способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы (рбп)

Формула изобретения

Способ изготовления бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы, включающий приготовление посевного материала штамма Brucella abortus 19, его производственное культивирование, отделение и концентрирование выросших бактериальных клеток, их инактивирование нагреванием, окрашивание роз-бенгалом с последующим ресуспендированием в буферном разбавителе и стандартизацией целевого продукта, отличающийся тем, что для приготовления посевного материала и производственного культивирования используют жидкую питательную среду следующего состава об.%:

Перевар Хоттингера - 20 - 25

Глицерин - 1 - 2

Глюкоза - 1 - 1,5

NaCl - 0,5

Дрожжевой аутолизат нативный с сухим остатком 15 - 17% - 3,0 - 3,5

Вода водопроводная - До 100

культивирование проводят в глубинных условиях в течение 19 - 21 ч с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования: после внесения посевного материала с 1 по 6 ч культивирования устанавливают уровень 20 - 25 рО2, с 6 по 16 - 18 ч - 40 - 45 рО2 и затем с 16 - 18 по 19 - 21 ч - 30 - 35 рО2, а отделение и концентрирование проводят ультрафильтрацией на волокнах с пределом задержания 15 - 50 кД.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при промышленном производстве антигена для диагностики бруцеллеза.

Известен способ промышленного получения бруцеллезного антигена для реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК) путем получения посевного материала штамма Brucella abortus 19 на плотной питательной среде, глубинного производственного культивирования в биореакторах в течение 24 ч в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, NaCl, дрожжевой экстракт и воду с дальнейшей очисткой и концентрированием культуры на ультрафильтрационных колонках, отмывкой и ресуспендированием микробных клеток 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором (RU 2085212 C, опубл. 27.07.97).

Однако используемая питательная среда и режимы глубинного культивирования не являются оптимальными для активного накопления бруцелл - концентрация микробных клеток на конец культивирования (24 ч) составляет 35 - 45 млрд. м.к./см³, операция получения посевного материала на плотной питательной среде трудоемка, а концентрирование проводится в два приема, что усложняет производство.

Наиболее близким аналогом по решаемой задаче является способ получения бруцеллезного цветного антигена для роз бенгал пробы (РБП), заключающийся в том, что чистую культуру штамма Brucella abortus 19 выращивают в течение трех суток в четвертях на плотной питательной среде - печеночно-мартеновском агаре с добавлением перевара Хоттингера. Выросшую культуру бруцелл смывают стерильным 0,5%-ным фенолизированным физиологическим раствором и инактивируют в водяной бане при 80^oC в течение 1 ч. Суспензию инактивированных клеток окрашивают 1%-ным водным раствором краски бенгальской розовой и ресуспендируют в буферном разбавителе, включающем едкий натр, фенолизированный физиологический раствор и молочную кислоту ("Ветеринарные препараты". Справочник, под ред. Д.Ф.Осидзе, М., Колос, 1981, с. 185 -188).

Однако известный способ изготовления не технологичен: культивирование ведется на дорогостоящей, сложной в изготовлении плотной питательной среде; время культивирования составляет 72 ч; требует использования большого количества стеклянной посуды; площадей и оборудования; не исключает опасности возможного контакта персонала с возбудителем бруцелл. Кроме того, по существующей технологии в антиген могут попадать белки питательной среды, что сказывается на появлении неспецифических реакций при постановке РА.

Задачей изобретения является разработка промышленной технологии получения бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы с более высокими качественными характеристиками.

Технический результат изобретения заключается в упрощении способа на всех стадиях технологического процесса: получения посевного материала, производственного культивирования, очистки и концентрирования, инактивации, окрашивания, снижения производственных потерь, себестоимости антигена, контакта персонала с возбудителем бруцеллеза, а также повышении специфичности, чувствительности и стандартности получаемого диагностикума.

Сущность изобретения заключается в следующем: при изготовлении бруцеллезного антигена для роз бенгал пробы получают посевной материал штамма Brucella abortus 19 и осуществляют производственное культивирование в жидкой питательной среде следующего состава (об.%):

Перевар Хоттингера - 20 - 25

Глицерин - 1 - 2

Глюкоза - 1 - 1,5

NaCl - 0,5

Дрожжевой аутолизат нативный с сухим остатком 15-17% - 3,0-3,5

Вода водопроводная - до 100,

культивирование проводят в глубинных условиях в течение 19-21 ч с регуляцией уровня парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода на протяжении всего процесса культивирования: после внесения посевного материала с 1 по 6 ч культивирования устанавливают уровень 20 - 25 pO2, с 6 по 16-18 ч - 40-45 pO2 и затем с 16-18 по 19-21 ч - 30-35 pO2, выросшие бактериальные клетки отделяют и концентрируют ультрафильтрацией на волокнах с пределом задержания 15-50 кД, инактивируют нагреванием, окрашивают роз-бенгалом, ресуспендируют в буферном разбавителе и стандартизируют целевой продукт.

