способ выделения клавулановой кислоты

Формула изобретения

1. Способ выделения клавулановой кислоты, включающий удаление из водного культурального бульона мицелия, основной части белков и других суспендированных твердых частиц, с последующей экстракцией клавулановой кислоты несмешивающимся с водой органическим растворителем и выделением целевого продукта из органической фазы, отличающийся тем, что указанное удаление осуществляют путем многоступенчатой непрерывной микрофильтрации при температуре 20-40^oС.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микрофильтрацию ведут через фильтрационные элементы, имеющие размер пор 0,05 мкм.

3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что микрофильтрацию осуществляют при величине рН, находящейся между 5,8 и 6,2.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию проводят при рН 1-3 с использованием центробежного экстракционного аппарата с противотоком.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что экстракцию ведут последовательно в серии центробежных экстракционных аппаратов.

6. Способ по любому из пп.1, 4 и 5, отличающийся тем, что органический растворитель выбирают из группы, включающей этилацетат, метилацетат, метилизобутилкетон и n-бутанол.

7. Способ по любому из пп.1 и 4-6, отличающийся тем, что органический растворитель представляет собой этилацетат.

8. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что после микрофильтрации полученный фильтрат дополнительно очищают ультрафильтрацией.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что ультрафильтрацию осуществляют непрерывно с использованием полупроницаемой мембраны, имеющей степень разрешения между 10 и 30 кДа.

10. Способ по любому из пп.1-9, отличающийся тем, что перед экстракцией осуществляют стадию удаления воды путем обратного осмоса.

11. Способ по любому из пп.1-10, отличающийся тем, что выделение целевого продукта из органической фазы включает ее высушивание в вакууме с использованием ректификационной колонки.

12. Способ по любому из пп.1-11, отличающийся тем, что выделение целевого продукта из органической фазы включает осуществление взаимодействия клавулановой кислоты, растворенной в несмешивающемся с водой растворителе, с N, N"-диизопропилэтилендиамином с получением диклавуланата N,N"-диизопропилэтилендиаммония.

13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что выделение целевого продукта из органической фазы включает осуществление взаимодействия диклавуланата N,N"-диизопропилэтилендиаммония с 2-этилгексаноатом калия с получением чистого клавуланата калия.

Описание изобретения к патенту

Изобретение принадлежит к области фармацевтической промышленности и относится к новому улучшенному способу выделения клавулановой кислоты и ее фармацевтически приемлемых солей из культурального бульона Streptomyces sp. Р6621 FERM P 2804.

Необходимость в новом улучшенном способе получения чистой клавулановой кислоты и ее фармацевтически приемлемых солей, таких как клавуланат калия, путем выделения их из культурального бульона, полученного при культивировании микроорганизмов, продуцирующих клавулановую кислоту, причем в таком способе должны отсутствовать сложные традиционные методики выделения и хроматографической очистки желаемого продукта, существует постоянно.

Клавулановая кислота представляет собой (2R,5R,Z)-3-(2-гидроксиэтилиден)-7-оксо-4-окса-1-азабицикло[3.2.0]гептан-2 -карбоновую кислоту следующей формулы:



Соли щелочных металлов и эфиры ее являются активными ингибиторами бета-лактамаз, продуцируемых некоторыми Грам-позитивными, а также Грам-негативными микроорганизмами.

Помимо ингибирующей бета-лактамазы активности клавулановая кислота и ее соли щелочных металлов дают синергический эффект в комбинации с бета-лактамными антибиотиками ряда пенициллина и цефалоспорина. Таким образом, клавулановая кислота и ее соли используют в галеновых препаратах для предотвращения дезактивации бета-лактамных антибиотиков. Коммерческие препараты содержат более стабильные калиевые соли клавулановой кислоты (кислота сама по себе не является стабильной) в комбинации с тригидратом амоксициллина.

Клавулановую кислоту получают путем культивирования микроорганизмов, продуцирующих клавулановую кислоту, таких как различные микроорганизмы, являющиеся представителями различных штаммов рода Streptomyces, например S. c1avuligerus NRRL 3585, S. jumoninesis NRRL 5741, S. katsurahamanus IFO 13716 и Streptomyces sp. P6621 FERM P2804.

