способ получения берберина в иммобилизованной клеточной культуре василистника малого

Формула изобретения

Способ получения берберина в иммобилизованной клеточной культуре василистника малого, включающий приготовление ростовой питательной среды по Мурасиге-Скугу, культивирование, иммобилизацию с последующим переносом на продукционную среду по Мурасиге-Скугу, отличающийся тем, что иммобилизацию суспензионной культуры проводят на кубиках пенополиуретана с последующим отмыванием кубиков от свободно суспендированных клеток на безгормональной среде в течение суток, при этом ростовая и продукционная питательные среды дополнительно содержат, мг/л:

Ростовая питательная среда - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота - 0,1 - 1

Продукционная питательная среда - 6-бензиламинопурин - 0,5 - 1

Пиридоксин солянокислый в обеих средах - 3 - 7

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению берберина в иммобилизованной клеточной культуре василистника малого (Thalictrum minus L.).

Объектом исследования служила культура ткани василистника малого. Культура клеток Thalictrum minus - одна из немногих культур, выделяющих вторичные продукты во внешнюю среду. Это делает ее привлекательным объектом для разработки технологии непрерывного культивирования с использованием иммобилизации клеток на инертном носителе. Существование среди рода Thalictrum таких сверхпродуктивных культур, как Thalictrum rugosum (синтезирует в 10 раз больше берберина, чем интактное растение), свидетельствует о перспективности биотехнологического подхода к растениям этого рода.

Авторами впервые изучены условия и разработан способ получения берберина в иммобилизованной на кубики пенополиуретана клеточной культуре василистника малого.

Известен способ получения берберина в суспензионной культуре Thalictrum rugosum. [Choi Jeong-Woo ЮЯ Korean J.Chem.Eng. - 1992 - 9 N 3. c 128-134].

Недостатком способа является то, что берберин накапливается в биомассе, а не выделяется в среду, что делает невозможным многократное использование биомассы.

Наиболее близким является способ получения берберина в клеточной культуре василистника малого, иммобилизованной на Ca-альгинатные шарики. [Kobayashi Y., Fucui H., Tabata M. Effect of oxigen supply on berberine production in cells of Thalictrum minus. // Plant cell repts 1989.vol. 8, N 4 - P 255-258].

Суспензионную культуру выращивают в колбах на качалке на среде для роста, содержащей 0,2 мг/л 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, с минеральной основой по Мурасиге-Скугу (МС). На 14 сутки культивирования осуществляют иммобилизацию на Ca-альгинатные шарики и переносят на продукционную среду, содержащую a-нафтилуксусную кислоту в концентрации 100 мкм (18 мг/л) и 6-бензиламинопурин в концентрации 10 мкм (5 мг/л). Выход берберина в культуральной жидкости составляет от 0,3 г/л до 0,51 г/л в зависимости от размера Ca-альгинатных шариков.

Недостатком способа является низкий выход берберина. При этом авторы указывают на высокую кислородную зависимость процесса синтеза. При иммобилизации в Ca-альгинат клетки испытывают дефицит кислорода. С уменьшением размера шариков увеличивается выход берберина.

Изобретение решает задачу повышения выхода берберина в иммобилизованной на пенополиуретан клеточной биомассе. Благодаря иммобилизации в пористый матрикс улучшаются условия аэрации клеток. Модифицированный гормональный и витаминный состав среды также повышает интенсивность процессов синтеза.

Технический результат - высокий выход берберина и возможность многократного использования дорогостоящей биомассы.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе получения берберина иммобилизованной клеточной культуре василистника малого путем приготовления ростовой питательной среды по Мурасиге-Скугу, культивирование, иммобилизацию с последующим переносом на продукционную среду по Мурасиге-Скугу, согласно изобретению иммобилизацию суспензионной культуры проводят на кубиках пенополиуретана с последующим отмыванием кубиков от свободно суспендированных клеток на безгормональной среде в течение суток, при этом ростовая и продукционная питательные среды дополнительно содержат: ростовая питательная среда - 2,4- дихлорфенокси-уксусную кислоту в количестве 0,1-1 мг/л, продукционная питательная среда - 6-бензиламинопурин в количестве 0,5-1 мг/л, а содержание пиридоксина солянокислого в обеих средах 3-7 мг/л.

При получении берберина осуществляется двухстадийное культивирование иммобилизованной на пенополиуретан биомассы со сменой сред, содержащих гормоны и витамины в нашей модификации. При использовании данных условий обеспечивается высокая скорость роста на первом этапе культивирования и высокий уровень синтеза на втором этапе, что повышает продуктивность культуры.

Способ осуществляется следующим образом. Суспензионную культуру василистника малого помещают на питательную среду с минеральной основой по МС, содержащую 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (0,1-1 мг/л), сахарозу (30000 мг/л), гидролизат казеина (150-250мг/л), инозит (100-500мг/л), тиамин солянокислый (0,5-1,5мг/л), пиридоксин солянокислый (3-7мг/л), ниацин солянокислый (0,5- 1,5мг/л). Стерилизацию среды проводят при 9,8110⁴ Па в течение 20 мин. Культивирование происходит на рассеянном свету. Одновременно с инокуляцией в культуральный сосуд помещаются кубики пенополиуретана размерами 1мм³ из расчета 150-300 кубиков на литр среды.