Усовершенствование производственной питательной среды, используемой при изготовлении единого бруцеллезного антигена, и режимов глубинного культивирования обеспечивает увеличение накопления микробных клеток до 55-65 млрд. м. к. /см³ и сокращает время культивирования до 19-21 ч. Полученная культура бруцелл обладает наиболее полноценными антигенными свойствами, что приводит к получению биологически активного и специфичного диагностикума. Применение для ультрафильтрации волокон с пределом задержания 15-50 кД обеспечивает эффективное концентрирование бактериальной суспензии в одну стадию и исключает операцию отмывки микробных клеток от остатков питательной среды.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют оптимизированную питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи (об.%): перевар Хоттингера - 25, глицерин - 2, глюкоза - 1,5, NaCl - 0,5, дрожжевой аутолизат нативный - 3,4, водопроводная вода до 100,0.

В готовой питательной среде содержание аминного азота составляет 150-160 мг %, pH среды 6,8-7,1. Среду стерилизуют фильтрацией через пластины типа СФ.

Для получения посевного материала чистую культуру штамма Brucella abortus 19 засевают в микроферментер с оптимизированной питательной средой и культивируют 24-26 ч до накопления 35-45 млрд. м.к./см³. Бактериальную суспензию сливают в стерильные бутыли и хранят в холодильнике до 5 недель.

Производственное культивирование проводят глубинным методом в биореакторе в питательной среде того же состава. Засев осуществляют полученной бактериальной суспензией с концентрацией 1,5 млрд. м.к./см³. При культивировании концентрацию водородных ионов (pH) поддерживают в пределах 6,8-7,1. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода с 1 по 6 ч культивирования составляет 20-25 pO2; с 6 по 18 ч - 40-45 рO2 и с 18 по 21 ч - 30-35 рO2. По окончании культивирования бактериальную суспензию Brucella abortus шт. 19 с концентрацией 65 млрд. м.к./см² концентрируют в 10-11 раз ультрафильтрацией на волокнах ВЛУ-15-50 ПА с пределом задержания 15-50 кД. К концентрату в биореакторе добавляют 1% фенолизированный физиологический раствор и ресуспендируют до концентрации 180 - 220 млрд. м. к. /см². Инактивацию бактериальной суспензии проводят в биореакторе при температуре 80^oC в течение 60 мин при постоянном перемешивании.

После охлаждения бактериальной суспензии берут пробу и определяют необходимое количество краски бенгальской розовой. Объем краски закачивают в биореактор, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре до следующего дня.

Окрашенную суспензию бруцелл из биореактора подают на центрифугу ОТР 101 К, отделяют бакмассу от краски, фенолизированного физиологического раствора и остатков питательной среды и ресуспендируют ее буферным разбавителем при перемешивании в течение 1 часа.

Полученный антиген стандартизируют по активности с национальной агглютинирующей бруцеллезной сывороткой, содержащей в 1 мл 1000 международных единиц (ME) антител. Разводят буферным разбавителем до концентрации 90-95 млрд. м.к./см³ и расфасовывают.

Пример 2. Антиген изготовляют аналогично примеру 1, но для получения посевного материала и производственного культивирования бруцелл используют оптимизированную питательную среду на основе перевара Хоттингера, приготовленную по следующей прописи (об.%): перевар Хоттингера - 20, глицерин - 1, глюкоза - 1,0, NaCl - 0,5, дрожжевой аутолизат нативный - 3,0, водопроводная вода до 100,0.

При производственном культивировании засев осуществляют бактериальной суспензией с концентрацией 3 млрд. м.к./см³. Уровень парциального давления растворенного в культуральной жидкости кислорода с 1 по 6 ч культивирования поддерживают в режиме 20 - 25 рO2; с 6 по 16 ч - 40-45 рO2 и с 16 по 19 ч - 30-35 рO2. По окончании культивирования получают бактериальную суспензию Brucella abortus шт. 19 с концентрацией 55 млрд. м.к./см³. Далее технологический процесс проводят аналогично примеру 1.

Пример 3. Активность и специфичность полученного по примерам 1 и 2 антигена устанавливают при его титровании в РА с национальной бруцеллезной агглютинирующей сывороткой против Brucella abortus, содержащей в 1 мл 1000 ME антител в сравнении с известным антигеном для РБП, содержащем 115 млрд. м.к. /см³.

Предлагаемый антиген, содержащий меньшее количество клеток (90-95 млрд. м. к. /см³) дает реакцию интенсивностью в 4 креста с сывороткой в разведении 1: 10, содержащей 50 ME, 1,5-2 креста с сывороткой в разведении 1:20 (35 ME) и отрицательную реакцию с сывороткой в разведении 1:35 (28,5 ME), что свидетельствует о ее более высокой активности по сравнению с известным диагностикумома