Водный культуральный бульон, полученный после культивирования, может быть очищен и сконцентрирован традиционными способами, включающими в себя, например, фильтрацию и хроматографическую очистку [1], перед экстракцией водного раствора органическим растворителем для получения раствора неочищенной клавулановой кислоты в органическом растворителе.

Известно [1] , что соли клавулановой кислоты могут быть получены путем адсорбции аниона клавуланата из профильтрованного бульона на анион-обменной смоле и затем элюированы электролитом, образовавшийся раствор обессаливают и затем растворитель удаляют. Этот способ может быть использован для получения приемлемого выхода желаемой субстанции, хотя требуется еще сложная хроматографическая очистка, а использование колонок со смолами требует вложения значительных средств, что ограничивает получение продукции в больших масштабах.

Известен [2] модифицированный способ культивирования с использованием штамма S. c1avuligerus NRRL 3585, при котором величина рН среды поддерживается в пределах между 6,3 и 6,7 и, таким образом, выход желаемого продукта возрастает. Соли клавулановой кислоты, такие как клавуланат калия, получают путем повторного солеобразования из клавуланата лития, вследствие чего желаемое соединения является также очищенным.

Известно [3] применение трет-бутиламиновой соли клавулановой кислоты в качестве полезного промежуточного продукта при получении клавулановой кислоты. Такая соль известна [4], но лишь как ингредиент фармацевтических композиций.

Известен [5] способ получения клавулановой кислоты путем культивирования микроорганизма S.c1avuligerus. Важное улучшение в этом способе было достигнуто путем добавления источника углерода, такого как глицерин, в культуральную среду по ходу процесса либо непрерывно, либо с перерывами, причем очень важно, чтобы концентрация углерода поддерживалась на достаточно низком уровне, а именно ниже 0,5% (в/о) и ни в коем случае не выше 2%. Примеры иллюстрируют, что существенное улучшение в смысле повышенного выхода клавулановой кислоты наблюдалось, когда источник углерода добавлялся в течение культивирования. Установлено, что концентрация клавулановой кислоты в культуральном бульоне через 160 ч была около 1400 мг/мл, что является заметным улучшением по сравнению с известными ранее способами.

Дальнейшим улучшением является новый способ очистки клавулановой кислоты из раствора в виде ее литиевой соли. Однако для достижения более высокой чистоты клавуланата лития добавляют концентрированный раствор другой соли лития, такой как хлорид лития. Полученный рекристаллизованный клавуланат лития может быть очищен далее, а затем возможно превращен в другие соли, такие как клавуланат калия, известными из литературы способами.

Мицелий, белки и другие твердые вещества удаляют известными способами, такими как центрифугирование или фильтрация с возможной предварительной обработкой культурального бульона выбранным агрегирующим агентом для агрегации мицелия, что делает возможным облегчение фильтрации. Такое отделение мицелия, белков и других сопутствующих частиц, первоначально находящихся в культуральном бульоне в виде суспензии, отнимает много времени и требует несколько рабочих стадий.

Требующих значительных затрат времени способов удаления мицелия, белков и других суспендированных частиц с последующим выделением из полученного прозрачного культурального бульона, а также получением чистой клавулановой кислоты и ее солей удается избежать при использовании другого известного способа [6, 7].

В целом этот способ включает в себя три стадии, а именно очистку культурального бульона от мицелия, белков и других твердых частиц, очистку клавулановой кислоты, присутствующей в неочищенном виде в бульоне из очищенного фильтрата S.с1avuligerus, с использованием одного первичного, вторичного или третичного амина, образующего стабильные промежуточные соли клавулановой кислоты, после чего основная часть сопутствующих примесей в клавулановой кислоте оказывается отделенной, и в качестве последней стадии превращение промежуточных аминных солей клавулановой кислоты (85%-ной чистоты) в желаемую соль щелочного металла, такую как клавуланат калия.