После 14 суток культивирования на ростовой среде кубики с клетками отмывали на среде без гормонов и сахарозы в течение суток на качалке, а затем помещали их в продукционную среду с минеральной основой по МС, содержащую а-нафтилуксусную кислоту (10-20мг/л), 6-бензиламинопурин (0,5-1мг/л), сахарозу (30000мг/л), гидролизат казеина (150-250мг/л), инозит (100- 500мг/л), тиамин солянокислый (0,5- 1,5мг/л), пиридоксин солянокислый (3-7мг/л), ниацин солянокислый (0,5-1,5мг/л). Стерилизацию среды проводят при 9,8110⁴ Па в течение 20 мин. Выделение берберина происходит в культуральную среду.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиски по патентам и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах заявленного изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными всем существенным признакам заявленного изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату, отличительных признаков в заявленном способе, изложенных в формуле изобретения.

Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "новизна".

Для проверки соответствия заявленного изобретения условию "изобретательский уровень" заявитель провел дополнительный поиск известных решений, чтобы выявить признаки, совпадающие с отличительными от прототипа признаками заявленного способа. Результаты показали, что заявленное изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, поскольку из уровня техники, определенного заявителем, не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками заявленного изобретения преобразований для достижения технического результата.

Это позволяет сделать вывод о соответствии условию "изобретательский уровень".

Пример 1.

Для первого этапа культивирования приготавливают среду состава:

Макроэлементы: - мг/л

KNO₃ - 1900

NH₄NO₃ - 1650

CaCl₂2H₂O - 330

MgSO₂7H₂O - 370

KH₂PO₄ - 170

Микроэлементы: - мг/л

MnSO₄4H₂O - 22300

ZnSO₄7H₂O - 8600

H₃BO₃ - 6200

KI - 830

CuSO₄5H₂O - 25

Na₂MoO₄2H₂O - 250

CoCl₂6H₂O - 25

FeSO₄7H₂O - 27850

Na2EDTA2H₂O (этилендиаминтетрауксусная кислота - 37250

Витамины: - мг/л

Инозит - 100

Тиамин C1 - 0,5

Пиридоксин C1 - 3

Ниацин C1 - 0,5

Гормоны: - мг/л

2,4-Дихлорфеноксиуксусная кислота - 0,1

Углеводы: - мг/л

Сахароза - 30 000

Аминокислотный компонент: - мг/л

Гидролизат казеина - 150

Культуру ткани василистника малого помещают на питательную среду для роста. Стерилизацию среды проводят при 9,8110⁴ Па в течение 20 мин. Культивирование происходит на рассеянном свете. Одновременно с инокуляцией в культуральный сосуд помещаются кубики пенополиуретана размерами 1мм² из расчета 150 кубиков на литр среды.

После 14 суток культивирования кубики с клетками переносят на среду с минеральной основой по Мурасиге-Скугу без гормонов и сахарозы. В течение суток кубики отмывают на качалке от непрочно иммобилизованных клеток. Затем кубики переносят на продукционную среду следующего состава:

Макроэлементы: - мг/л

KMO₃ - 1900

NH₄NO₃ - 1650

CaCl₂2H₂0 - 330

MgS0₄7H₂0 - 370

KH₂P0₄ - 170

Микроэлементы: - мг/л

MnS0₄4Н₂0 - 22300

ZnS0₄7H₂0 - 8600

H₃ВО₃ - 6200

KI - 830

CuS0₄5Н₂0 - 25

Na₂MoO₄2H₂0 - 250

CoCl₂6H₂O - 25

FeS0₄7Н₂0 - 27850

Na2EDTA2Н₂0 - 37250

Витамины: - мг/л

Инозит - 100

Тиамин C1 - 0,5

Пиридоксин C1 - 3

Ниацин C1 - 0,5

Гормоны: - мг/л

-Нафтилуксусная кислота - 10

6-Бензиламинопурин - 0,5

Углеводы: - мг/л

Сахароза - 30000

Аминокислотный компонент: - мг/л

Гидролизат казеина - 150

Культивирование на второй стадии проводится 14 сут. При этом берберин выделяется в среду, окрашивая ее в ярко-желтый цвет. Выход берберина составляет 0,58 г/л.

Пример 2. Аналогично примеру 1 питательная среда содержит:

Макроэлементы: - мг/л

KNO₃ - 1900

NH₄NO₃ - 1650

CaCl₂2Н₂0 - 330

MgS0₄7Н₂0 - 370

KH₂P0₄ - 170

Микроэлементы: - мг/л

MnSO₄4H₂O - 22300

ZnSO₄7H₂O - 8600

H₃BO₃ - 6200

К1 - 830

CuSO₄5Н₂O - 25

Na₂MoO₄2Н₂O - 250

CoCl₂6H₂O - 25

FeSO₄7H₂O - 27850

Na2EDTA2H₂O - 37250

Витамины: - мг/л

Инозит - 200

Тиамин C1 - 1

Пиридоксин C1 - 5

Ниацин C1 - 1

Гормоны: - мг/л

2,4-Д - 0,5

Углеводы: - мг/л

Сахароза - 30000

Аминокислотный компонент: - мг/л

Гидролизат казеина - 200

Культуру ткани василистника малого помещают на питательную среду для роста. Cтерилизацию среды проводят при 9,8110⁴ Па в течение 20 мин. Культивирование происходит на рассеянном свету. Одновременно с инокуляцией в культуральный сосуд помещаются кубики пенополиуретана размерами 1 мм³ из расчета 200 кубиков на литр среды.

