа.

Каждой группе тестируемых животных вводили различные дозы тестируемого продукта реакции: 10 мг/кг, 1 мг/кг, 0,1 мг/кг, 0,01 мг/кг. Контрольную группу животных также иммунизировали раствором SRBC, но вместо тестируемого вещества назначали 0,2 мл раствора PBS через такие же интервалы времени.

Каждая группа животных, как контрольная, так и тестируемая, во всех экспериментах включала 8-12 мышей.

На четвертый или (в случае определения антител типа 7S) на десятый день после иммунизации мышей подвергали легкой анестезии эфиром и обескровливали путем полного удаления глазного яблока. Кровь собирали в тестовые пробирки. Эту кровь использовали для получения сыворотки, необходимой для определения гемагглютинированных антител типа 19S+7S, а селезенку использовали для получения клеток, требуемых для определения процентного содержания клеток, способных к формированию Е-розеток и проявляющих гемолитическую активность. Для этой цели селезенки мышей измельчали в порошок. Полученные спленоциты суспендировали приблизительно в 2 мл среды по Hanks при температуре +4^oC и разделяли на слои плотностью 1.077 по градиенту Ficoll-Uropolin, затем центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин при +4^oC. После отделения промежуточной фазы слой лимфоцитов в буферном растворе помещали в среду no Hanks при +4^oC и промывали, центрифугируя дважды каждый раз при 1600 об/мин в течение 7-10 мин. Затем спленоциты суспендировали в 1 мл среды по Hanks до концентрации клеток 110⁶.

Для каждого теста процент погибших клеток определялся путем смешивания капли тестируемой суспензии спленоцитов с каплей раствора красителя, содержащего 4 части 0,2% трипанового синего и 1 часть 4,25% раствора NaCl. Для каждых 100 клеток под микроскопом определяли процент погибших спленоцитов. Погибшие клетки имеют цвет морской волны, в то время как живые клетки светлые. Критическим считается наличие более 10% погибших клеток и такой образец следует исключить из дальнейшего применения.

На всех этапах тестирование следует проводить в стерильном лабораторном сосуде из кварцевого стекла, помещенном в емкость со льдом.

Пример 6. В первом тесте было определено влияние тестируемых продуктов реакции на количество клеток, продуцирующих гемолитические антитела (PFC-lg М). Тест проводили следующим образом: 0.5 мл 5%-ного раствора агарозы, помещенного в пробирку для теста, находящуюся в нагреваемой водяной бане при 45^oC, смешивали с 0,1 мл 10%-ной суспензии SRBC (приготовленного, как описано выше). Затем добавляли 0,1 мл суспензии спленоцитов плотностью 1 10⁶ клеток/мл, смесь быстро перемешивали и немедленно выливали на предметные стекла, предварительно покрытые агарозой. Стекла инкубировали при 37^oC в течение 2 часов. Затем тестируемые образцы покрывают на 2 часа комплементом гвинейской свинки, разбавленным в соотношении 1:20. После инкубации тестируемых образцов комплементом подсчитывали число клеток, формирующих тромбоциты (PFC), и пересчитывали для 110⁶ спленоцитов. Каждый тест проводился дважды.

Наибольшее увеличение ответной реакции на SRBC, выраженной в возрастании числа спленоцитов, продуцирующих гемолизины lg М (PFC), наблюдали после введения дозы 0,1 мг/кг вещества D-11. Усиление ответной реакции составило 119%. При увеличении дневной дозы в 10 раз - до 1 мг/кг, ответная реакция понизилась до 53%. Наиболее высокую активность продукт реакции D-12 проявил при дозе 1 мг/кг - 58%-ное увеличение.

Продукт реакции EK₂-S-11 в этом тесте показал наиболее высокую активность при дозе 0,1 мг/кг (65%-ное увеличение). При дозе в 10 раз выше, т.е. 1 мг/кг, усиление составило до 52%.

Продукт реакции D-13, тестируемый при дозе 1 мг/кг, давал 40%-ное усиление. При увеличении дозы до 10 мг/кг, т.е. в 10 раз, ответная реакция составила только 14%.

Пример 7. Был также проведен тест на активность гемагглютинации, при котором определялись уровни анти-SRBC антител типа 19S+7S и типа 7S. Для определения уровня антител типа 19S-lg М приготавливали мышиную сыворотку на четвертый день после иммунизации мыши SRBC, а для определения уровня антител типа 7S-lg G сыворотка была приготовлена на десятый день после иммунизации мыши SRBC, который считается днем максимального количества антител данного типа в мыши, иммунизированной SRBC.