Первая стадия описана детально [6], на ней из водного культурального бульона, полученного путем культивирования микроорганизма S.с1avuligerus, путем физико-химического способа коагуляции-флоккуляции удаляют мицелий, белки и другие твердые частицы. Полученные в этом способе хлопья являются достаточно большими и компактными, так что возможно легко осуществить седиментацию или сепарацию, что лучше всего достигается с использованием вращающегося сита. Таким образом получают прозрачный бульон, который может быть сконцентрирован путем обратного осмоса.

Таким образом получают очищенный культуральный бульон, избежав традиционных процедур очистки, таких как центрифугирование, адсорбцию на активированном угле, фильтрацию с коадъювантами и т.д.

Во всех известных способах также необходимо (что отличается от описанного флоккуляционного способа), чтобы очищенный культуральный бульон был очищен различными способами депротеинизации и обмена ионов, что обуславливает значительные потери в конечном выходе желаемого вещества. В отличие от хорошо известных способов общий выход во флоккуляционном способе составляет от 85 до 90%.

Описанный способ коагуляции-флоккуляции из культурального бульона S. c1avuligerus основан на добавлении неорганического электролита в культуральный бульон для увеличения коагулирующего эффекта, добавлении неорганического коагулянта в качестве инициатора процесса коагуляции при перемешивании и величине рН среды между 6 и 8, добавлении органического электролита, когда флоккуляция уже началась, а затем отделении полученных хлопьев от культурального бульона с использованием вращающегося сита или фильтрации и, возможно, если флоккуляция имеет место в присутствии несмешивающегося с водой растворителя, декантации фаз, отделении хлопьев и, возможно, концентрации жидкости путем обратного осмоса или выпаривания.

Известно [8] применение солей клавулановой кислоты с органическими диаминами, таких как N,N"-диизопропилэтилендиаммония диклавуланат, в качестве полезных промежуточных соединений для выделения и получения чистой клавулановой кислоты или ее солей щелочных металлов, таких как клавуланат калия, из этилацетатного экстракта, полученного после экстракции растворителем полученного водного культурального бульона, образовавшегося после культивирования, в котором присутствует клавулановая кислота.

Задачей настоящего изобретения является улучшение способа выделения клавулановой кислоты из культурального бульона, полученного с помощью микроорганизмов, продуцирующих клавулановую кислоту, таких как Streptomyces sp. P 6621 FERM P 2804, в котором отсутствуют требующие значительных затрат времени традиционные процессы удаления мицелия, белков и других суспендированных твердых частиц, присутствующих в водном культуральном бульоне, с последующим получением солей высокой чистоты, таких как клавуланат калия.

Подходящими солями согласно настоящему изобретению являются фармацевтически приемлемые соли щелочных и щелочноземельных металлов, такие как соли натрия, калия, кальция и магния. Среди этих солей предпочтительными являются соли натрия и калия, особенно калия.

Настоящее изобретение в основном может быть использовано для очистки культуральных бульонов, полученных с помощью микроорганизмов, продуцирующих клавулановую кислоту.

Из уровня техники известны лишь способы, которые включают в себя требующие значительных затрат времени методы выделения, исключение составляет один известный улучшенный способ [6], в котором получают совершенно прозрачный бульон. Однако недостатком этого способа является то, что для достижения указанной цели необходимо использовать несколько реагентов, таких как неорганические электролиты, коагулянты, органические полиэлектролиты, и флоккуляция, седиментация или фильтрация культурального бульона требует относительно долгого времени осуществления, что влияет на чистоту желаемого продукта.

Несколько возможностей очистки культурального бульона даны на стр.2, колонка 2, строки 22-35 [6], эти методы должны приводить к значительному снижению выхода клавулановой кислоты. Далее установлено, что использование нескольких сложных методик в способе выделения и очистки, таких как ультрафильтрация и обратный осмос не упрощают способ, так как использование этих процессов требует предварительной фильтрации на активированном угле или ионобменной смоле.

Вопреки этим утверждениям неожиданно было обнаружено, что возможно избежать использования нескольких реагентов, которые использованы в известном [6] способе, а также других требующих значительных затрат времени путей очистки водного культурального бульона, известных из литературы, для чего согласно настоящему изобретению используют метод микрофильтрации, благодаря которому удаляется мицелий, большая часть белков (по меньшей мере 80% присутствующих в бульоне) и других суспендированных частиц.