После 14 суток культивирования кубики с клетками переносят на среду с минеральной основой по Мурасиге-Скугу без гормонов и сахарозы. В течение суток кубики отмывают на качалке от непрочно иммобилизованных клеток. Затем кубики переносят на продукционную среду следующего состава:

Макроэлементы: - мг/л

KNO₃ - 1900

NH₄NO₃ - 1650

CaCl₂2H₂O - 330

MgSO₄7Н₂O - 370

KH₂PO₄ - 170

Микроэлементы: - мг/л

MnSO₄4Н₂O - 22300

ZnSO₄7Н₂O - 8600

H₃ВО₃ - 6200

KI - 830

CuSO₄5Н₂O - 25

Na₂MoO₄2Н₂О - 250

CoCl₂6H₂O - 25

FeSO₄7H₂O - 27850

Na2EDTA2H₂O - 37250

Витамины: - мг/л

Инозит - 250

Тиамин C1 - 1

Пиридоксин C1 - 5

Ниацин C1 - 1

Гормоны: - мг/л

-Нафтилуксусная кислота - 15

6-Бензиламинопурин - 1

Углеводы: - мг/л

Сахароза - 30000

Аминокислотный компонент: - мг/л

Гидролизат казеина - 200

Культивирование на второй стадии проводится 14 суток. При этом берберин выделяется в среду, окрашивая ее в ярко-желтый цвет. Выход берберина составляет 0, 75 г/л.

Пример 3.

Питательная среда для первой стадии культивирования содержит:

Макроэлементы: - мг/л

KNO₃ - 1900

NH₄NO₃ - 1650

CaCl₂2H₂O - 330

MgSO₄7Н₂O - 370

KH₂PO₄ - 170

Микроэлементы: - мг/л

MnS0₄4Н₂O - 22300

ZnSO₄7H₂O - 8600

H₃ВО₃ - 6200

KI - 830

CuSO₄5Н₂O - 25

Na₂MoO₄2Н₂O - 250

CoCl₂6Н₂O - 25

FeSO₄7H₂O - 27850

Na2EDTA2Н₂O - 37250

Витамины: - мг/л

Инозит - 500

Тиамин C1 - 1,5

Пиридоксин C1 - 7

Ниацин C1 - 1,5

Гормоны: - мг/л

2,4-Д - 1

Углеводы: - мг/л

Сахароза - 30 000

Аминокислотный компонент: - мг/л

Гидролизат казеина - 250

Культуру ткани василистника малого помещают на питательную среду для роста. Стерилизацию среды проводят при 9,8110⁴ Па в течение 20 мин. Культивирование происходит на рассеянном свету. Одновременно с инокуляцией в культуральный сосуд помещаются кубики пенополиуретана размерами 1мм³ из расчета 300 кубиков на литр среды.

После 14 суток культивирования кубики с клетками переносят на среду с минеральной основой по Мурасиге-Скугу без гормонов и сахарозы. В течение суток кубики отмывают на качалке от непрочно иммобилизованных клеток. Затем кубики переносят на продукционную среду следующего состава:

Макроэлементы: - мг/л

KNO₃ - 1900

NH₄NO₃ - 1650

CaCl₂2H₂O - 330

MgS0₄7H₂O - 370

KH₂PO₄ - 170

Микроэлементы: - мг/л

MnSO₄4H₂O - 22300

ZnSO₄7Н₂O - 8600

H₃BO₃ - 6200

KI - 830

CuSO₄5Н₂О - 25

Na₂MoO₄2H₂O - 250

COCl₂6H₂O - 25

FeSO₄7Н₂O - 27850

Na2EDTA2H₂O - 37250

Витамины: - мг/л

Инозит - 500

Тиамин C1 - 1,5

Пиридоксин C1 - 7

Ниацин C1 - 1,5

Гормоны: - мг/л

-Нафтилуксусная кислота - 20

6-Бензиламинопурин - 1,5

Углеводы: - мг/л

Сахароза - 30000

Аминокислотный компонент: - мг/л

Гидролизат казеина - 250

Культивирование на второй стадии проводится 14 суток. При этом берберин выделяется в среду, окрашивая ее в ярко-желтый цвет. Выход берберина составляет 0,61 г/л.

При значении параметров меньше или больше приведенных концентраций гормонов и витаминов снижается выход берберина. Содержание берберина в среде культивирования определялось спектрофотометрическим экспресс-методом.

Для заявленного способа в том виде, как он охарактеризован в независимом пункте изложенной формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств. Следовательно, заявленное изобретение соответствует условию "промышленная применимость".