A. Порядок подсчета антител 19S+7S

Образец крови центрифугировали в течение 30 мин при 3500 об/мин. От каждого приготовленного таким способом образца собирали сыворотку и помещали на 30 мин в подогреваемую до 56^oC водяную баню для деактивации комплемента. Далее из каждой тестируемой сыворотки приготавливали ряд растворов, имеющих несколько разных степеней разбавления (от 1:1 до 1:4096), применяя прибор для микротитрирования и U-образные микрочашки объемом по 20 мл каждая. Разбавленную сыворотку инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. В каждую сыворотку добавляли каплю 1%-ной суспензии SRBC в PBS (приготовленной, как описано выше), затем смесь инкубировали в течение 2 часов при температуре 37^oC и хранили при температуре +4^oC. Результаты проверяли на следующий день. Степень максимального разбавления, при котором все еще происходит гемагглютинация, определялась путем подсчета антител. Появление кольца на дне чашки является доказательством проходящей гемагглютинации. На отсутствие гемагглютинации указывает наличие бляшкоподобных образований на дне чашки, что принимается за отрицательный результат.

Для статистического анализа результатов увеличение разбавления сыворотки в тестируемом веществе сравнивали с аналогичным в контрольной группе.

Продукт реакции D-11 при дозе 1 мг/кг увеличил количество Ig М в 2,57 раз. Увеличенная в десять раз доза стимулировала воздействие в 3,5 раза по сравнению с контрольной группой.

Продукт реакции в этом тесте D-12 в этом тесте показал более слабое воздействие. При дозе 0,1 мг/кг он вызвал увеличение количества иммуноглобулина М (Ig М) в 2 раза, а при дозе 1 мг/кг - в 1,4 раза.

Наиболее сильное воздействие в этом тесте обнаружил продукт реакции EK₂-S-11. при дозе 0,1 мг/кг он вызвал увеличение количества Ig М в 4,3 раза, а при дозе 1 мг/кг - в 3,6 раза.

Продукт реакции D-13 при дозе 1 мг/кг способствовал увеличению количества Ig М в 4,3 раза, а его десятикратная доза - в 3,6 раза.

В. Определение количества антител 7S

Тестируемую неактивированную сыворотку соединяли в соотношении 1:1 с 0,1 М раствором 2-меркаптоэтанола и инкубировали в течение 30 мин при температуре 37^oC. 2-меркаптоэтанол разрушает иммуноглобулины типа 19S - (Ig М), в то время как иммуноглобулины типа 7S -(Ig G) не чувствительны к действию 2-меркаптоэтанола.

После 30-минутной инкубации реакцию редукции останавливали путем снижения температуры до +4^oC в течение 15 минут. Далее описанным выше способом приготавливали ряд разбавлений с учетом подсчета количества антител типа 19S, затем соединяли их с 1%-ной суспензией SRBC, после 2 часов инкубации при 37^oC образцы хранили при +4^oC. Оценку результатов производили на следующий день согласно изложенному выше критерию определения степени гемагглютиниции. Одновременно проводили контрольный тест с комбинацией 1%-ной суспензии SRCB с PBS в соотношении 1:1.

При тестировании вещества D-11, как описано выше, при дозе 1 мг/кг оно увеличивало продукцию антител Ig G в 3.16 раз. При дозе 10 мг/кг увеличение составило 2,2 раза.

Продукт реакции D-12, тестированный при дозе 0,1 мг/кг и 1 мг/кг, соответственно стимулировал продукцию антител Ig G в 1,3 раза, а доза 10 мг/кг - в 1,5 раза.

Продукт реакции EK₂-S-11 при дозе 0,1 мг/кг стимулирует продукцию Ig GB 1,9 раз, а при дозе 1 мг/кг - в 2,89 раз (по сравнению с контрольным).

Затем методом T-student (Т-стьюдент) при а=0,05 провели статистический анализ результатов тестов A и В, полученных для каждой партии продукции или для каждой фракции биологически активных продуктов реакции, синтезированных согласно изобретению и проявляющих вышеупомянутую иммунологическую реакцию. Результаты, полученные для каждой дозы, сравнивали с параллельным контрольным тестом и выявляли увеличение биологической активности.

Пример 8. Группу биологически активных продуктов реакции, полученных в соответствии с Примерами 1-5, также подвергали тестированию, в результате которого определяли процентное содержание Е-розеток, формирующих спленоциты.