Для этой цели используют многоступенчатое устройство для непрерывной микрофильтрации, что делает возможным осуществлять способ отделения мицелия и водного фильтрата за время задержки менее чем полчаса, причем устройство состоит из нескольких (пяти) последовательно соединенных независимых сегментов (фильтрационных петель). Каждый сегмент имеет собственный циркуляционный насос, который позволяет культуральному бульону с желаемой скоростью (5-8 м/с) проходить через каналы керамического фильтрующего элемента, имеющего размер пор 0,05 мкм. Микрофильтрационный процесс имеет место при температуре между около 20 и 40^oС (температура не должна превышать 40^oC), тангенциальные скорости регулируются так, чтобы в твердой фракции оставались молекулы с молекулярным весом более 30000. Таким образом достигается удаление около 80-90% присутствующих белков. Мицелий, отделенный в микрофильтрационном процессе, также промывают водой, чтобы повысить содержание клавулановой кислоты в объединенном фильтрате. Путем такого способа очистки водного культурального бульона микрофильтрацией свыше 95% клавулановой кислоты остается в очищенной водной фазе, что даже превышает результаты флоккуляционного способа [6] и представляет собой еще одно улучшение, даваемое настоящим изобретением.

После микрофильтрации фильтрат может быть очищен путем ультрафильтрации. Целью этой очистки является отделение большей части оставшихся белковых примесей и других сопутствующих примесей, имеющих молекулярный вес больше, чем у клавулановой кислоты. Таким образом нежелательные примеси, которые можно было осадить вслед за экстракцией несмешивающимся с водой органическим растворителем, успешно удаляют, после чего окраска водного фильтрата, полученного после очистки микрофильтрацией, существенно уменьшится и чистота желаемого продукта еще улучшится.

В ультрафильтрационном устройстве используют полимерную мембрану, имеющую высокую степень разрешения, составляющую около 20000 дальтон (между 10000 и 30000 дальтон). Способ осуществляют в непрерывном режиме, так чтобы время задержки являлось на сколько возможно более коротким, причем два ультрафильтрационных устройства соединены последовательно (что повышает селективность отделения примесей и клавулановой кислоты); потери клавулановой кислоты в водной фазе уменьшаются до менее чем 5% путем добавления чистой воды для промывки, а также путем удаления удерживающей среды (водной фазы), полученной в процессе ультрафильтрации, противотоком.

Объединенные водные фильтраты затем концентрируют в устройстве для обратного осмоса при температуре, приблизительно равной комнатной, до около 1/5 первоначального объема с получением концентрированной водной фазы неочищенной клавулановой кислоты и затем полученный концентрат (удерживающую среду) прямо экстрагируют при температуре между 15 и 25^oС (экстракцию можно также проводить при температуре ниже 15^oС) несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как этилацетат, в кислотной среде при рН среды в пределах от 1 до 3, который подводят путем добавления неорганической кислоты, такой как серная кислота. Кроме этилацетата также можно использовать другие несмешивающиеся с водой органические растворители, такие как метилацетат, метилизобутилкетон или n-бутиловый спирт.

Так как микрофильтрационный процесс позволил удалить мицелий и основную часть присутствующих белков, прямая экстракция очищенного и сконцентрированного водного культурального бульона подходящим несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как этилацетат, возможна и без использования требующих значительных затрат времени процессов очистки, которые применяются в известных способах, и удается избежать использования дополнительных реагентов, которые применяют в способе коагуляции-флоккуляции, для очистки культурального бульона. Таким образом, дополнительно к вышеуказанному улучшению способ по изобретению также обеспечивает снижение затрат на очистку бульона. Чтобы избежать денатурации оставшихся белков в концентрате водной фазы из-за взаимодействия с органическим растворителем или соляной кислотой в процессе экстракции неочищенной клавулановой кислоты из водной фазы в органическую фазу, лучше всего проводить экстракцию в серии центробежных экстракционных аппаратов, когда в одном из них, а именно в самоопорожняющемся центробежном сепараторе, одновременно и в непрерывном процессе удаляются отделенные белки.

В полученном экстракте неочищенной соляной кислоты в несмешивающемся с водой органическом растворителе могут также присутствовать растворимые в воде примеси, такие как разные продукты разложения клавулановой кислоты, которые являются более полярными, чем сама клавулановая кислота, поэтому водорастворимые примеси удаляют путем промывания объединенной органической фазы водой. Таким образом получают очищенный экстракт клавулановой кислоты в органической фазе, такой как этилацетатный экстракт.

Клавулановую кислоту можно выделить из органической фазы и очистить известным способом [8]. Лучшим способом выделения клавулановой кислоты согласно [8] является взаимодействие этилацетатного экстракта клавулановой кислоты с N,N"-диизопропилэтилендиамином при температуре, приблизительно равной комнатной, и последующее превращение полученного промежуточного диклавуланата N,N"-диизопропилэтилендиаммония 2-этилгексаноатом калия в водном растворе изопропанола при комнатной температуре с получением клавуланата калия, который выделяют в очень чистом виде.

Авторами настоящего изобретения было обнаружено, что получение промежуточного диклавуланата N,N"-диизопропилэтилендиаммония лучше всего осуществлять таким образом, чтобы в реакции между несмешивающейся с водой органической фазой, такой как этилацетатный экстракт клавулановой кислоты, и N,N"-диизопропилэтилендиамином использовать органическую фазу, из которой полностью удалена вода, так как даже небольшое количество воды может препятствовать получению промежуточной соли, из-за того, что выделенная соль растворится в присутствующей в органической фазе воде и могут быть получены побочные продукты, которые затруднят высушивание.

Если вода полностью удалена из органической фазы, стабильность органической фазы или экстракта возрастет, так как хорошо известно, что стабильность клавулановой кислоты в водных растворах и в среде с кислым pН в процессе экстракции очень мала. Поэтому для высушивании органической фазы, такой как этилацетатный экстракт клавулановой кислоты, использовали высушивание в ректификационной колонке (по принципу фракционной дистилляции) в вакууме из-за невысокой стабильности промежуточной соли при высоких температурах. Существенной чертой данного способа является то, что органическая фаза, такая как этилацетат, и вода образуют азеотроп, имеющий меньшую температуру кипения, и таким образом органическая фаза, такая как этилацетатный экстракт оказывается таким образом полностью высушенной. Таким образом органический фаза, такая как этилацетатные экстракты, всегда содержит воду в количестве менее 0,1 объемного %, в среднем от 0,03 до 0,05 объемных %. Затем полностью обезвоженная органическая фаза, такая как этилацетатный экстракт клавулановой кислоты, за очень короткое время задержки концентрируется путем выпаривания до 1/20 первоначального объема для последующего взаимодействия с N,N"-диизопропилэтилендиамином.

Последующая реакция диклавуланата N,N"-диизопропилэтилендиаммония и 2-этилгексаноатом калия для получения клавуланата калия высокой степени чистоты может быть осуществлена известным способом [8] и лучше всего так, как описано в Примерах и проиллюстрировано описанными улучшениями.

Изобретение иллюстрируется далее Примерами, не имеющими ограничительного характера.

Пример 1

Непрерывный процесс получения концентрированного этилацетатного экстракта, содержащего неочищенную клавулановую кислоту.

Водный культуральный бульон (10000 л), полученный путем культивирования микроорганизма Streptomyces sp. P6621 FERM P 2804 (концентрация клавулановой кислоты до 3580 мг/л) добавляют к 33%-ному водному раствору (5 л) серной кислоты в сосуде емкостью 50 м³ при перемешивании и охлаждении, так что величина рН среды поддерживается между 5,8 и 6,2. Затем бульон непрерывно со скоростью потока 1200 л/ч подают на микрофильтрационное устройство, состоящее из 5 последовательно соединенных сегментов. Каждый сегмент имеет свой собственный циркуляционный насос для обеспечения скорости прохождения культурального бульона через каналы керамических фильтрующих элементов с размером пор 0,05 мкм на уровне 8 м/с. Путем микрофильтрационного процесса, при условии, что температура не превышает 40^oС, удаляется мицелий и основная част белков и других суспендированных твердых частиц.