250 мл 1%-ной суспензии SRBC и 250 мл подлежащих тестированию клеток в концентрации 110⁶ клеток/мл добавляли к 550 мл среды по Hanks. Затем каждый образец инкубировали в течение 15 мин при температуре 37^oC на водяной бане с подогревом и встряхиванием. Далее образцы выдерживали при температуре +4^oC в течение 20 часов. Процентное содержание Е-розеток, формирующих спленоциты, с SRBC определяли после окрашивания суспензии 1-3 каплями кристаллического красителя фиолетового цвета.

У каждого образца трижды определяли процентное содержание спленоцитов, получив долю каждого примера 400 спленоцитов. За Е-розетку принимали спленоцит, окруженный не менее чем тремя эритроцитами.

Для статистической оценки сравнивали процент увеличения числа спленоцитов с Е-розетками с тестируемыми веществами и контрольной группой.

При этом тестировании самый высокий эффект стимуляции выявили продукты реакции D-11 (63%) и EK₂-S-11 (70%) при дозе 1 мг/кг. При дозе, меньшей в 10 раз, т.е. 0,1 мг/кг, значения понизились соответственно до 45% и 57%.

Продукт реакции D-12 при дозе 1 мг/кг вызывает увеличение способности формирования Е-розеток на 22% по сравнению с контрольной группой. Соответствующее значение для дозы, меньшей в 10 раз, т.е. 0,1 мг/кг, составило 29%.

Продукт реакции D-13 проявляет максимальное действие при дозе 1 мг/кг, причем при более высоких дозах действие слегка снижается.

Биологическая активность синтезированных составов оценивалась согласно следующим тестам:

1. Тест для определения процентного содержания Е-розеток. формирующих спленоциты, проводимый по Bach and Dardenne (Cell. Immunol. 3, 1-16, 197-2).

2. Тест для определения числа клеток, продуцирующих гемолитические антитела Ig М-типа, проводимый по методу Jerne. модифицированному Mishell fnd Dutton (J. Exp. Med. 126, 423-442. 1967) и

3. Тест для определения степени гемагглютиниции антител 19S+7S, проводимый по методам активной гемагглютинации (J. Immunol. 95, 26-38, 39-47, 1965) с помощью микрочашек (J.lmmunopharmacol. 4, 43-52. 1982).

Пример 9. Помещенную в водяную баню с подогревом колбу ротационного испарителя наполняли следующим составом: 1,33 г (0,01 М) - L-аспарагиновая кислота; 0,84 г (0,01 М) - NaHCO₃; 10,00 г - гидролизированный декстран общего молекулярного веса 3000 дальтон; 10,00 мл - дважды дистиллированная вода.

Смесь нагревали под давлением при температуре 70^oC до полного растворения твердых веществ, удалив за это время с помощью дистилляции около 3 мл воды (время нагревания около 30 мин). Легко укутанную колбу с раствором поместили в паровой стерилизатор и нагревали в течение 40 мин под давлением до 121^oC. После охлаждения полученный желто-оранжевый раствор разбавляли 15 мл воды, очищали центрифугированием и высушивали сжатым воздухом с входной температурой +160^oC, а выходной + 85^oC. Полученные в результате реакции 10,5 г продукта светло-бежевого цвета были легко растворимы в воде.

Наличие продуктов перегруппировки Амадори в продукте реакции подтверждали по методу тестирования, описанному Borsook, Abrams and Lowy, J.Biol. Chem. 215. (1955), 111-124, а также методами хроматографии.

Описанные в предыдущих примерах биологические тесты подтверждают иммунологическую активность данного продукта, подобную той, которую обнаруживают препараты, получаемые с простыми сахарами.

Пример 10. Коническую колбу наполняли следующим составом: 5,0 г - гидролизированный декстран общего молекулярного веса около 5000 дальтон; 1.1 г - L-пролин; 4,0 мл - дважды дистиллированная вода.

Содержимое растворяли при перемешивании. Полученную однородную смесь помещали в паровой стерилизатор и нагревали в течение 40 мин под давлением при температуре 110^oC. Полученный прозрачный оранжевый раствор разбавляли 20 мл дважды дистиллированной воды и очищали на центрифуге. Очищенный раствор высушивали сжатым воздухом.

Получали 5,3 г продукта, легко растворимого в воде. Иммунотропная активность была подобна той, которую наблюдали при других экспериментах в соответствии с предыдущими примерами.

Все технологические параметры способа, подлежащие контролю, не приводятся потому, что продукты обладают биологической активностью несмотря на варьирование параметров способа в широком диапазоне. Соответственно определяются только критические особенности реакции. В Примере 5 установлено, что состав смеси можно регулировать и изменять посредством частичного разделения на сорбционных колонках и контролировать хроматографическим методом. Пример может быть дополнен следующими данными и методологией контроля:

1. Определение соединений Амадори и простых сахаров посредством ВЭЖХ на Si-DEAE колонке с последующей постколоночной дериватизацией производных, основанной на использовании спиртового раствора трифенилтетразолий хлорида (ТТХ), согласно работе Reutter и Eichner (Lebensm. Unters. Forch. 188, 28, 1989).

Процитированный выше способ позволяет оценить количественное соотношение индивидуальных соединений Амадори в реакционной смеси после реакции, которое в целом не отличается от исходного соотношения аминокислотной смеси (из-за различных скоростей реакции и скоростей реакций распада).

2. Разделение реакционной смеси после реакции посредством метода ВЭЖХ на гелевых колонках OH-Pak Q-801 (Shodex) с использованием дистиллированной воды в качестве элюента. Так как этот способ разделения соответствует размеру молекул, в образцах, отобранных из реакционных смесей через различные интервалы времени, т.е. при различной продолжительности реакции, можно видеть увеличение фракций молекул с высоким молекулярным весом, что связано со следующими стадиями реакции Майлларда, то есть с декомпозицией соединений Амадори и последующей конденсацией продуктов декомпозиции с аминокислотами.

Такие фракции имеют определенное влияние на продуцирование цитокина, то есть хроматографический контроль процесса реакции позволяет поддерживать его в нужном соотношении с другими фракциями.

Когда элюат контролируется УФ-дефектором (длины волны 215 и 280 нм) и рефрактометрически, субстрат непрореагировавших сахаров виден при рефрактометрической регистрации, так как они не поглощают УФ.

3. ИК-спектры позволяют проводить относительную оценку различия в композиции индивидуального вклада продуктов. Сравнение ИК-спектра настоящего продукта с соответствующими ИК-спектрами предыдущих продуктов, имеющих требуемую биологическую активность, или со стандартным продуктом осуществляют, чтобы модифицировать направление реакции.

Поскольку биологические испытания не вошли в уже отмеченные анализы в описании, то использовались следующие дополнительные способы:

4. Испытание воздействия полученных средств на выживаемость мышиных тимоцитов в 18 и 20 часовых культурах в присутствии гидрокортизона.

Такое испытание используется в Польше в качестве рутинного контроля активности утвержденных иммуномодуляторных средств, известных как TFX (экстракт активных пептидов тимуса) и ТТР (полученных из торфяного экстракта).

Подробное описание анализа приведено ниже. Прилагаются представительные результаты испытания для средств, экспериментально полученных согласно настоящему изобретению, одно из которых является EK₂-S-11, описанным в существующем примере 5, а другое представляет продукт St-2, описанный в дополнительном примере 5А, приведенном далее. Полученные результаты для двух продуктов находятся в полном согласии с соответствующими результатами, представленными для двух отмеченных выше утвержденных иммуномодуляторных лекарст TFX и ТТР. Следует отметить, что результаты были сейчас получены при концентрациях, сравнимых с соответствующими концентрациями ТТР, и они во много раз ниже концентраций TFX, дающих тот же эффект.

5. Для сравнения были выполнены дополнительные испытания, демонстрирующие эффект продуктов, полученных согласно настоящему изобретению, на мышиные фибробласты L929. Такое испытание осуществлялось для оценки цитотоксичности известных иммунотропных препаратов, таких как LEVAMISOL и IMMUTOL, описанных в литературе:

1) Blach-Olszewska Z., Zaczynska Е., Arch Immunol. Ther. Exp., 1991, 39, 597-606 и 2) Zaczynska Е., и др. Acta Virol., 1992, 36, 121-8. Этот способ подробно описан ниже и после него даны результаты, полученные для нескольких образцов продуктов согласно изобретению. Здесь следует отметить, что все испытываемые образцы показали низкую токсичность, ниже, чем выше отмеченные торговые продукты.