Отделенные твердые вещества промывают водой со скоростью потока 300 л/ч и затем объединенный фильтрат (проникшая среда) после микрофильтрации непрерывно со скоростью потока 1500 л/ч подают в устройство для обратного осмоса, где эта проникшая среда концентрируется до 1/5 первоначального объема.

К концентрату (удерживающая среда), полученному после обратного осмоса со скоростью потока 300 л/ч, добавляют 33%-ный водный раствор (4 л/ч) серной кислоты, так что величина рН среды поддерживается между 1,5 и 2,0, затем со скоростью потока 900 л/ч добавляют этилацетат для экстракции кислой удерживающей среды при комнатной температуре в противотоке в серии из пяти центробежных экстракционных аппаратов, причем во втором самоопорожняющемся - центробежном сепараторе одновременно удаляются оставшиеся до сих пор белки.

Объединенный этилацетатный экстракт из серии центробежных экстракционных аппаратов промывают в первом центробежном экстракционном аппарате деминерализованной водой со скоростью потока 30 л/ч и таким образом удаляют оставшиеся до сих пор водорастворимые примеси.

Этилацетатный экстракт при скорости потока 900 л/ч высушивают в вакууме при температуре 30^oС в ректификационной колонке, так что достигается содержание воды 0,03 объемных %, затем экстракт выпаривают в тонкослойном испарителе в вакууме при температуре 30^oС до 1/20 первоначального объема. Полученный концентрированный этилацетатный экстракт (концентрация неочищенной клавулановой кислоты до 50 г/л) при скорости потока 45 л/ч обесцвечивают непрерывным добавлением активированного угля (0,45 кг), смесь перемешивают 30 мин и затем отфильтровывают уголь из суспензии концентрированного этилацетатного экстракта на напорном фильтре при давлении азота 1 бар с получением сухого концентрата (45 л) этилацетатного экстракта, содержащего неочищенную клавулановую кислоту.

Пример 2

Получение диклавуланата N,N"-диизопропилэтилендиаммония

К сухому концентрату (45 л) этилацетатного экстракта, полученного в непрерывном процессе в Примере 1 (содержание клавулановой кислоты до 50 г/л), в течение 5 мин при тщательном перемешивании при температуре 25^oС добавляют N, N"-диизопропилэтилендиамин (1,4 л). Полученную суспензию отфильтровывают, полученные кристаллы ресуспендируют в ацетоне (45 л) и при перемешивании и охлаждении суспензии до температуры ниже 10^oС отделяют кристаллы желаемой субстанции, их отфильтровывают, промывают ацетоном и высушивают в вакууме при температуре 30^oС. Получают кристаллы диклавуланата N,N"-диизопропилэтилендиаммония (3,3 кг; содержание клавулановой кислоты до 60%).

Пример 3

Получение клавуланата калия

Диклавуланат N,N"-диизопропилэтилендиаммония (3,3 кг) из Примера 2 растворяют в смеси изопропанол/вода (82,5 л; доля воды до 1,5%) и к полученному раствору в течение 30 мин при перемешивании при комнатной температуре добавляют активированный уголь (1,5 кг) и 2-этилгексаноат калия (0,5 л; 2 М). Затем уголь и полученный осадок отфильтровывают. К полученному фильтрату (80 л) в течение 20 мин при перемешивании при комнатной температуре добавляют раствор (6 л) 2-этилгексаноата калия (2 М) в изопропаноле. Полученную суспензию затем перемешивают при охлаждении до температуры между 0 и 5^oС еще 2 ч, затем отделенные кристаллы отфильтровывают, промывают изопропанолом и ацетоном и высушивают в вакууме при температуре 30^oС. Получают клавуланат калия (2 кг; USP чистота, содержание клавулановой кислоты 80,6 %, определенное ЖХВД).

Источники информации

1. GB 1508977.

2. GB 1543563.

3. ЕР-А-0026044.

4. BE 862211.

5. ЕР-В-0182522.

6. ЕР-А-0385552.

7. ЕР-А-0387178.

8. ЕР-А-0562583.