Дополнительный Пример

Пример 5А (для вставки в описание на стр. 11, после строки 15)

При использовании оборудования и метода, описанного в Примере 5, следующие вещества использовали в качестве исходных материалов: 100 мг L-аспарагиновой кислоты, 100 мг L-тирозина, 20 мг L-треонина, 20 мг L-серина, 100 мг фенилаланина, 70 мг глутаминовой кислоты, 90 мг глицина, 90 мг L -аланина, 50 мг L -валина, 40 мг L-изолейцина, 60 мг L-лейцина, 100 мг гидрохлорида гистидина, 20 мг гидрохлорида лизина, 10 мг гидрохлорида аргинина, 100 мг NaHCO₃, 5 мг H₂O.

После упаривания примерно 2.8 мл воды при пониженном давлении субстраты были растворены на термической бане при температуре 75-80^oC. Затем жидкую реакционную смесь нагревали при температуре 86-90^oC в течение 2 часов при нормальном давлении. Затем давление уменьшили и реакционную смесь упарили до сухого остатка. В конце стадии упаривания добавили две порции безводного этанола, по 15 мл каждая. Реакционную колбу охлаждали в эксикаторе. Продукт, полученный с выходом 1.5 г, представлял собой порошок и был отмечен символом St - 2.

Дополнительные испытания:

1. Определение выживаемости мышиных тимоцитов в 18 - и 20 - часовых культурах с гидрокортизоном в присутствии тестируемых веществ, D-10, EK₂-S-11 и St-2.

Испытание выживаемости мышиных тимоцитов в 18 - и 20 - часовых культурах с гидрокортизоном.

Животные для испытаний: самки мышей Balb/c в возрасте 5 недель. Нормативный источник клеток: масса тимоцита мышиного тимуса.

Реагенты: 1) раствор RPMI 1640; 2) фетальная телячья сыворотка (FCS)-инактивированная (темп. 56^oC в течение 30 минут), 3) гемисукцинат гидрокортизона в растворителе - ампула (HC) - от польского поставщика лекарства POLFA.

Растворы для испытаний: тестируемые вещества растворяли в RPMI 1640 и готовили растворы, содержащие 5 мкг/мл, 1 мкг/мл и 0,5 мкг/мл для каждого тестируемого вещества.

Способ проведения анализа: 2 - 3 самки мышей (для каждого тестируемого вещества) усыпляли посредством эфира, чтобы удалить гланды тимуса. Гланды гомогенизировали и суспендировали в RPMI 1640 и 10% инактивированной FCS. Суспензию затем отфильтровывали через фильтр, обычно используемый для фильтрации крови, и два раза центрифугировали в той же среде (RPMI 1640 с 10% инактивированной FCS) в течение 10 минут при 1200 оборотов в минуту. Далее клетки ресуспендировались в той же среде при концентрации 4х10⁶ клеток/мл.

Приготовленную таким образом суспензию тимоцита помещали в стерильные тест-пробирки: 1 мл суспензии в каждую пробирку помещали на ледяную баню. Для каждого определения готовили две пробирки. Все стадии должны осуществляться в ламинарной камере.

Проводят следующие определения:

1. Тимоциты в RPMI 1640 с 10% FCS.

2. Тимоциты в RPMI 1640 с 10% FCS + гидрокортизон (HC) 50 мкг/мл.

3. Тимоциты в RPMI 1640 с 10% FCS + испытываемое соединение в концентрациях 5 мкг/мл, 1 мкг/мл и 0,5 мкг/мл. После того, как тестируемые соединения добавляют к культуре тимоцитов культуру инкубируют в течение 1 часа в инкубаторе при постоянном токе 5% CO₂ при температуре 37^oC.

4. Тимоциты в RPMI 1640 с 10% FCS + тестируемые соединения в концентрациях, определенных в пункте 3 + HC 50 мкг/мл. Такие тестируемые культуры инкубируют в течение 18 и 20 часов при 37^oC в атмосфере 5% CO₂.

Для каждой культуры 3 - 4 раза определяют процент живых и мертвых клеток. Для окрашивания мертвых клеток используют тирпан голубой; непосредственно перед определением выживаемости клеток 0,2% раствор тирпана голубого смешивают с 4.25% раствором NaCl в соотношении 4:1. Тимоциты, окрашенные в голубой цвет, считают мертвыми, тогда как бесцветные клетки считаются живыми.

Интерпретация результатов: делают 3 - 4 расчета для каждой тестируемой культуры. Чувствительность тимоцитов к гидрокортизону рассчитывается следующим образом:



Указанные тестируемые вещества, при тестируемых концентрациях: 5 мкг/мл, 1 мкг/мл и 0,5 мкг/мл способные, по крайней мере, на 25% увеличивать число выживших тимоцитов в культуре с гидрокортизоном, рассматриваются как обладающие активностью. Согласно стандартному способу, те вещества, которые показали, по крайней мере однажды увеличение выше 25% в 6 опытах (3 дозы, каждая повторена дважды) следует рассматривать как активные.

11. Определение цитотоксического эффекта препаратов на культуры мышиных фибробластов L929

Фибробласты как человека, так и животного происхождения, являются восприимчивыми к цитотоксическим веществам различной природы. Линия L 929 обычно используется для определения цитотоксичности TNF. Действие тестируемых веществ на клеточную линию определяли согласно описанному ниже методу.

Метод осуществления анализа: тестируемые вещества растворяли в дистиллированной воде. Готовили основные растворы с концентрацией 16 мг/мл для D-10 и St-2. Дальнейшие разведения осуществляли с использованием культуральной среды RPMI с 10% инактивированной FCS.

Планшеты на 96 плоских лунок (Flow Laboratories) использовали для осуществления разведений. Каждую лунку инокулировали 100 мкл суспензии клеток L 929 в концентрации 1.510⁵ клеток/мл. Конечное тестируемое разведение D-10 и St-2 было следующим: 800 мкг/мл, 400 мкг/мл, 200 мкг/мл..., снижаясь до 12,5 мкг/мл и 6,25 мкг/мл. На каждом планшете осуществили контроль: один, состоящий из клеточной культуры L 929 в культуральной среде (RPMI 1640 + 10% FCS), и другие, состоящие из клеточной культуры L 9292 в культуральной среде с подходящим количеством бидистиллированной воды. Подготовленные таким образом планшеты инкубировали при 37^oC в атмосфере 5% CO₂. Результаты оценивали через 24 и 48 часов с использованием инвертированного микроскопа OPTON. Каждое испытание повторяли трижды.

Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из настоящего испытания, тестируемые вещества не являются цитотоксичными. Тот же тест использовался для оценки цитотоксичности IMMUTIOL и LEVAMISOL. IMMUTIOL проявляется эффект цитотоксичности в концентрации ниже 1 мкг/мл (цитированная работа Zaczynska E и др.), a LEVAMISOL - при концентрации 500 мкг/мл (цитированная работа Blach-Olszewska и др.). Как уже отмечалось, эти два торговых препарата разрешены для медицинского использования в Польше.

Для трех веществ EK₂-S-11, D-10 и ST-2 более подробные идентификационные данные представлены на прилагаемых фиг.1-6: 2 хроматограммы и ИК-спектр для каждого вещества.

В дополнение к этому обеспечены ИК-спектры и хроматограммы на колонках OH-pak Q-801 для фракции D-11, сделанные в 1991 и 1993 гг., показывающие, что результаты полностью воспроизводимы. Представлены четыре дополнительных рисунка.

Пример 11. Известные методы тестируют биологическую активность составов на мышах, но не на людях. По этой причине был применен новый метод, измеряющий количество и активность цитокинов, высвобождающихся из лейкоцитов периферической крови человека (PBL), согласно которому они обрабатывались продуктами реакции по примерам 1-5, 9 и 10. Цитокины представляют собой гормоноподобные протеины, которые играют важную роль практически во всех иммунологических реакциях, а также в процессах регуляции, ответственных за поддержание гомеостаза.

Исследования цитотоксичности

Цитотоксичность продуктов реакции определяли в клетках легких человека - линия аденокарциномы А 549 (включенная в Американскую Коллекцию типов культур-АТСС CCL 185). Клеточные слои были обработаны трипсином. Суспензии, содержащие 210⁵ клеток/мл в основной среде по Eagle, модифицированной по Dulbecco (DMEM), включающей также 10%-ную телячью сыворотку (CS), смешивали с различными дозами лекарственных препаратов, посеянных в микрочашках, и инкубировали в течение 48 часов при 37^oC. CD₅₀ являлось минимальной концентрацией состава, который способствовал разрушению примерно 50% клеточной культуры, что показало измерение при помощи окрашивания 0,015%-ного нейтрального раствора красного цвета в DMEM.

Индукция цитокина

Светлые слои кровяных сгустков от здоровых доноров крови получали из регионального центра переливания крови. Эритроциты лизировали обработкой NH₄Cl по Cantell и et al. (Cantell, K., Hirvonen, S., Kauppinen, H.L.: Production and Partial Purification of Human Immune Interferon. Meth. Enzymol, 119, 54, 1986). Использовали только лейкоциты одного донора, содержащие примерно 8 10⁶ лейкоцитов/мл в среде RPMI 1640, смешанные с 10%-ной сывороткой коровьего эмбриона (FCS), L-глутамином и антибиотиками. Все партии FCS предварительно тестировали. Для культур PBL использовали только немитогенные FCS. Индукторы цитокинов добавляли к объемам культур 1 мл. В качестве образцовых индукторов были использованы фитогемагглютинин (PHA) (Pharma Fine Chemicals, Sweden) и липополисахариды (LPS) из E.coli 0111:В4 (Difco Laboratories). Индуцированные культуры PBL инкубировали в атмосфере 5% CO₂ при 37^oC в течение 20 часов, затем центрифугировали. Супернатанты сохраняли при 4^oC и в течение одной недели испытывали на TNF и IFN-активность.

Испытание интерферона

Были приготовлены сливающиеся монослои клеток А549 в микропластинках в среде, модифицированной по Dulbecco, [Dulbecco modified Minimum Essential Medium (DMEM)] с 10% SC, L-глутамином и антибиотиками (пенициллин 100 ед/мл и стрептомицин 100 мкг/мл). Образцы IFN, разбавленные в пластинках, добавляли к монослою клеток и инкубировали при 37^oC. 20 часов в 5% CO₂ в воздухе. Затем клетки отмывали и подвергали воздействию вируса энцефаломиокарда (EMCV). Титр IFN был определен как разбавление образца IFN, которое сокращало цитопатогенный эффект на 50% за 48 часов инкубации. Для измерения гибели клеток в сканере ELISA был использован способ МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2-ил] -2,5-дифенилтетразолиум-бромпид) (Hansen, М.В., Nielsen, S.E. and Berg.К.: Re- examination and Further Development of a Precise and Rapid Dye Method for Measuring Cell Grouth/cell Kill. J. Immuno. Meth. 1989, 119, 203- 210. ). Лабораторные стандарты IFN должны быть включены во все испытания, например рекомбинационный человеческий IFN-гамма (Genetech Inc., USA), (собственная активность 2000000 ед/мг), естественный человеческий IFN-альфа (3000000 1ЕД./мл) и IFN-гамма (2000000 1ЕД/мл).

Испытание TNF (фактор некроза опухоли)

Цитотоксическая активность TNF измерялась в клетках L₉₂₉ по Flick and Gifford (Flick, D.A., Gifford, G.E..: Comparison, of in Vltro Cell Cytotoxic Assays for Tumor Necrosis Factor. J. Immunol. Meth. 68, 1667, 1984.). Образцы и раствор актиномицина D были добавлены к монослою клеточных культур. После инкубации при 37^oC в течение 20 часов цитотоксические эффекты TNF определяли либо микроскопическим анализом культур, либо способом ММТ. Количество, вызывающее разрушение приблизительно 50% клеточных культур, приняли за одну единицу активности TFN. Сравнение с препаратом TNF-альфа (Genetech Inc. , USA) показало, что 1 единица в испытаниях была равна 100-200 pg/мл TNF.

Испытания нейтрализации цитотоксинов

Использовали антисыворотку: кролика с анти-человеческим TNF-альфа, серия 2891-40 и кролика с анти-человеческим INF-гамма, серия 2891-56 (Genetech Inc. , USA), овцы с анти-человеческим IFN-альфа. IFN-бета и овцы с анти-человеческим IFN-гамма (полученную от Dr.K.Cantell, Finland). Препараты цитокина обрабатывали сывороткой, разбавленной 1:200 в среде культуры, и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. Затем определяли, как уже описано, остаточную активность IFN или TNF.

Использовали пять различных групп PBL (L₁-L₅), приготовленных из крови здоровых доноров. Оптимальная концентрация PBL, обнаруженная в испытаниях, составила 810⁶ клеток на 1 мл среды (RPMI 1640, смешанной с 10%-ной сывороткой коровьего эмбриона и антибиотиками).

Инкубация PBL человека с новыми продуктами реакции I-XI (Табл. 1) вызвала синтез IFN и TNF. Реакция наблюдалась при дозах составов, равных 3-100 мг/мл. Составы, используемые в указанных концентрациях, были нетоксичны. Во все остальные биоиспытания включили отрицательный и положительный контроль. Отрицательный контроль измерял количество цитокинов (IFN и TNF), продуцируемых спонтанно без добавления каких-либо экзогенных стимуляторов. Положительный контроль определял количество цитокинов, продуцируемых при реакции с каким-либо известным индуктором; в данном случае - фитогемагглютинин (PHA, Pharmacia, Sweden, 10 мг на мл).

Следует отметить, что индукция цитокинов в культурах PBL человека, полученных от различных индивидуумов, обычно дает значительно варьирующие результаты. Этот феномен можно объяснить генетическими различиями в популяции человека. Кроме того, зачастую культуры PBL продуцируют IFN и TNF спонтанно.

Иначе говоря, среди здоровых доноров PBL обычно наблюдают индивидуумы, как с сильным иммунитетом, так и со слабым, а также с нейтральной реакцией.

Независимо от изложенных ограничений результаты биоиспытаний показали, что PBL (L₁-L₅), обработанные продуктами реакции (I-XI), продуцируют IFN и/или TNF, который может быть измерен количественно.

В случае L₁, который включает лейкоциты индивидуума с сильной реакцией, продукт реакции II (содержащий L-аспарагиновую кислоту) обнаруживал значительно большую активность как индуктор цитокинов, чем продукт реакции III (содержащий D-аспарагиновую кислоту, который к тому же дороже на два порядка). Это наблюдение имеет важное значение, т.к. в биохимических реакциях клетки распознают как природные вещества, главным образом, L-аминокислоты. Кроме того, для выражения биологической активности продуктов реакции аминокислотная часть молекулы имеет более важное значение, чем форма сахара. Вместо единичных сахаров, предпочтительно низкомолекулярного веса, в частности менее 1000 дальтон, можно использовать дающие аналогичную реакцию полисахариды (такие как декстраны, продукты реакции X-XI).

И наоборот, полисахариды, содержащие аминокислотные остатки, могут иметь биологическую активность и такая активность сохраняется, если они разложены на олигосахариды со связанной аминокислотой (данные не приводятся).

Подобные результаты можно также получить, если вместо одной аминокислоты берут небольшие пептиды и применяют для стимуляции продукции цитокинов лейкоцитами (данные не приводятся).

При испытании семи групп образцов нефракционированных ТТР в более чем 100 культурах PBL, полученных от разных доноров, обнаружена продукция от 10 до 1.000 единиц IFN на мл, и от 9 до 750 единиц TNF на мл. Фракция EK₂-5, приготовленная из смеси, соответствующей составу натурального экстракта торфа (Пример 5), была испытана в восьми культурах PBL, полученных от различных доноров крови. Было обнаружено, что наиболее активными являются препараты, включающие как IFN, так и TNF (данные не приведены).

Возможными областями применения продуктов реакции являются иммуномодуляторы, причем их клинические испытания были успешными. Доказано также их воздействие на регенерацию тканей. Возможно, наблюдаемое противораковое действие связано с наличием индуцированного интерферона и фактора некроза опухоли. Зафиксировано также противовирусное действие.

Наиболее распространенным является оральный прием продуктов реакции, но возможен также и парентеральный способ введения. Продукт является достаточно стабильным.

Пример 12

Фармацевтические препараты, содержащие в качестве активного ингредиента продукты реакции, согласно Примерам 1-5, 9 и 10 приготавливали с помощью следующих продуктов реакции:

A. Таблетки/Гранулы

5,0 г - продукта реакции, полученного по Примеру 1 или 10 (активное вещество),

444,0 г - фармацевтически допустимой лактозы

1,0 г - смазочного материала, например, MYVATEX^(R), зарегистрированный товарный знак Eastman Kodak

Ингредиенты смешивали и гранулировали обычным способом в 30%-ном жидком растворе этанола, затем высушивали при 40^oC. Гранулы использовали для приготовления капсул, каждая из которых содержала около 450 мл гранул, т.е. 5 мг активного вещества. Соответственно для приготовления таблеток использовали гранулы весом около 450 мг каждая и содержащие 5 мг активного вещества.

В. Таким же образом активные вещества, полученные согласно предыдущим примерам 1-5, 9 и 10, были включены в состав других фармацевтических композиций с использованием соответствующих носителей.

Пример 13

Активные вещества, полученные согласно предыдущим примерам 1-5, 9 и 10, применяли в качестве целебных добавок к косметическим препаратам, предназначенным для ежедневного ухода за волосами и телом, причем весовое содержание веществ находилось в диапазоне 0,01-10%, в зависимости от типа препарата, способа и частоты применения определенного препарата.